南京大学医学分子生物学研究法ppt课件

1、 任何强大的公司都不会给员工平安感，而是用最残忍方式激发每个人变得强大！ 凡是想方法给员工平安感的公司都消灭啦，由于强大的人在温顺的环境失去了狼性！凡是逼 出员工伟大的公司都升腾不息，由于在这种环境下，要么变成狼，要么被狼吃掉！最不给员工平安感的公司，其实给了真正的安 全感，由于逼出了他们的强大，逼出了他们的 生长，也因此有了未来！; 假设真的爱他的员工，就考核他，要求他，逼 迫他生长，假设他碍于情面，低目的，低要求，养了一群小绵羊、老油条，这是指点对员工出路最大的损伤！由于这只会助长他们的贪 婪、无知和懒惰。 让下属由于他而生长，拥有正确的人生观，价值观，并具备了完善的品行。不断的生长，就

2、是主管对员工最伟大的爱！;分子生物学研讨法分子生物学研讨法-DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术;DNA根本操作技术根本操作技术; 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极挪动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比分子大小、极性、介质的粘度系数等。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实践上呈多聚阴离子形状Polyanions。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极挪动。1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamid

3、e); 在凝胶电泳中，普通参与溴化乙锭EB-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所构成的条带。;Genome DNATotal RNA;2. 聚合酶链反响技术聚合酶链反响技术 在引物指点下由酶催化的对特定克隆或基在引物指点下由酶催化的对特定克隆或基因组因组DNA序列进展的体外扩增反响。序列进展的体外扩增反响。;PCR仪仪;PCRPCR技术原理技术原理类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。端互补的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA变性：加热至变性

4、：加热至9494左右，双链左右，双链DNADNA解离成单链；解离成单链；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在引物的延伸：在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保管复制原理，合成一靶序列为模板，按碱基配对与半保管复制原理，合成一条新的双链；条新的双链；反复循环变性反复循环变性-退火退火-延伸三过程，使延伸三过程，使DNADNA扩增量呈指数扩增量呈指数上升。上升。 ;PCR

5、 productPCR product;例如电泳结果例如电泳结果 1 2 3 4 5 MM：DNA marker1：为阳性对照：为阳性对照2：为阴性对照：为阴性对照3-5：为扩增出的：为扩增出的DNA条带条带; 引物引物 primer 酶酶 Taq DNA polymerase dNTP dATP,dGTP,dCTP,dTTP 模板模板 template Mg2+ magnesium反响五要素：反响五要素：; 引物设计的原那么引物设计的原那么引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增10kb的片段引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, AT

6、GC最好随机分布防止引物内或引物间出现二级构造，防止两引物间互补，特别是 3端引物 3端的碱基要求严厉配对，特别是最末及倒数第二个碱基引物中可以加上适宜的酶切位点，要作酶切时加引物的特异性，引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物引物“设计设计step by step step by step Source: 文献 ；在线软件/数据库primer bank; NCBI 下载序列DNA, RNA 用Oligo验证评价引物 引物确定后，对于上游和下游引物分别进展Blast分析，; 酶及其浓度酶及其浓度Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶注：无注：无3 53 5方向的校正活性方向的校正

7、活性DNADNA复制复制1/1091/109；PCR PCR 出错率出错率1/(21/(2104)104)一个典型的一个典型的 PCR PCR 反响约需酶量反响约需酶量 2.5 U 2.5 U浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低那浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低那么合成产物量减少么合成产物量减少;dNTP dNTP 的质量与浓度的质量与浓度 dNTP dNTP运用留意：运用留意：1)1)保管：运用时应配成高浓度，小量分装，保管：运用时应配成高浓度，小量分装，-20-20冰冻保管。多次冻融会使冰冻保管。多次冻融会使dNTPdNTP降解；降解；2)2)运用量：在运用量：在PCRPCR反响中，反

8、响中，dNTPdNTP应为应为20-200umol/L20-200umol/L。3)3)成分配比：留意成分配比：留意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等；的浓度要相等；;模板模板templatetemplate 模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCRPCR成败成败的关键环节之一。的关键环节之一。; Mg2+ Mg2+浓度浓度1)Mg2+1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响对扩增特异性和产量有显著影响: : Mg2+ Mg2+浓度过高，反响特异性降低；浓度过浓度过高，反响特异性降低；浓度过低会降低低会降低 Taq DNA Taq DNA聚合酶活性，使反响产物聚合酶活性，

9、使反响产物减少。减少。2)2)在普通的在普通的PCRPCR反响中，各种反响中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为200mol/L200mol/L时，时，Mg2+Mg2+浓度为浓度为1.51.52.0 2.0 mmol/Lmmol/L为宜；为宜；;热循环条件的选择热循环条件的选择 PCR反响条件反响条件: 温度温度 时间时间 循环次数循环次数;温度与时间的设置温度与时间的设置 设置变性设置变性- -退火退火- -延伸三个温度点：延伸三个温度点： 规范反响中采用三温度点法：规范反响中采用三温度点法： 1 193-9593-95变性；变性； 2 240-6040-60退火；退火； 3 370-7570

10、-75延伸延伸 对于较短靶基因长度为对于较短靶基因长度为100100300bp300bp时可时可采用二温度点法，采用二温度点法， 普通采用普通采用9494变性，变性，6565左右退火与延伸左右退火与延伸 ;变性温度与时间：变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCRPCR失败的最失败的最主要缘由主要缘由 普通普通939394 l min94 l min足以使模板足以使模板DNADNA变性变性 假设低于假设低于9393那么需延伸时间那么需延伸时间 但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。响。;退火退火( (复性复性) )

11、温度与时间：温度与时间： 退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的较重要要素特异性的较重要要素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度当引物长度为及其浓度，还有模板的长度当引物长度为15-2015-20个碱基时，在高离子强度中反响如个碱基时，在高离子强度中反响如1M NaCl1M NaCl Tm = 4Tm = 4G+CG+C2 2A+TA+T 复性温度复性温度=Tm=Tm值值 - -5 51010普通普通3060 sec，足以使引物与模板间完全结，足以使引物与模板间完全结合合;延伸温度与时间：延伸温度与时间：温度：

12、温度： 普通普通70707575，常用温度为，常用温度为7272。时间：时间： 根据待扩增片段长度而定根据待扩增片段长度而定,1Kb,1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min。; 特异性强特异性强反响特点：反响特点：灵敏度高灵敏度高简便、快速简便、快速 对模板的纯度要求低对模板的纯度要求低;常见问题与对策常见问题与对策; 无扩增产物1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer对样品不适宜3. 引物设计不当或者发生降解4. 退火温度太高，延伸时间太短 景象：正对照有条带，而样品那么无; 非特异性扩增PCR扩增后出现的条带与估计的大小不一致；或者同时出现特异性

13、扩增带与非特异性扩增带。1. 引物特异性差, 2. 模板或引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多; 拖尾 景象：产物在凝胶上呈Smear形状 M 1 21. 模板不纯或降解2. Buffer不适宜3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP、Mg2+浓度偏高6. 循环次数过多; 假阳性挑选转基因、检测基因表达情况假阳性挑选转基因、检测基因表达情况) )缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染 景象：空白对照出现目的扩增产物1. 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除不能耐高温的物质外，一切试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性运用。3.

14、 各种试剂先进展分装，低温储存。;* * 实时定量实时定量PCRPCR* * RT-PCR real-time PCR RT-PCR real-time PCR 由于PCR技术具有极高的敏感性，扩增产物总量的变异系数经常到达10%-30%。 20世纪90年代末期出现了实时定量PCR技术，利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中的扩增DNA的积累素来绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。; 实时定量PCR反响在带透明盖的塑料小管中进展，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。 荧光探针事先被混合在PCR反响液中，只需与DNA结合后，才可以被激发出荧光。随着

15、新合成目的DNA片段的添加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应添加。实时定量实时定量PCR;例如：荧光染料例如：荧光染料SYBR GreenSYBR Green仅能与双链仅能与双链DNADNA结合，被激发结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映出绿色荧光，其荧光强度反映PCRPCR产物的产量。产物的产量。;SYBR GreenSYBR Green做探针的实时定量做探针的实时定量PCRPCR实验实验;SYBR GreenSYBR Green做探针的实时定量做探针的实时定量PCRPCR实验实验;Taqman Taqman 探针法探针法;RNA根本操作技术根本操作技术;总总RNA的提取的

16、提取Total RNA; 1. 制备RNA的关键防止内外源RNase的作用 1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(065均具活性；抗变性剂 2) 处理方法：外源RNase低温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处置 一切溶液TrisHCl除外和器皿，操作者带手套 内源RNase高温抽提，强蛋白量变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 2. 总RNA的制备 根据所用蛋白量变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1热苯酚抽提法 2胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3LiCl/尿素法 ;实验室常用方法：异硫氰酸胍实验室常用方法：异硫氰酸胍-苯酚抽提法苯酚抽提法 Trizol试剂是运用最

17、广泛的抽提RNA公用试剂，主要有苯酚和异硫氰酸胍组成。 Trizol试剂可以迅速破坏细胞构造，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并是核糖体蛋白与RNA分子分别，还能保证RNA的完好。;运用Trizol试剂提取RNA详细实验过程资料处置资料处置液氮研磨，匀浆，加Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分氯仿抽提，离心，分别水相和有机相氯仿抽提，离心，分别水相和有机相搜集水相搜集水相异丙醇沉淀，得到比较纯的异丙醇沉淀，得到比较纯的RNA;RNA的浓度和纯度可以经过测定其OD和OD 来判别260280 OD 为1时， 相当于浓度为40g/mL OD /OD 假设在1.8-2.0，表示所提取的

18、RNA纯度较好 OD /OD 低于1.8，样品中那么混有蛋白质或酚污染 260260260280280;mRNA的纯化 真核细胞的mRNA分子最显著的构造特征是具有 实验中常用寡聚dT-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。5端帽子构造m G3端polyA尾巴7; 寡聚dT-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA 当RNA流经寡聚dT-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性结合在柱子上， 再用低盐溶液会蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚dT-纤维素柱后可得到较高纯度的mRNA.;cDNA的合成 主要包括第一链和第二链cDNA的合成。 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA，

19、由反转录酶催化，该酶合成DNA时需求引物引导，常用的引物是oligo dT。 oligo dT引物普通包含12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个衔接引物通常是Xho等酶切位点以便于克隆构建.;cDNA的合成的合成;DNA变异变异eg. SNP的的实际与运用实际与运用;DNA DNA 多多 态态 性性 基因组基因组DNADNA中中, ,由不同碱基构造的等位基因由不同碱基构造的等位基因所构成的多态性所构成的多态性产活力制点产活力制点 突突 变变-序列多态性序列多态性 插入或缺失插入或缺失-长度多态性长度多态性存在部位编存在部位编 码码 区区 非编码区非编码区DNADNA遗传标志遗传标志 是特定

20、的碱基序列是特定的碱基序列 遵照孟德尔遗传规律遗传遵照孟德尔遗传规律遗传 具有终身不变的遗传特征具有终身不变的遗传特征; SNP 指基因组DNA序列中由于单个核苷酸A,T,C,G的突变而引起的多态性。 染色体DNA同一位置上的每一个碱基类型叫做一个等位位点。 SNP-RFLP-SSR (限制性片段多态性) 微卫星标志;根据SNP在基因组中的分布位置可分为： 基因编码区SNPcSNP 基因调控区SNPpSNP 基因间随机非编码区SNPrSNP同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改动并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义一样非同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改动可

21、使以其为模板翻译的蛋白质的氨基酸序列发生改动，从而影响蛋白质功能;SNP的检测技术 常用技术： 限制性酶切片段长度多态性RFLP PCR-单链构象多态性PCR-SSCP 毛细管电泳 变性高效液相色谱DHPLC以上技术仅能判别SNP的有无，而不能知道确切的碱基类型，只需进展DNA序列分析才干确认所发现的SNP经过DNA测序法获得新的SNP;SNP的运用 人类基因单体型图的绘制 SNP与疾病易感基因的相关性分析 当一个遗传标志的频率在患者中明显超越非患者时，就阐明该标志能够与这种疾病有关。 指点用药与药物设计 由于SNP可以充分反映个体间的遗传差别，所以经过研讨SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性

22、研讨，能够阐明遗传要素对药效的英系那个，因此能够建立与基因型相关的治疗方案，对患者施行个性化用药。;DNA 变异变异基因量的分析基因量的分析;杂合性丧失LOH;基因拷贝数的分析;RNA 量的分析; 蛋白质技术蛋白质技术 Western blot;定义：印迹法blotting是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反响来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜NC膜上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进展印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电

23、泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法;Western BlotWestern Blot根本原理根本原理 在电场的作用下将电泳分别的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。; 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封锁l一抗杂交l二抗杂交l底物显色;?经过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备蛋白样品的制备;蛋白样品的定量蛋白样品的定量Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的方式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后构成蓝色化合物，该化合物

24、在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)试剂：考马斯亮蓝任务液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白规范液 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂是一种离子

25、性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链子也带有疏水性的长碳链.当当 SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时,它会它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是的平均结合量是 1:1.4 (以分量为单位以分量为单位),而蛋白质结合固定比例之而蛋白质结合固定比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原先的带电价微缺乏道使蛋白质原先的带电价微缺乏道,且每单位分量之蛋白

26、质且每单位分量之蛋白质带电价一致带电价一致 (charge density),所以决议不同蛋白的泳动所以决议不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项要素速率就只剩下分子大小一项要素;M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵(时间)MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶成份;凝胶浓度与蛋白分别范围凝胶浓度与蛋白分别范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212;不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的蛋白质混合物分别才干的关系蛋白质混合物分别才干的关系5 51010

27、1515292945456666979720020029294545666697972002002929454566669797200200;转膜半干法半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转润滤纸之间，电转101030min30min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转置的缓冲液中，电转45min45min或过夜。或过夜。 ;一抗、二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培育皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量参与参与一抗溶液与滤膜温育。37

28、一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 参与用封锁液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。;辣根过氧化物酶法HRP碱性磷酸酶法AP化学发光显色法(HRP);背景太高1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封锁不充分4.抗体与封锁剂出现交叉反响5.抗体浓度过高 缘由缘由对对策策1.1.转膜前用转膜前用100%100%甲醇将膜完甲醇将膜完全浸湿全浸湿2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，改换新颖转膜缓冲液套，改换新颖转膜缓冲液3.3.检测一抗、二抗与封锁剂检测一抗、二抗与封

29、锁剂能否有交叉反响能否有交叉反响4.4.杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的任务浓度任务浓度; 双向电泳技术 蛋白质印迹法 蛋白质的质谱分析技术;双向电泳技术 根据蛋白质的两个重要特性： 等电点 相对分子质量;电泳设备电泳设备垂直电泳系统垂直电泳系统;程度电泳系统程度电泳系统;不同分子量的蛋白质在凝胶中运动表示图不同分子量的蛋白质在凝胶中运动表示图;原位分析;免疫组织化学免疫组织化学 免疫组织化学是指在组织细胞原位经过抗原抗体反响和组织呈色反响，借助可见的标志物，对相应的抗原或抗体进展定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。;免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞交融，制备特异

30、性抗体及纯化标志物与抗体集合构成标志抗体标本的处置抗原抗体反响和呈色反响显微镜下察看结果;组织抗原组织抗原抗体抗体标志物标志物 标志抗体标志抗体1 1 荧光荧光2 2 酶酶3 3 亲和技术亲和技术4 4 金标金标;组织抗原组织抗原 免疫细胞化学反响原理：免疫细胞化学反响原理：标志抗体标志抗体标志的抗原抗体复合物标志的抗原抗体复合物;间接法间接法 直接法直接法 两种免疫细胞化学反响方法;标本的处置标本的处置 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培育细胞 标本的固定与保管 酶消化处置 组织资料处置是获得良好免疫细胞组织化学分析的保证，必需保证要检测的细胞或组织取材新颖、固定即使及时、形状保

31、管良好、抗原物质的抗原性不被破坏。;标本的固定与保管 固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反响，防止细胞自溶，坚持细胞固有形状与构造，防止细胞零落，去除干扰抗原抗体反响的类脂，最主要的是保管组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂：1能快速固定抗原2防止抗原物质分散3固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反响;标本的固定与保管抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95乙醇室温，315min免疫球蛋白丙酮4，30min酶四氯化磺4 ，30min激素1聚甲醛4 ，45h细菌丙酮、甲醇室温，310min病毒丙酮，无水乙醇室温，510min四氯化磺4 ，3060min类

32、脂质10甲醛室温，310min细胞悬液1聚甲醛室温，2min各种抗原的固定标本的固定与保管 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。 冰冻切片制片方法简单，可防止石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤呵斥的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的构成，防止组织细胞构造的破坏。 石蜡切片是察看组织细胞构造的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋资料的回想性免疫组化研讨，切片薄，有延续性，蜡块可长期保管，但是抗原的保管量不如冰冻切片。;酶消化处置 石蜡包埋资料大都用甲醛固定保管，固定过程中由于醛键构成致使某些抗原决议簇被封锁，染色不理想，甚至出现假阴性，因此在进展免疫组化反响之前，需求酶消化处置切片，可使抗原决议簇

33、重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。;抗体处置与保管抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释的原那么是阳性抗原物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。;免疫染色 标志抗体与标本中抗原反响并构成抗原抗体复合物； 用缓冲液冲洗去未结合的成分； 直接在显微镜下察看结果免疫荧光直接法，或待标本显色后再用显微镜察看结果免疫酶直接法免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。;免疫染色 对一些特殊的标本需进一步进展处置来添加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的

34、是暴露抗原，添加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限制的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反响出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体一样的动物源血清非免疫血清吸附封锁底物煮至上的带电荷物质，然后再进展抗原抗体结合反响，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。;免疫组化染色中标识物的选择 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 机体内无同一物质或类似物质 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定 目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等;设立对照实

35、验 为确定结果的可靠性，在实验中必需设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、本身对照和吸收实验等。1阳性对照用不断抗原阳性的切片与待测标本同时进展免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。2阴性对照用不含不断抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。;免疫组化的结果判别染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色 免疫组织化学的结果判别应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜外表型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的根据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。;几种常用的免疫组化检测技术 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金银组织化学技术 免疫标志电镜技术 ; 免疫荧光技术将免疫荧光技术将 荧光素作为标志物荧光素作为标志物使组织细胞