多功能显微镜的使用

1、第一节第一节 生物制片技术生物制片技术一、昆虫生物制片方法一、昆虫生物制片方法按封固剂的使用分：按封固剂的使用分：1 1、暂时封片法、暂时封片法 不使用封固剂不使用封固剂2 2、永久制片法、永久制片法 用封固剂封片用封固剂封片生物制片技术生物制片技术多功能显微镜的使用多功能显微镜的使用按材料处理方法分：按材料处理方法分：1 1、整体封片法：、整体封片法： 将微小的昆虫或昆虫的部分器官整体封片。将微小的昆虫或昆虫的部分器官整体封片。2 2、涂抹制片法、涂抹制片法 昆虫的疏松组织直接涂抹在载波片。昆虫的疏松组织直接涂抹在载波片。3 3、压碎制片法、压碎制片法 将松软的组织在载玻片上，用盖玻片压碎展

2、平将松软的组织在载玻片上，用盖玻片压碎展平的一种方法的一种方法4 4、离散制片法、离散制片法 借助药物将组织结合物溶解、分离的制片方法借助药物将组织结合物溶解、分离的制片方法。5 5、组织切片法、组织切片法 观察昆虫组织器官结构形态的制片方法。观察昆虫组织器官结构形态的制片方法。分为：分为：石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、超薄切片法。石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、超薄切片法。二、石蜡切片二、石蜡切片把材料包埋在石蜡中，连同石蜡一起切片把材料包埋在石蜡中，连同石蜡一起切片主要过程：主要过程：取材取材固定固定洗涤洗涤脱水脱水透明透明浸蜡浸蜡包埋包埋切片切片贴片贴片脱蜡脱蜡复水复水染色

3、染色脱水脱水透明透明封固封固第二节第二节 多功能显微镜的使用多功能显微镜的使用一、显微镜的类型一、显微镜的类型显微镜显微镜非光学显微镜非光学显微镜光学显微镜光学显微镜普通显微镜普通显微镜特种显微镜特种显微镜多功能显微镜多功能显微镜实体显微镜实体显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜偏光显微镜偏光显微镜紫外光显微镜紫外光显微镜倒置显微镜倒置显微镜二、显微镜的光学技术参数二、显微镜的光学技术参数1 1、数值孔径（、数值孔径（NA numerical apertureNA numerical aperture） NA NA sinsin 介质折射率介质折射率 孔径角的

4、一半孔径角的一半 介质折射率，香柏油为介质折射率，香柏油为1.5151.515 孔径角的一半，小于孔径角的一半，小于9090。 干燥系物镜的干燥系物镜的NANA值小于值小于1 1， 油镜的油镜的 NANA值最大为值最大为1.41.42 2、分辨率、分辨率 光学仪器能够区分两个相临物点之间的最小距离。光学仪器能够区分两个相临物点之间的最小距离。 0.61 0.61 0.610.61 d = = d = = sinsin NA NA 光波长光波长 可见光波长可见光波长400400700 700 m m ，平均平均550 550 m m 光学显微镜的分辨率光学显微镜的分辨率d d最小为最小为0.2

5、0.2 m m提高分辨本领的措施：提高分辨本领的措施：（1 1）降低光波长）降低光波长（2 2）增大介质的折光系数）增大介质的折光系数（3 3）增大孔径角）增大孔径角（4 4）增加明暗反差）增加明暗反差 0.61 0.61d =d = sinsin3 3、放大率、放大率总放大率总放大率M M物镜放大率（物镜放大率（MobMob）x x目镜放大率（目镜放大率（MocMoc） 镜筒长度（标准镜筒长镜筒长度（标准镜筒长160160mmmm）MobMob F F1 1 物镜焦距物镜焦距 250 250 明视距离（明视距离（mmmm）MocMoc F F2 2 目镜焦距目镜焦距 250 250 M M

6、x x F F1 1 F F2 2 有效放大倍数有效放大倍数M M有效有效： d d肉眼肉眼 肉眼分辨本领肉眼分辨本领 M M有效有效= = d d仪器仪器 仪器分辨本领仪器分辨本领 人肉眼在人肉眼在250250毫米远处分辨率为毫米远处分辨率为0.20.2mmmm。 光学显微镜的有效放大倍数应为光学显微镜的有效放大倍数应为10001000倍。倍。总放大率经验值：总放大率经验值： 显微镜的最适的总放大率，是标准镜筒长下，显微镜的最适的总放大率，是标准镜筒长下，所使用的物镜所使用的物镜NANA值的值的50050010001000倍。倍。 超出此范围称为超出此范围称为“无效放大无效放大”。4 4、焦

7、深、焦深 K KD=D= M M NANA焦点深度，与总的放大倍率、物镜的数值孔径成反比。焦点深度，与总的放大倍率、物镜的数值孔径成反比。增加标本周围介质的折射率可增加焦深。增加标本周围介质的折射率可增加焦深。5 5、现场直径、现场直径指显微镜下看到的视场内所能容纳被检物体的实指显微镜下看到的视场内所能容纳被检物体的实际范围。际范围。 FN FN 目镜视场数目镜视场数 Mob Mob 物镜放大倍率物镜放大倍率6 6、镜像亮度与视场亮度、镜像亮度与视场亮度（1 1）镜象亮度与物镜数值孔径的平方成正比）镜象亮度与物镜数值孔径的平方成正比（2 2）镜象亮度与总放大率的平方成反比）镜象亮度与总放大率的

8、平方成反比镜像亮度：显微镜下图像的明暗程度镜像亮度：显微镜下图像的明暗程度视场亮度：显微镜下整个视场的明暗程度视场亮度：显微镜下整个视场的明暗程度7 7、复盖差、复盖差 盖玻片厚度不标准产生的相差。盖玻片标准厚度盖玻片厚度不标准产生的相差。盖玻片标准厚度0.170.17mmmm 放大倍率越高、放大倍率越高、NANA越大，复盖差越明显。越大，复盖差越明显。8 8、工作距离、工作距离 物镜前透镜到被检物体之间的距离。物镜前透镜到被检物体之间的距离。 放大倍率越高工作距离越小，放大倍率越高工作距离越小，4040 物镜不超过物镜不超过0.60.6mmmm，100 100 物镜不超过物镜不超过0.2mm

9、0.2mm。三、象差三、象差1 1、色差、色差不同颜色的光通过透镜的折射率不同不同颜色的光通过透镜的折射率不同色差的校正色差的校正: :（1 1）采用单色光作光源）采用单色光作光源（2 2）利用凸、凹透镜的色差彼此相反，将其胶合）利用凸、凹透镜的色差彼此相反，将其胶合在一起消除色差。在一起消除色差。2 2、球差、球差 透镜球面上，轴线上与四周光线折射率不透镜球面上，轴线上与四周光线折射率不同造成。同造成。球差的消除措施：球差的消除措施： 利用凸、凹透镜的球差彼此相反，将其胶合在一利用凸、凹透镜的球差彼此相反，将其胶合在一起消除球差。起消除球差。3 3、场曲、场曲场曲可用特殊透镜和光阑纠正场曲可

10、用特殊透镜和光阑纠正四、显微镜的光学部件四、显微镜的光学部件1 1、物镜、物镜 金属镜筒内由相隔一定距离并固定的透镜组组合而金属镜筒内由相隔一定距离并固定的透镜组组合而成。成。 每一组透镜又由不同材料、不同参数的一至数块透每一组透镜又由不同材料、不同参数的一至数块透镜胶合而成。镜胶合而成。根据物镜前透镜与盖玻片之间的介质不同：根据物镜前透镜与盖玻片之间的介质不同：（1 1）干燥系物镜，）干燥系物镜，4040 x x以下物镜，以下物镜，NANA值均小于值均小于1 1（2 2）水浸系物镜）水浸系物镜（3 3）油浸系物镜，）油浸系物镜，9090100100 x x，NANA值可大于值可大于1 1根据

11、物镜放大率的高低：根据物镜放大率的高低：（1 1）极低倍物镜）极低倍物镜 0.5 0.5x 0.75xx 0.75x（2 2）低倍物镜）低倍物镜 1 1x x 6 6x NA 0.04-0.15x NA 0.04-0.15 （3 3）中倍物镜）中倍物镜 6 6x x 2525x NA 0.15-0.40 x NA 0.15-0.40 （4 4）高倍物镜）高倍物镜 25 25x x 6363x NA 0.35-0.95x NA 0.35-0.95 （5 5）油浸物镜）油浸物镜 90 90 x x 100100 x NA 1.25-1.40 x NA 1.25-1.40 根据物镜性能分类：根据物镜

12、性能分类：（1 1）消色差物镜）消色差物镜 标有标有Ach(Achromatic objective)Ach(Achromatic objective) 消除红蓝色差及部分球差消除红蓝色差及部分球差（2 2）复消色差物镜）复消色差物镜 标有标有APO(ApochromaticAPO(Apochromatic objective) objective) 消除大部分的色差、球差，同一焦点平面上成像消除大部分的色差、球差，同一焦点平面上成像（3 3）半消色差物镜）半消色差物镜 标有标有FLFL 消除色差与球差的能力介于以上二者之间消除色差与球差的能力介于以上二者之间（4 4）平场物镜）平场物镜 标有

13、标有Plan(Plan objective)Plan(Plan objective) 视场平、大，工作距离增加视场平、大，工作距离增加 超平场物镜超平场物镜 标有标有S PlanS Plan（5 5）特种物镜）特种物镜带校正环的物镜带校正环的物镜 校正盖玻片厚度不规则带来的复盖差校正盖玻片厚度不规则带来的复盖差带虹彩光阑物镜带虹彩光阑物镜 调节物镜的数值孔径，改变焦深调节物镜的数值孔径，改变焦深相差物镜相差物镜无荧光物镜无荧光物镜无罩物镜（无罩物镜（No cover objective) No cover objective) 标有标有NCNC，不加盖玻片不加盖玻片长工作距离物镜长工作距离物镜

14、2 2、目镜、目镜2 25 5片透镜分片透镜分2 2组或组或3 3组构成组构成惠更斯目镜惠更斯目镜冉姆斯登目镜冉姆斯登目镜 普通目镜，普通目镜， 2 2片平凸透镜构成片平凸透镜构成凯尔勒目镜凯尔勒目镜补偿目镜补偿目镜 标有标有K K，可消除物镜残留色差可消除物镜残留色差平场物镜平场物镜 标有标有P P，视场平坦视场平坦广视场物镜广视场物镜 标有标有W W，具有较大的视场，视场平坦具有较大的视场，视场平坦3 3、聚光镜、聚光镜由透镜组、孔径光阑构成，类型与物镜匹配由透镜组、孔径光阑构成，类型与物镜匹配4 4、显微镜的照明装置、显微镜的照明装置照明法照明法透射式照明透射式照明中心照明中心照明斜射照

15、明斜射照明临界照明临界照明克勒照明克勒照明落射式照明落射式照明五、显微镜的光轴调节五、显微镜的光轴调节1 1、聚光镜的聚焦、调中、聚光镜的聚焦、调中 调视场光阑（多边形）居视场中心调视场光阑（多边形）居视场中心2 2、视场光阑调到外切、视场光阑调到外切3 3、孔径光阑的调节、孔径光阑的调节 聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相匹配聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相匹配六、相差显微镜的原理与使用六、相差显微镜的原理与使用1 1、原理、原理 通过改变直射光或衍射光的相位，直射光和衍通过改变直射光或衍射光的相位，直射光和衍射光发生干涉后的合成波振幅加强或减弱，因此将射光发生干涉后的合成波振幅加强或减弱，因此将光通过样品时产生的相位差，转变为振幅差，增加光