免疫组织化学染色技术

1、免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术第一节第一节 常规组织学染色技术概述常规组织学染色技术概述 宏观宏观 微观微观 超微结构超微结构 基因水平基因水平 组织形态学研究技术的种类：组织形态学研究技术的种类： 一、病理大体组织标本的染色方法一、病理大体组织标本的染色方法 在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特同的颜色，以便

2、于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：点，如： 脂肪组织染色法脂肪组织染色法 目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色样硬化大体标本的染色 试剂：苏丹试剂：苏丹或苏丹或苏丹 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS (pH 7.6) 方法：将方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 C 孵育孵育2

3、0 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔 组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。小时。 二、光学显微镜下的组织学染色方法二、光学显微镜下的组织学染色方法 常规常规HE染色（染色（hematoxylin and eosin staining） 组织学特殊染色组织学特殊染色 1. Mallory 三染色、三染色、Masson三染色三染色 2. 神经纤维的镀银染色神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素

4、、其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞细胞DNA和和RNA的染色等的染色等 上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。形态改变。三、超微结构的观察三、超微结构的观察 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2 m 有效放大倍数最高不超过有效放大倍数最高不超过2000倍。倍。 电镜的分辨率最佳可达电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达，放大倍率最高可达100万倍。万倍。 第二节第二节 免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术 Immunohistochemi

5、cal technique 该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫免疫细胞化学技术细胞化学技术。 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术 4. 免疫金免疫金-银细胞化学技术银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理一、免疫组织化学染色方法的原理

6、抗原（抗原（antigen） 1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。结合反应的物质。抗原具有两种性能抗原具有两种性能： （1）免疫原性免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。具有诱导机体产生免疫应答的特性。 （2）反应原性反应原性（reactogenicity）指抗原分子与）指抗原分子与抗体或效应抗体或效应 T

7、细胞等免疫应答产物发生特异性反细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。应的特性。2. 抗原的分类抗原的分类 完全抗原、半抗原完全抗原、半抗原免疫学分类免疫学分类 胸腺依赖抗原与非依赖抗原胸腺依赖抗原与非依赖抗原 外源性抗原：微生物、花粉等外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿 瘤相关抗原等瘤相关抗原等临临 床床 分分 类类 同种异型抗原：人类白细胞抗原、同种异型抗原：人类白细胞抗原、 血型抗原血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物异嗜性抗原：人与其他动物、植物 等之间存在的共同抗原等之间存在的共同抗原 抗体（抗体（antibody） 1. 定

8、义：定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。称为抗体。 大部分抗体电泳后位于大部分抗体电泳后位于 区带，区带，1972年国际免年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。 2. 抗体的种类抗体的种类: 五类，即五类，即IgA、Ig

9、D、IgE、IgG、IgM 免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是IgG，个别情况下使用，个别情况下使用IgG的亚型，多为的亚型，多为IgG1。 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理免疫组织化学染色的反应原理及显色原理 1. 免疫组织化学染色的反应原理免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。 通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的

10、部显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗原是否存在。原是否存在。 通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在与否。与否。2. 免疫组织化学染色的显色原理免疫组织化学染色的显色原理 (1) 基本原理基本原理 荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其中以酶标抗体法应用最为广泛。中以酶标抗体法应用最为广泛。 直接法直接法：是将酶直接标记在第一抗体

11、上，用酶标抗体与：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显示出所检测的目的抗原的部位。显示出所检测的目的抗原的部位。 间接法间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。 间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克

12、隆抗体或由小鼠制备的单克隆抗体。制备的单克隆抗体。 第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。可提高免疫组织化学染色的敏感度。 IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。技术中，绝大多数以间接法为常用

13、。（2）显色的基本程序）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）抗（酶标抗体）孵育切片孵育切片 发色剂显色发色剂显色 （核复染）（核复染）（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂）酶标抗体法的显色原理及显色剂 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色

14、剂，可使反应的终产物呈现不同的颜色，如：反应的终产物呈现不同的颜色，如： CN为蓝色为蓝色 TMB为深蓝色为深蓝色 AEC为红色为红色 DAB为棕色为棕色 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以以AS-Mx（色酚（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。红色不容性沉淀物。 ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。染色。 由于组织细胞

15、内含有内源性由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入，在显色液中需加入终浓度为终浓度为2-4mol/L的左旋咪唑的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性，大多数内源性ALP活性可被抑制。活性可被抑制。 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为 -D-葡萄糖葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37C孵育孵育1小时，小时，生

16、成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。可经脱水、透明后封片，长期保存。 （4）核复染）核复染 在显色后，特别是用在显色后，特别是用DAB显色后，显色后，切片可用苏木素染料进行核复染，经水切片可用苏木素染料进行核复染，经水化后细胞核显示蓝色，与胞质中的化后细胞核显示蓝色，与胞质中的DAB棕色形成对比。但用棕色形成对比。但用AEC显色后不能用显色后不能用苏木素做核复染，因为配制苏木素染料苏木素做核复染，因为配制苏木素染料中使用酒精作为介质，可使中使用酒精作为介质，可使AEC的红色的红色终产物褪色，且终产物褪

17、色，且AEC显色后只能用水溶显色后只能用水溶性封固剂封片。性封固剂封片。第三节第三节 免疫组织化学染色步骤免疫组织化学染色步骤（一）（一）ABC或或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤法进行石蜡切片染色的主要步骤 1. 组织材料的采取；组织材料的采取； 2. 组织块的固定；组织块的固定； 3. 组织块的脱水、透明及石蜡包埋；组织块的脱水、透明及石蜡包埋； 4. 石蜡切片的制备；石蜡切片的制备； 5. 石蜡切片的脱蜡及水化；石蜡切片的脱蜡及水化； 6. 抑制内源性过氧化物酶活性；抑制内源性过氧化物酶活性； 7. PBS洗涤切片；洗涤切片； 8. 抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；抗原修复或蛋

18、白酶消化切片，修复或暴露抗原； 9. PBS洗涤切片；洗涤切片；10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时 加入加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；11. 用特异性一抗用特异性一抗(单克隆、多克隆单克隆、多克隆)孵育切片；孵育切片；12. PBS（可加入（可加入Tween 20#，PBST）洗涤切片；）洗涤切片；13. 用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；14. 用用PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；15. 滴加滴加SP试剂或试剂或ABC试剂；试剂；16.

19、PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；17. DAB或或AEC显色；显色；18. 自来水洗涤切片，终止显色；自来水洗涤切片，终止显色；19. 用苏木素做核复染；用苏木素做核复染；20. 切片脱水、透明，树胶封片。切片脱水、透明，树胶封片。（二）各染色步骤的具体操作及注意事项（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1. 组织材料的采取组织材料的采取 活检组织活检组织 组织标本组织标本 手术切除标本手术切除标本 尸检标本尸检标本 实验组织或培养细胞实验组织或培养细胞 活检组织活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织 体积小，因活检钳直接钳取，

20、常受压过度而变性，因此，体积小，因活检钳直接钳取，常受压过度而变性，因此， 活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的活检钳的刃口必须锐利，以免组织受压，活检时应采取主要的病灶区。病灶区。 抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑抗原在组织中的分布不均一，故病灶较大的切除标本应考虑切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。 尸检组织尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同小时以上，组织有不同程度自溶，其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸程度自溶，其抗原

21、或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸检一般多在检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。立即固定，以保存组织结构和抗原。 实验动物标本实验动物标本 新鲜，可按需要取材；很多情况下是在灌流固定后取材，新鲜，可按需要取材；很多情况下是在灌流固定后取材，组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。 取材标本的大小取材标本的大小 尸检组织材料大小以尸检组织材

22、料大小以1cm 1cm 0.2cm 为宜。实验动物为宜。实验动物常用大鼠或小鼠，其脏器体积小，有利于取材。一般标本体常用大鼠或小鼠，其脏器体积小，有利于取材。一般标本体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。 2. 组织块的固定、水洗组织块的固定、水洗（1）固定液：）固定液：种类较多，常用的有以下种类较多，常用的有以下2种：种： 4% 甲醛甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：配制方法： 10 ml 40% 甲醛甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀使用新鲜甲醛

23、，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛多聚甲醛)，还可形成甲酸，影响染色结果。还可形成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶可以用粉笔溶) 4% 多聚甲醛多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：配制方法：40g多聚甲醛多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至，搅拌、加热至60 C，同时滴入，同时滴入1N NaOH 至溶至溶液完全透明。冷却后用液完全透明。冷却后用1N HCl 调调PH 值至值至7.2-7.4，再用，再用0.1mol/L PB将溶液加至将溶液加至1000ml。 固定时间：固定时间：一般

24、根据组织块大小及性质，固定一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。小时。 固定原理：固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。 甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。 不利作用：不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的 抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。（2）水洗）水洗 冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时时 间长短有关。尸检组织和大

25、动物组织一般冲洗间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24 小时，小动物组织冲洗小时，小动物组织冲洗2-10小时。小时。 新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固固 定时间长的标本，冲洗时间也需延长。定时间长的标本，冲洗时间也需延长。 冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎扎 紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端端 接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将将 组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。组织块放入洗涤筐中，放在水

26、盆内冲洗。 对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水水 浸泡即可。浸泡即可。3. 组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋（1）脱水）脱水 脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。用酒精。 酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强，酒精可以与水以任何比例混合，脱水能力强，并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组并可硬化组织。酒精对组织的穿透速度很快，对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩，应从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下

27、从低浓度开始，然后再依次增加其浓度。在常温下或或4 C下进行，以减少抗原的损失。下进行，以减少抗原的损失。 70% 80% 90% 95% 100% 100% （2）透明）透明 为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须经为使石蜡能浸入组织块，组织经脱水后，必须经过一种既能与酒精相溶，又能溶解与石蜡的溶剂。过一种既能与酒精相溶，又能溶解与石蜡的溶剂。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。 透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用透明剂：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用 二甲苯。二甲苯。 一般经过一般经过23次纯二甲苯溶液透明，每次次纯二甲苯溶

28、液透明，每次10 15分钟，同时应根据组织的种类和组织块大小以及分钟，同时应根据组织的种类和组织块大小以及二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。（3）浸蜡）浸蜡 组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡次石蜡浸渍。浸渍。 用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在蜡，在60 C以下浸透。以下浸透。（4）包埋）包埋 浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡浸蜡后的组织块放入包埋盒

29、中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。到入包埋盒，冷却后取出，修块。4. 石蜡切片的制作石蜡切片的制作（1）载玻片涂片的制作）载玻片涂片的制作 防脱片剂：防脱片剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨）、多聚赖氨酸（酸（Poly-L-lysine）、甲醛）、甲醛-甘油明胶。甘油明胶。 APES 涂片的制作涂片的制作 原理原理：APES是一种新型玻片粘附剂，与一般是一种新型玻片粘附剂，与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作用，改变其表面的化学物

30、理特性，使组织切片作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。 具体操作方法具体操作方法： 将载玻片用酸处理后，用将载玻片用酸处理后，用95%酒精浸泡，再用酒精浸泡，再用绸布擦干，清除表面的污渍；绸布擦干，清除表面的污渍； 将干净的载玻片放入丙酮内将干净的载玻片放入丙酮内5min； 将载玻片用镊子夹住浸入将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂（试剂（1ml APES+50ml丙酮）丙酮）1-2次；次； 纯丙酮内洗纯丙酮内洗2次后，次后，37 C过夜，干燥；过夜，干燥； 用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。用铝箔包

31、好，室温下存放，可存放半年。 多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL） 试剂配制：试剂配制：PLL 0.5g + 蒸馏水蒸馏水 100 ml 也可根据提供的方法配制。可于也可根据提供的方法配制。可于4 C或或- 20 C 保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。 涂片前将其稀释涂片前将其稀释10-50倍，均匀涂在处理后干净的倍，均匀涂在处理后干净的载玻载玻 片上，片上，37 C下干燥过夜。下干燥过夜。甲醛甲醛-甘油明胶甘油明胶 试剂：试剂：40%甲醛甲醛 2.5ml，明胶，明胶0.5g，蒸馏水加至，蒸馏水加至100ml。 配制方法：用一部

32、分蒸馏水（约配制方法：用一部分蒸馏水（约80ml）加热溶解明）加热溶解明 胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至 100ml，混匀即可。，混匀即可。 粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。（2）制做切片）制做切片 切片机：旋转式或滑动式切片机。切片机：旋转式或滑动式切片机。 切片厚度：切片厚度：5-7 m。 展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展 开切片（水浴锅上加热平皿）。开切片（水浴锅上加热平皿）。

33、 捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。 切片干燥：切片干燥： 37 C过夜，干燥。过夜，干燥。 5石蜡切片的脱腊及水化石蜡切片的脱腊及水化 脱蜡：脱蜡：将切片放入将切片放入染色筐染色筐中，二甲苯中，二甲苯 、 各各15分钟脱腊，分钟脱腊， 水化：水化：100%酒精酒精、中各中各10分钟、分钟、95% ALC 5分钟、分钟、90% ALC 5分钟、分钟、80% ALC 5分钟、分钟、70% ALC 5分钟，蒸馏水浸洗。分钟，蒸馏水浸洗。6清除内源性过氧化物酶活性清除内源性过氧化物酶活性 由于常规免疫组织化学染色的最后显色是用由于常规免疫组织化学染色的最后显

34、色是用辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和和DAB (3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而组织中常含有内源性过氧化物酶，为防止出现而组织中常含有内源性过氧化物酶，为防止出现假阳性反应和减少背景染色，需要先清除内源性假阳性反应和减少背景染色，需要先清除内源性过氧化物酶活性。过氧化物酶活性。 染染 色色 框框 具体方法：具体方法：将切片置入甲醇将切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中液中2030分钟分钟 试剂：试剂：纯甲醇纯甲醇 99 ml 30%，H2O2 1ml 充分混匀，使最后浓充分混匀，

35、使最后浓 度为度为0.3%，或，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml 30% H2O2 1ml7PBS洗涤切片洗涤切片 经甲醇经甲醇- H2O2或或PBS-H2O2 处理后的切片先用蒸馏水洗处理后的切片先用蒸馏水洗一次一次5min，再用，再用PBS洗洗5min3次。次。 0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配制：的配制： NaH2PO4 2H2O 0.45 g Na2HPO4 12H2O 3.23g NaCl 8.0g 蒸馏水蒸馏水 加至加至1000 ml 为防止抗体与组织发生静电吸附而产生非特异性染色，可在为防止抗体与组织发生静电吸附而产生非特异性染色，可

36、在PBS中加入中加入Tween 20#，制成含，制成含0.1% Tween 20# 的的PBS。Tween 20# 为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。 8抗原修复（抗原修复（antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫组化染色不需要此步骤即可染色，如某些抗原的免疫组化染色不需要此步骤即可染色，如横纹肌中的横纹肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、脑组织中的、脑组织中的S-100蛋白、蛋白、GFAP、血型抗原、血型抗原A、B、H、生长激素、生长激素(growth hormone)、胰岛素、波形蛋白、胰岛素、

37、波形蛋白(vimentin)、降钙素、降钙素(calcitonin)等。但有一部分抗原物质或检测的因子等由于组等。但有一部分抗原物质或检测的因子等由于组织经甲醛固定后，因蛋白质的交联，将抗原封闭或发生变织经甲醛固定后，因蛋白质的交联，将抗原封闭或发生变性，因此需要热修复或蛋白酶消化。性，因此需要热修复或蛋白酶消化。 目前机理清楚，但是以高温、高压对常规固定的石蜡目前机理清楚，但是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复处理经验表明，可以提高抗原抗体阳性切片进行抗原修复处理经验表明，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性，现已广泛用于技术中。尤检测率，同时也会出现假阳性，现已广泛用于

38、技术中。尤其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用后大部分抗体其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用后大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。能用于常规甲醛固定的石蜡切片上。 （1）抗原热修复）抗原热修复 方方 法法 微波中微波中 96 1020 min 直接加热法直接加热法 100 10 min 高压锅高压锅 / 消毒锅消毒锅 120 10 min 其他：水浴锅其他：水浴锅 100 10 min2 及真空加热及真空加热 10 min 等。等。 热修复的介质热修复的介质 0.01 mol/L pH 6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液缓冲液 (pH

39、112) 0.01 mol/L pH 7.0 PBS 2 % 硫酸铝硫酸铝 2 % 硝酸铅硝酸铅 生理盐水生理盐水 蒸馏水蒸馏水 溶液的摩尔浓度对修溶液的摩尔浓度对修复效果无任何影响，而复效果无任何影响，而pH值则影响较大，缓冲值则影响较大，缓冲液以柠檬酸缓冲液和液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液较常用。缓冲液较常用。 温度与修复时间的关系：温度与修复时间的关系： 许多的实验结果表明：温度高修复时间短，如许多的实验结果表明：温度高修复时间短，如Ki-67和和P-gp的检测，利用同一切片，达到相同染色结果需要：的检测，利用同一切片，达到相同染色结果需要： 100 20min； 90 30m

40、in； 80 50min； 70 20h 操作流程操作流程 微波处理：微波处理：将切片插入将切片插入25 片塑料架上，在片塑料架上，在250 ml塑盒内加塑盒内加入入200 ml缓冲液，将微波高档加温缓冲液至缓冲液，将微波高档加温缓冲液至90+，取出后，取出后自然冷却至室温后蒸馏水洗，自然冷却至室温后蒸馏水洗，PBS洗。洗。 水浴锅法：水浴锅法：一种传统的抗原修复方法，首先调节水温达一种传统的抗原修复方法，首先调节水温达 95左右，将切片置入内含左右，将切片置入内含200ml缓冲液的塑料盒或烧杯内，缓冲液的塑料盒或烧杯内，放入水浴锅，温度平衡后开始计算时间放入水浴锅，温度平衡后开始计算时间20

41、 min，取出容器后，取出容器后自然冷却到室温。自然冷却到室温。 压力锅法：压力锅法：不锈钢高压锅内加入一定量的缓冲液，加热锅不锈钢高压锅内加入一定量的缓冲液，加热锅使液体煮沸，将切片加入切片架并置入锅内，盖上锅盖，不使液体煮沸，将切片加入切片架并置入锅内，盖上锅盖，不加阀，开始冒气计时加阀，开始冒气计时50 min，关闭气阀，使之加压，关闭气阀，使之加压10 min。再将压力锅置于流水槽中冲洗再将压力锅置于流水槽中冲洗10 min，冷却后取出切片，冷却后取出切片，PBS洗。洗。 最佳修复方法的选择最佳修复方法的选择 选择最佳的修复方法设计表选择最佳的修复方法设计表 柠檬酸 Buffer pH

42、 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3压力锅120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作对照，不作任何处理 抗原热修复应注意的问题抗原热修复应注意的问题 有些抗体在石蜡或冰冻切片上呈阴性反应，有些抗体在石蜡或冰冻切片上呈阴性反应，但石蜡切片用抗原修复后却能很好显示，对某些应但石蜡切片用抗原修复后却能很好显示，对某些应表达在胞浆或膜上的抗原

43、，经修复后，绝大部分表表达在胞浆或膜上的抗原，经修复后，绝大部分表达在核内。而有些表达在核内的抗原经修复后会出达在核内。而有些表达在核内的抗原经修复后会出现在胞浆内，因此，在使用该方法时一定要小心，现在胞浆内，因此，在使用该方法时一定要小心，对结果的判定也要做出客观的分析，同时在操作过对结果的判定也要做出客观的分析，同时在操作过程中还程中还注意以下问题：注意以下问题： 热处理后应自然冷却切片。热处理后应自然冷却切片。 不能煮干修复液。不能煮干修复液。 不要任何抗原的检测都使用该方法。不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。

44、一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，但对细胞核的一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，但对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。 如果在常用的缓冲（修复）液中无法实现抗原修复，如果在常用的缓冲（修复）液中无法实现抗原修复，得不出好的染色结果，或经修复后，抗原定位发生改变，得不出好的染色结果，或经修复后，抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液或加一些鳌合剂，如可改用一些不常用的缓冲液或加一些鳌合剂，如EDTA或或EGTA等可能取得较好的效果。等可能取得较好的效果。 （2）蛋白酶消化法）蛋白酶消化法 原原 理：理：蛋白酶消化可以去除覆盖在抗原决定簇蛋

45、白酶消化可以去除覆盖在抗原决定簇表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起表面的杂蛋白，更为重要的是因甲醛固定而引起的交联被酶消化打开而引起暴露抗原决定簇的作的交联被酶消化打开而引起暴露抗原决定簇的作用，使第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检用，使第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。测率。 注意事项：注意事项：用于用于IHC切片消化的酶有多种，所选切片消化的酶有多种，所选择酶的种类、使用的浓度、择酶的种类、使用的浓度、pH值、消化时间及温值、消化时间及温度等均要视组织固定的不同、所检测抗原的性质、度等均要视组织固定的不同、所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，通过预实验确定。组织类型的不

46、同而异，通过预实验确定。 常用的消化酶类：常用的消化酶类： 胰蛋白酶胰蛋白酶和和蛋白酶蛋白酶K：检测细胞内抗原切片的：检测细胞内抗原切片的消化，如消化，如 Keratin、CEA、GFAP等。等。 胃蛋白酶胃蛋白酶：细胞间质抗原检测切片的消化，如：细胞间质抗原检测切片的消化，如纤连蛋白纤连蛋白 (fibronectin)，各型胶原等。，各型胶原等。 消化时间及温度：消化时间及温度：一般消化时间与组织固定的一般消化时间与组织固定的长短呈正比。蛋白酶的消化时间长短呈正比。蛋白酶的消化时间51020min，视切片固定时间的长短而定。视切片固定时间的长短而定。（3）酶消化液的配制）酶消化液的配制 除了

47、商业销售的成品，可按说明书使用外，还除了商业销售的成品，可按说明书使用外，还可自行配制。可自行配制。 0.1% 胰蛋白酶胰蛋白酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 0.1g 0.1% 氯化钙氯化钙 (pH 7.8) 100 ml 配制方法：配制方法：先配制先配制0.1%的的CaCl2，用，用0.1mol/L 的的NaOH将其将其pH调至调至7.8，然后加入胰蛋白酶，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前将胰蛋白酶液过滤，并在水浴中预溶解之。用前将胰蛋白酶液过滤，并在水浴中预热至热至37，室温下消化时间，室温下消化时间530min，多用于细胞，多用于细胞内抗原的暴露。内抗原的暴露。 0.4 % 胃蛋白酶胃蛋白酶

48、 胃蛋白酶胃蛋白酶 400 mg 0.1N HCl 100 ml 多用于间质组织免疫组化染色切片的消化，多用于间质组织免疫组化染色切片的消化， 37下消化下消化时间约时间约30 min。 0.06 % 蛋白酶蛋白酶K 蛋白酶蛋白酶K 0.06 g 0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml 用法同上。用法同上。 在免疫组化染色中，有时经过度固定的标本，影响一抗在免疫组化染色中，有时经过度固定的标本，影响一抗与抗原的结合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作与抗原的结合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异。总之，在保持组织形态用。消化时

49、间应根据不同组织而异。总之，在保持组织形态不破坏的前提下，宜尽量消化时间延长。以上三种酶消化液，不破坏的前提下，宜尽量消化时间延长。以上三种酶消化液，以第一种最为常用。以第一种最为常用。 9. 经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。10. 用与制备二抗相同的动物非免疫血清孵育切片防止一抗的用与制备二抗相同的动物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特异性吸附。非特异性吸附。 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景非特异性背景染色染色。 最常见的原因是蛋白最常见的原因是蛋白 (第一抗体第一抗体

50、) 吸附于高电荷的胶原和吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。结缔组织成分上。 最有效的方法是在用第一抗体孵育切片前，用与制备第二最有效的方法是在用第一抗体孵育切片前，用与制备第二抗体相同动物的非免疫血清封闭组织上带电荷基团，而除抗体相同动物的非免疫血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合去与第一抗体的非特异性结合 (在室温下进行在室温下进行)。 非免疫血清的稀释度非免疫血清的稀释度1:51:20，还可加入，还可加入BSA (bovine serum albumin) 使稀释后的非免疫血清中含使稀释后的非免疫血清中含0.16%的的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特异性背景染色

51、。，可取得更佳的染色效果，阻止非特异性背景染色。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。 11用特异性一抗孵育切片用特异性一抗孵育切片 研究组织细胞中的某种抗原是否存在，应用免疫组化染研究组织细胞中的某种抗原是否存在，应用免疫组化染色，就要选用针对这种抗原的特异性抗体。现在国际上有许色，就要选用针对这种抗原的特异性抗体。现在国际上有许多公司生产免疫组化试剂，包括一抗、二抗、显色剂，并制多公司生产免疫组化试剂，包括一抗、二抗、显色剂，并制成了成套的试剂盒，但一般试剂盒中不包括一抗，研究者可成了成套的试剂盒，但一般试剂盒中不包括一抗，研究者可根据一抗的种属性

52、，选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。根据一抗的种属性，选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。 一抗的种属来源一抗的种属来源 一抗可来源于各种种属的动物，一抗可来源于各种种属的动物，常见是来自家兔、山羊常见是来自家兔、山羊或小鼠，偶见来自马或小鼠，偶见来自马。一般来自家兔和山羊的一抗都是多克。一般来自家兔和山羊的一抗都是多克隆的隆的IgG抗体，而来自小鼠的多是单克隆的抗体，而来自小鼠的多是单克隆的IgG抗体。根据实抗体。根据实验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。 抗体剂型及滴度检验抗体剂型及滴度检验 我国现在使用的多数抗体等

53、试剂是由国外进口，包括一我国现在使用的多数抗体等试剂是由国外进口，包括一抗和含二抗的试剂盒。抗和含二抗的试剂盒。 国外生产的一抗一般浓度都是国外生产的一抗一般浓度都是100-200 g/ml，但国内各经销，但国内各经销商将进口的原装抗体又进行了分装，如分成商将进口的原装抗体又进行了分装，如分成0.1-0.2ml/瓶等，瓶等，也经销也经销1ml/瓶抗体，价格各不相同。瓶抗体，价格各不相同。 国内各经销商又根据需要将进口抗体进行稀释，销售的品种国内各经销商又根据需要将进口抗体进行稀释，销售的品种又分为又分为即用型即用型和和浓缩型浓缩型(进口原装的抗体进口原装的抗体)两种。两种。 在免疫组化染色中，

54、使用即用型一抗和试剂盒一般不需稀释，在免疫组化染色中，使用即用型一抗和试剂盒一般不需稀释，直接在切片上滴加即可。直接在切片上滴加即可。 浓缩型必须在稀释后才能使用，因为浓缩型抗体浓度高，可浓缩型必须在稀释后才能使用，因为浓缩型抗体浓度高，可引起严重的非特异性染色，因此，必须在正式染色前先用切引起严重的非特异性染色，因此，必须在正式染色前先用切片对不同滴度的抗体染色效果进行评价，选择浓度强度最好，片对不同滴度的抗体染色效果进行评价，选择浓度强度最好，非特异性反应（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染非特异性反应（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染色。色。 一抗稀释滴度的评价一抗稀释滴度的评

55、价（摸索实验条件时可以稀释度跨度大一些试）（摸索实验条件时可以稀释度跨度大一些试）切片编号 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗体稀释度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800特异性染色 + + + + + + + + + + + + + + +背景染色 + + + + + 一抗体的稀释一抗体的稀释 一般稀释一抗的液体与洗涤切片的液体相同，即一般稀释一抗的液体与洗涤切片的液体相同，即0.01mol/L PBS pH 7.2-7.4，为进一步保证减少背景染色，用于稀释一抗，为进一步保证减少背景染色，用于稀释一抗的的PBS中也

56、应加入制备二抗的同种动物的非免疫正常血清，有中也应加入制备二抗的同种动物的非免疫正常血清，有条件的还可加入条件的还可加入BSA，两者的浓度在，两者的浓度在1-2-5% 即可。即可。 一抗的孵育时间及条件一抗的孵育时间及条件 加入适当稀释的一抗的切片，可在常温下或加入适当稀释的一抗的切片，可在常温下或37下保温下保温盒内孵育。盒内孵育。经过正常二抗同种动物非免疫血清孵育后的切片经过正常二抗同种动物非免疫血清孵育后的切片不能用不能用PBS洗涤，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上洗涤，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀释好的第一抗体滴加稀释好的第一抗体。孵育时间：。孵育时间：30-60

57、分钟或更长。分钟或更长。 如果待检的抗原量很少，而增加一抗的浓度又能引起较如果待检的抗原量很少，而增加一抗的浓度又能引起较明显的背景染色，可增加一抗的稀释倍数，将切片放在保湿明显的背景染色，可增加一抗的稀释倍数，将切片放在保湿盒中置于盒中置于4冰箱内过夜孵育，可达到满意的效果。冰箱内过夜孵育，可达到满意的效果。 12PBS洗涤切片洗涤切片 将用一抗孵育后的切片用将用一抗孵育后的切片用PBST洗涤洗涤3次，每次次，每次5min，用，用冷冷PBS洗涤，可减少非特异性反应。洗涤，可减少非特异性反应。13用针对一抗的生物素化二抗孵育切片用针对一抗的生物素化二抗孵育切片 根据一抗的种属来源，选择相应的二

58、抗。如：一抗是家根据一抗的种属来源，选择相应的二抗。如：一抗是家兔抗某种抗原抗体，二抗一般选用山羊抗家兔兔抗某种抗原抗体，二抗一般选用山羊抗家兔IgG抗体。二抗体。二抗分浓缩型和即用型两种。即用型二抗不需稀释，直接使用。抗分浓缩型和即用型两种。即用型二抗不需稀释，直接使用。浓缩型者一般用浓缩型者一般用PBS直接以直接以1: 200- 400倍稀释使用，室温下倍稀释使用，室温下保湿盒内孵育保湿盒内孵育30-60min。 试剂盒：浓缩型或即用型试剂盒：浓缩型或即用型 SP试剂盒、试剂盒、ABC试剂盒试剂盒 试剂盒中包含：试剂盒中包含：内源性过氧化物酶阻断剂内源性过氧化物酶阻断剂 二抗的同种动物非免

59、疫血清二抗的同种动物非免疫血清 生物素标记的抗生物素标记的抗IgG抗体（二抗）抗体（二抗） SP试剂试剂 ABC试剂（单独购买）试剂（单独购买）14PBS洗涤切片洗涤切片5min3次次15滴加滴加SP试剂或试剂或ABC试剂试剂（1）生物素）生物素-抗生物素染色（抗生物素染色（SABC或或SP法）的显色原理法）的显色原理 ABC法的染色原理法的染色原理 很早以前研究者就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，很早以前研究者就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，会引起明显的会引起明显的“维生素维生素H 缺乏症缺乏症”，也称为，也称为“蛋白质伤蛋白质伤害害”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分。经研究发现，

60、在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子 量 为子 量 为 6 8 k D ， 属 于 糖 蛋 白 ， 当 时 命 名 为， 属 于 糖 蛋 白 ， 当 时 命 名 为 卵 白 素卵 白 素（avidin）。机体中还有一种物质叫维生素）。机体中还有一种物质叫维生素H，又称为，又称为生生物素物素（biotin），是一种小分子的维生素，广泛分布于动），是一种小分子的维生素，广泛分布于动植物组织中，以辅酶的形式参与各种羟化酶反应，分子植物组织中，以辅酶的形式参与各种羟化酶反应，分子量为量为244 D。 卵白素具有卵白素具有4个同个同Vitamin H（生物素）亲和力极高的结（生物素）亲和力极高的结合点。给动