发酵工程_青霉素的制备

1、 -青霉素类抗生素青霉素类抗生素青霉素简介青霉素简介 化学结构化学结构 理化性质理化性质 青霉素合成及调控青霉素合成及调控 生物合成生物合成 生物合成的调控生物合成的调控青霉素发酵生产工艺青霉素发酵生产工艺 菌种菌种 发酵工艺流程发酵工艺流程 培养基培养基 发酵培养控制发酵培养控制 青霉素简介青霉素简介青霉素的发现青霉素的发现 19291929年英国学者年英国学者弗莱明首先在抗弗莱明首先在抗生素中发现了青生素中发现了青霉素，英国谢菲霉素，英国谢菲尔德大学病理学尔德大学病理学家弗洛里实现对家弗洛里实现对青霉素的分离与青霉素的分离与纯化。纯化。青霉素的化学结构青霉素的化学结构 青霉素是含有青霉素母

2、核的多种化青霉素是含有青霉素母核的多种化合物的总称，青霉素发酵液中至少含有合物的总称，青霉素发酵液中至少含有5 5种以上的不同的青霉素：青霉素种以上的不同的青霉素：青霉素F F、青、青霉素霉素X X、青霉素、青霉素K K及二氢青霉素及二氢青霉素F F等。等。青霉素分子结构球棍模型青霉素分子结构球棍模型青霉素合成及调控青霉素合成及调控青霉素的生物合成青霉素的生物合成青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节 用产黄霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻用产黄霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻遏，这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始遏，这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始酶酶高柠檬酸合成

3、酶受到了赖氨酸反馈阻遏。高柠檬酸合成酶受到了赖氨酸反馈阻遏。 在赖氨酸生物合成途径中，从氨基己二酸在赖氨酸生物合成途径中，从氨基己二酸分支而产生青霉素，这种赖氨酸阻遏是初级代分支而产生青霉素，这种赖氨酸阻遏是初级代谢调节的效果用到次级代谢上的最好的例子。谢调节的效果用到次级代谢上的最好的例子。青霉素的生物合成与糖分解代谢青霉素的生物合成与糖分解代谢的关系的关系 青霉素的生物合成受糖分解代谢产物青霉素的生物合成受糖分解代谢产物的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会被阻遏。在青霉素发酵过程中，发现能被被阻遏。在青霉素发酵过程中，发现能被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于

4、菌体生长，青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长，但抑制青霉素的合成，而被缓慢利用的乳但抑制青霉素的合成，而被缓慢利用的乳糖，却是生产青霉素的最好碳源。糖，却是生产青霉素的最好碳源。 乳糖比葡萄糖优越的主要原因乳糖比葡萄糖优越的主要原因是乳糖是乳糖被水解成单糖的速度正好符合青霉素生产被水解成单糖的速度正好符合青霉素生产期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此，度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此，碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原料如植物油等。但由于乳糖价格较贵，成料如植物油等。但由于乳糖价

5、格较贵，成本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量，加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量，以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。这样，可以降低成本，提高产量。这样，可以降低成本，提高产量。青霉素生产发酵工艺青霉素生产发酵工艺菌种菌种 目前国内青霉素生产菌按其在深层培目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢丝状菌和绿孢子丝

6、状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉素。子丝状菌，如产黄青霉素。青霉素产生菌的生长过程青霉素产生菌的生长过程分生孢子发芽期分生孢子发芽期菌丝繁殖期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒形成期脂肪粒减少，小空孢脂肪粒减少，小空孢大空孢大空孢自溶自溶菌丝生长期菌丝生长期青霉素分泌期青霉素分泌期菌丝自溶期菌丝自溶期培养基培养基碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸

7、氨、硝酸氨麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。等无机氮源。前体为生物合成含有苄基基团的青霉素前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要，需要在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。，并采用多次加入方式。无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在量在30ug/mL以下。以下。青霉素生产工艺过程青

8、霉素生产工艺过程 抗生素制备的一般流程图抗生素制备的一般流程图菌种菌种孢子制备孢子制备种子制备种子制备发酵发酵发酵液预处理及种子加滤发酵液预处理及种子加滤提取及精制提取及精制成品检验成品检验成品包装成品包装前体前体发酵阶段发酵阶段提取阶段提取阶段发酵工艺流程发酵工艺流程一、总述一、总述 青霉素发酵青霉素发酵将青霉菌接种到将青霉菌接种到固体培养固体培养基上基上培养一段时间，得到培养一段时间，得到青霉菌孢子培养青霉菌孢子培养物物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种种子罐子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，培养。然后将种子培养液接种

9、到搅拌，培养。然后将种子培养液接种到发发酵罐酵罐已灭菌的含有已灭菌的含有苯乙酸前体苯乙酸前体的培养基中，的培养基中，通入无菌空气搅拌，培养。通入无菌空气搅拌，培养。 青霉素菌种发酵工艺的原理青霉素菌种发酵工艺的原理 二、二、 青青霉素发酵过程霉素发酵过程 青霉素发酵时，青霉素生产菌在青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、合适的培养基、PHPH、温度、温度和通气搅拌和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过体和无机盐等）必须先经过灭

10、菌灭菌，后接入种子。，后接入种子。 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂泡沫剂，假如酸碱控制发，假如酸碱控制发酵液的酵液的PHPH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充物以补充碳源及氮源碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。霉素的生产。青霉素发酵过程中的代谢变化分为青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、菌体生长、青霉素合成和菌体自溶青霉素合成和菌体自溶三个阶段。三个阶

11、段。菌体生长阶段菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。菌体自溶阶段菌体自溶阶段：这个阶段菌体

12、衰老，细胞开始：这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，下降，氨基氮增加，PHPH上升。上升。发酵培养控制发酵培养控制加糖控制。残糖降至加糖控制。残糖降至0.6%0.6%，pHpH上升时加糖上升时加糖补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发酵液氨氮量控制在酵液氨氮量控制在0.01%0.05%0.01%0.05%。前体：发酵液中。前体：发酵液中残存乙酰胺浓度为残存乙酰胺浓度为0.05%0.08%0.05%0.08%。pHpH控制。控制。6.66.46.66.4温度。前期

13、温度。前期2525 2626 ，后期，后期2323 。溶解氧。不低于饱和溶解氧的溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%30%。泡沫的控制。泡沫的控制。 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制。为了避免这一现象制。为了避免这一现象, ,在青霉素发酵中在青霉素发酵中通常采用通常采用补料分批操作法补料分批操作法, ,即对容易产生即对容易产生抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓度。度。温度：青霉

14、素发酵的最适温度一般认为应温度：青霉素发酵的最适温度一般认为应在在25 25 C C 左右。温度过高将明显降低发左右。温度过高将明显降低发酵产率酵产率, ,同时增加葡萄糖的维持消耗同时增加葡萄糖的维持消耗, , 降降低葡萄糖至青霉素的转化率。低葡萄糖至青霉素的转化率。pHpH值：青霉素发酵的最适值：青霉素发酵的最适pH pH 值一般认为值一般认为在在6.56.5左右左右, , 应尽量避免应尽量避免 pH pH 值超过值超过7.07.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定因为青霉素在碱性条件下不稳定, ,容易加容易加速其水解。速其水解。溶氧溶氧: :对于好氧的青霉素发酵来说对于好氧的青霉素发酵来说,

15、,溶氧溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到当溶氧浓度降到30%30%饱和度以下时饱和度以下时, ,青霉青霉素产率急剧下降素产率急剧下降, ,低于低于10%10%饱和度时饱和度时, ,则造则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高成不可逆的损害。溶氧浓度过高, ,说明菌说明菌丝生长不良或加糖率过低丝生长不良或加糖率过低, ,造成呼吸强度造成呼吸强度下降下降, ,同样影响生产能力的发挥。同样影响生产能力的发挥。 菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过超过临界菌体浓度临界菌体浓度, , 从而使氧传递速率与氧从而使氧传递

16、速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下，菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长速率低于当比生长速率低于0.015h-10.015h-1时，比生产速率时，比生产速率与比生长速率成正比。因此与比生长速率成正比。因此, , 要在发酵过程要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率中达到并维持最大比生产速率, ,必须使比生长必须使比生长速率速率不低不低0.015h-10.015h-1。菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中长和结球生长两种形态。在丝状

17、菌发酵中, , 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, , 并避免结球并避免结球 , , 是获得高产的关键要素之一。是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中而在球状菌发酵中, , 使菌丝球保持适当大小使菌丝球保持适当大小和松紧和松紧, ,并尽量减少游离菌丝的含量并尽量减少游离菌丝的含量, , 也是充也是充分发挥其生产能力的关键素之一。分发挥其生产能力的关键素之一。 碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的杂酸，并控制发酵液的pHpH值值。苯乙酸苯乙酸/ /苯乙酰胺：可以借酰基转移的苯乙酰胺：可以借酰基转移的作用，

18、将苯乙酸转入青霉素分子，作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提提高青霉素的生产强度高青霉素的生产强度。P P和和S S：为菌体提供营养的无机磷源一：为菌体提供营养的无机磷源一般采用般采用磷酸二氢钾磷酸二氢钾。另外加入硫代硫。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。需的硫。 另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。采用的后果。采用植物油消沫植物油消沫