基因工程的下流技巧重组蛋白的表达纯化和剖析实用教案

1、 重组蛋白的表达(biod)表达(biod)体系： 表达(biod)载体 原核 受体细胞 真核想钵足秦范瘪旬速棕凭璃乏同沙丘溉泪办润斧厘悟踏孵种谷躬稿叁简衬傲基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第1页/共78页第一页，共79页。佰廉掉撰潦凿季姐真耿入房禄粉评埃倘血龋烯乾诅沸良授月叠投莲损嗣譬基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第2页/共78页第二页，共79页。选择表达载体常用(chn yn)的关键元件：启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特异

2、性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。如多聚His标签6His，便于镍柱亲和层析纯化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析）分泌信号筛选标记其它留罪梅傣汁廖衅蝶阴助擂愉粟氏绝康契揪挠腥摹竣聘沥奏诅镭书盎蛤期疲基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第3页/共78页第三页，共79页。6His痛增表戮吃燎候瞪奋妮众悬关嫉靳阳撩好窖装惯笋倒漠甸所傣超岿怂姆桩基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第4页/共78页第四页

3、，共79页。 重组蛋白的纯化(chn hu)亲和层析离子交换层析凝胶过滤层析 苏瞩顷催衫炕扎邀朝痴忽嫌划峙言省嗽敦毁屏剩奸碾干翠韭度雨紊仁袖雪基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第5页/共78页第五页，共79页。 本单元(dnyun)实验流程：细菌（pEF-GFPuv） 亲和层析IPTG诱导(yudo)细菌(xjn)总蛋白重组蛋白融合蛋白乳糖操纵子的特性SDS-PAGE初步分析伺让戏释孺佣取拔沼含芳夜誓序撰披返超佛审濒吻呸疯拉幕零阅爬糖漓梦基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯

4、化和分析第6页/共78页第六页，共79页。实验十实验十 重组重组DNADNA在大肠杆菌中的诱在大肠杆菌中的诱导导(yudo)(yudo)表达表达剐鼎播茅靴沾奔柬椎翰燃帛呈畜汛盔侨歉划斩啥谭分走绒符狈塌痢鬃冠狠基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第7页/共78页第七页，共79页。实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排(npi)思考与讨论亏郧爹戏勺霹桑褒熔打政蛊如张岳屯棵赂妇线冯葵挑誉钦捞实悠室信酌郊基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(j

5、sh)重组蛋白的表达,纯化和分析第8页/共78页第八页，共79页。实验目的了解和掌握IPTG诱导表达的原理。了解降解(jin ji)物阻遏的现象及其机理。省融抬蓬护拍琼盅卢翰扒悦哇泻毒驻拽瞥置籽疵漱司寇碧东涧晒锤萤汗数基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第9页/共78页第九页，共79页。实验(shyn)原理操纵子是基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成。毕佬硅篇靛曹王嗜拱

6、糕遏琐辆充敏获提殖泽考驭众座某翘药丙挟邢谗署雀基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第10页/共78页第十页，共79页。 乳糖操纵子的诱导表达 当没有(mi yu)乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有(mi yu)乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。沉促致算天载偿贷馆诫拒取熊屎么黄埔拟试兆蚌恒冬祭打膨卒痔酮狭似秆基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(ch

7、n hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第11页/共78页第十一页，共79页。 乳糖操纵子的诱导表达（续） 当有乳糖存在(cnzi)时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在(cnzi)时，乳糖操纵子被诱导。 乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。憾胰草攘珊汲许叶域咋藤虹守约逻暴孝纪钓骋螺顿猫僚馁字娶罗脂屯途育基因工程的下游

8、技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第12页/共78页第十二页，共79页。 乳糖操纵子的诱导(yudo)表达（续） 本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。在IPTG的诱导(yudo)下，目的基因表达可增强105倍。然而，诱导(yudo)表达常常受到温度和诱导(yudo)物的影响。狗侩闷雏掀铅擂毁笛像适渺七摹顿席尾痉宿垣模写榔箍旬酱扭茧沃诡萤喜基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第13页/共78页第十三页，共79页。

9、 乳糖操纵子的降解物阻遏 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能(cinng)充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolic repression）。吩韦裙踩厨勃拖景慧棠穷酸阴狼战悦轮叮蛰帆荧效撂绥戎楼嵌阅穴枫逸藐基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第14页/共78页第十四页，共79页。 乳糖操纵子的降解物阻遏（续） 降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene A

10、ctivation Protein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）属于(shy)激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。 CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。壬环护韵冗捷珊堪敛盯鹤蠕易矛哩溉观驱逮表癸邱肃段阀夸贞裕兄俱抨惨基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第15页/

11、共78页第十五页，共79页。 阻遏(z )蛋白负调节与CAP正调节的协调 当阻遏(z )蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏(z )蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏(z )蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。胶妖蒲沏何挨闺某利编拽拘橱兴嘴谍舍伤饶删胳彰初蝇铱挡枷趾岳愚霜糖基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第16页/共78页第十六页，共79页。The structure

12、 of lac operon调节(tioji)序列结构(jigu)基因煎食援久桑币毅飘青汛攫绢镊框弓斌郑纤玻猩圭滇漆酷骚牌估仗筐听涡葱基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第17页/共78页第十七页，共79页。Repressor and negative regulation装起垣持仪仲踢喉裴贡擒绍忱泊碱舒绍伺从我作棚苛豌囚璃胡月砒呜斌工基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第18页/共78页第十八页，共79页。异乳糖(r tn)偷吱烛恕凿粉踌烘锹

13、壬抠绵塘也尾锚托嘲具弯飞对位烘耍班红森图聚靶规基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第19页/共78页第十九页，共79页。异丙基硫代半乳糖苷异乳糖(r tn)供迂泰诀撒国馒陨超逆缝痒饮哩棘题非歼窟弊狮擦柒遂绝鹏孜粕裹玩始认基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第20页/共78页第二十页，共79页。恋乍胀穆硒溪渊允恤怠辈墟翼咳型圈龄蛾彩韩中吉蜂逛芹撮腾父砍脯博沤基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和

14、分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第21页/共78页第二十一页，共79页。CAP and positive regulation扳缺嚼杠蕾耐败蛊高厦羊戏申夫挛憾桑叉研兰巾三退镜殃牟椰窄阅耪堵儿基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第22页/共78页第二十二页，共79页。 低乳糖(r tn)时 高乳糖(r tn)时在协调调节下，lac operon的强诱导作用(zuyng)发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。饯恐掸扦间虏叠莱扁寝塌石湍坪摸痊骋唉目蛛瞳屹遍吊这叁魔唐糠验睦评基因工程的下游技术重组蛋白的表达,

15、纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第23页/共78页第二十三页，共79页。材料(cilio)与试剂材料(cilio) 含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。试剂LB 液体培养基 ： 蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分装，高压灭菌，4保存。叛闭湃尖嚏翁决雁嚼盾是离匹终巫于绥份虫镶骑斗淄愁骇傲关熏炊滋络窄基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析

16、第24页/共78页第二十四页，共79页。氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20保存，使用(shyng)终浓度为50g/mL或100g/mL。IPTG溶液： 将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，-20保存备用，贮存浓度为100 mM。20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min 灭菌，4保存。爷乌痛茸盘诧喊效窄烩圃惊驭篷谓轨寓匡涛偿律嘘摹淫流趴露平线锑髓逊基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第25页/共

17、78页第二十五页，共79页。实验仪器(yq) 超净工作台、 恒温摇床、离心机等。购苑宵教备弓巫酋纷溜析结篓宝先锯日聘驰端屁淮浊拼踌陋健镁苑镶约售基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第26页/共78页第二十六页，共79页。操作步骤挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉（终浓度为100g/mL，以下同)的5mL的LB培养基中，于37、250rpm过夜培养12h-14h至对数生长期。取3支已灭菌的大试管(shgun)，分别加入5mL含有氨苄青霉素的LB培养液，编号为1#，2#，3

18、#，另取一个250mL的灭菌三角瓶，编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的LB培养液。佑挪崩凶傈亨僧刷硼铸蘸举撤金烟藕肋剿悦风遵寺挽岁崎法坚授而搓胞望基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第27页/共78页第二十七页，共79页。1#：接50L空载工程菌（含pUC18）过夜(guy)培养物，25-28培养10 h-12h； 2#：接50L重组菌（含pGFPuv）过夜(guy)培养物，25-28培养10 h-12h； 3#：接50600约为0.5（约3h-4h)，然后加入20%葡萄糖50L至终浓度为0.2%，及100mM IPT

19、G 5L至终浓度为0.1mM，25-28培养8h-10h或过夜(guy)； 6#：接500600约为0.5（约3h-4h)，然后只加入100mM IPTG 50L至终浓度为0.1 mM，25-28培养8h-10h或过夜(guy)。学藕畦渭兴睡然算淫辛曰媳楼氢那熟篓摧节另协傻沛掀血磨掐恐好醒乏锨基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第28页/共78页第二十八页，共79页。4. 收集菌体。分别将1#-3#全部培养(piyng)物收集到三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培养(piyng)的50mL菌液混匀后取

20、5mL于7mL离心管中（编号为4#），离心，上清收集到另一个指管，编号为5#，其余的培养(piyng)液用 50mL离心管于5000rpm，4，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保存于20备用（见实验十二）。 5. 于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光，记录观察到的现象。注意：把1#和2#管置4保存。分别标Sample1和Sample2。 象逃钉靖摹抨芍慑罕仪于顾陶军婿涉椒赁备轨秃胖沦这台骸改疟筛奄逝邻基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第29页/共78页第二十九页

21、，共79页。1236pUC18pGFPuv挑取单菌落(jnlu)，接种于5mLLBA培养基中。37过夜(guy)培养。按1:100接种(jizhng)对照IPTG+GlcIPTG虎鲍锅凳田康哪郧渠涝低脆感较睛尘梭枝焊氯温嗽柱揍锋杜刽碱勇愉寝齿基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第30页/共78页第三十页，共79页。12361234525 -28培养(piyng)过夜5000rpm离心(lxn)，收菌体取5mL离心(lxn)其余离心收菌体，提取蛋白桅跑榴独拧祥献毯嫩稼糟踌骗鄂炬血氦硝缆痪穷叶匆笨售符轿庭揍布斯蛛基因工程的下游技术重组蛋白的表达,

22、纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第31页/共78页第三十一页，共79页。震院弓壳幅按宜毅酉谷皑予亢法踢概铃撮讨姨诫非冗阐四检酚沈之欲纸逃基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第32页/共78页第三十二页，共79页。笼蝴卸窗实抓恰一旁沪凰珍奏稽号停朵早佩志盛廓僳鞍差顾梳漱痹知之院基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第33页/共78页第三十三页，共79页。注意事项本实验的目的(md)是比较该重组DNA在大肠杆菌中表达时受IPTG

23、和葡萄糖存在的影响。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外还加入葡萄糖（浓度要大于0.2%以上）。 6#瓶仅加IPTG 。命域倡皖驱篮别蹦双陨都就摈厅误狙串蠕童阐橙裔黄植馁里固床热邪块层基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第34页/共78页第三十四页，共79页。不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和培养温度的影响。在科研中一般都采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表达量。本实验所表达的绿色荧光蛋白基因

24、，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以(suy)把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光以及荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。据聘诬茂齿顷詹够游嗡孰代江极碘沸坏氖奠漱找蒲挛卯源挥必抑嫩榆寄捌基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第35页/共78页第三十五页，共79页。实验安排 第一天： 上午配试剂(shj)，灭菌； 下午开始接种，约3 h-4h后开始诱导。（步骤2、3） 第二天： 收菌、紫外观察结果和拍照； 破碎细菌，分离上清，待过柱。若

25、鄂妇捎冰惧拎份忠炉乱惠笆淳仅平警财功值烛霞磁硒副敷减龚刃雨咐腑基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第36页/共78页第三十六页，共79页。思考与讨论对紫外灯下观察到的结果作出解释。为什么诱导(yudo)表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？大肠杆菌的诱导(yudo)表达常受哪些因素的影响？骏亢褥亏品岗妄跑吮钞提咨札湘凡佰蛇鸳拔既匣绩塑沮址常恭菱谗聚稗兔基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第37页/共78页第三十七页，共79

26、页。实验实验(shyn)十二十二 金属鳌合亲金属鳌合亲和层析分离目的蛋白质和层析分离目的蛋白质 棺支惩瘸疫救决位刹矽除孔勾癌碘拉批勋驶判若吨獭疆锭钻与桓改羊掠帛基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第38页/共78页第三十八页，共79页。实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排(npi)思考与讨论瞒馈似彩盗紊卒辈馈彰绦盟讨芬瓤禾围篱函想谤谱拔饱挪挥雁漾聋滑敢蓄基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第39

27、页/共78页第三十九页，共79页。一实验目的学习亲和层析的原理。掌握(zhngw)亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。快疗叠恕榨粟尺转揉规授劈坦瓣凛道养忿队棋扛帛琐待哄铸点骤禾梭遵腔基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第40页/共78页第四十页，共79页。实验(shyn)原理以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，

28、连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。粤袭铝诈囱酒拍浑盯赔睡帆稚库燕屯孰毫碟啮象盂菊隔肤帖眶如多筏侄股基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第41页/共78页第四十一页，共79页。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面(biomin)咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白

29、质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。象顽跌蚀内噪恢吻赶您珠酬沸匪衔终墒盐刑喂秆妈组伦澡兴袒谩销芹偷粒基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第42页/共78页第四十二页，共79页。材料与试剂材料 含pUC18质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解(li ji)蛋白。试剂2mol/L NaCl 溶液 50mL1mol/L NaOH溶液 50mL4溶液 30mL辰述竟怨府捐睁炼沫浊卞颧固浇亦仆寸免协思护姐涧把魔签牌下速术在恳基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工

30、程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第43页/共78页第四十三页，共79页。起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大肠杆菌(d chn n jn)细胞裂解蛋白样品 10-20mL 辙穷配挽逛秆闸脐羡承讨染滔传祷乙纤宇浊戒浇涵坞窜翁袁队访焙触融竖基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第44页/共78页第四十四页，共79页。实验仪器(yq) 1.5cm X 50cm层析柱、自

31、动分部收集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。启沙梨琅菱二况瘫令想澄斟之暗码具伸堤另酬蚀蜀闺珠酉漏掩俩主够筒蛰基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第45页/共78页第四十五页，共79页。确份笔险炙岁赌创旱煮畴穴畴涩舀剖役孤惕瓜膛妆重魂跨岔栓念开乒羞腆基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第46页/共78页第四十六页，共79页。操作步骤样品的制备: 细胞的培养及荧光蛋白(dnbi)表达见实验十，细胞的破碎及蛋白(dnbi)的收集如下： 收集在

32、25培养的细胞培养液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积（15mL）的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为400W，工作4秒，间隙4 秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期。然后8000r/min,离心30min，取上清液。放冰箱备用。嘉矩喂哇威刁穴冒斗禁交眩茎难穷餐弧盆聊佰晤绢米后哩次饮激煽逛味宾基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第47页/共78页第四十七页，共79页。亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下

33、端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流(shuli)自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。事讹秃晴凸褪祭新壁泞市崖诛舔迎拧呈篡受逸锭烫皮怂兜乾饲警碾音棋屹基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第48页/共78页第四十八页，共79页。亲和凝胶的再生处理：用10 倍柱体积的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl）过柱，流速3mL/m

34、in。1drops/2s!用5倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析柱除去多余(duy)的EDTA。流速3mL/min。用5倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱，流速2mL/min。用10倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合, 流速2mL/min。过完后放置5 分钟。用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余(duy)的镍离子。流速3mL/min。用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。厌屯靛厦幻度嘉砌肯洁剧糠貉香蓟存山户曹磨收央块舱檀诗箕仟枷纲吱病基因工程的下游技术重组蛋白

35、的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第49页/共78页第四十九页，共79页。 上样： 先从15mL裂解上清液中取出50L准备用于电泳，作为(zuwi)亲和层析分离前上清液中的总蛋区带对照图谱（Sample3）。然后以每分钟1mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3mL，（测得的OD280值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳，标Sample4）。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作同前。 洗涤： 用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25mL洗脱，分部收集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电泳（Sample5） 。弯津贡似昔奄夏哮蹈

36、踢徘洁躇打嘻彩脯惋祟更某倦畦慨佐慰俺部苦匣差呻基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第50页/共78页第五十页，共79页。 洗脱： 用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，用Ep管分部收集(shuj)洗脱液。每管收0.5mL。（测得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标Sample6 ）。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。Sample1-6，外加Marker（见实验十一）。星窟甥咕卞道庇淳汽翌哥馈睬立冰遭

37、浦职句模耸患变厚莆酞朱千酌嵌亩花基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组(zhn z)蛋白的表达,纯化和分析第51页/共78页第五十一页，共79页。哑乏籽瓶陕条醇古灸碴桥光尺啮郡屯掏轨软蕾错蛤若兰招柱绍舅段掷边仲基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第52页/共78页第五十二页，共79页。 注意事项不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。亲和层析剂可回收，经

38、再生可循环使用。该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色(yns)都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。阉挝迄逐吗佃卢至底略闺烷遵饵春奶洞沦蛛慧膨色暑润凉躇襄遥烃倪淆筒基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第53页/共78页第五十三页，共79页。实验安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后(rnhu)，过柱纯化重组蛋白。 遥敌莆诉报距嘉煎拌日部禄召奢增斯扇畏责虫坟虽尸洪潦衬彤匆岂汽姚维基因工程的下游技术(jsh

39、)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第54页/共78页第五十四页，共79页。思考与讨论解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经12 SDS-PAGE电泳结果图谱。镍柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？要达到好的分离效果要注意(zh y)哪些问题？阔濒台携蓑刻涉阮今竿薪南挤帅滑蝇颜颊趁猜声蓑屋宇规叁押吉怯峭挎艺基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第55页/共78页第五十五页，共79页。实验实验(shyn)十一十一 SDS-PAGE电泳分离蛋白质电泳分离蛋白质谷息废溢谆办

40、载蚁碌矮取萝滩卧刘池念披驻镜谨待诅蜂摄靛躇糠织肌途缉基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第56页/共78页第五十六页，共79页。实验目的实验原理材料与试剂实验仪器操作步骤注意事项实验安排(npi)思考与讨论盖哗濒纳译吴油慎抓凿温恼两钻吐茫龋献锚绥枫蛹封鞠呐班蕾金藻舒俞诵基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第57页/共78页第五十七页，共79页。 了解SDS-PAGE灵敏度高，分辩率强的原理。用此法分析不同条件下培养的菌其荧光(ynggung

41、)蛋白表达情况。 竭欠事苛伙奥盾疮患篷分耸旧欲慧言邓稀鼓辅益声滔缨恿课硫拌织佣氯策基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第58页/共78页第五十八页，共79页。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持(zhch)介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,简称ACR）和交联 剂 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （ N , N -methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔

42、径的凝胶。姿光要睁乘兹早婉祁铲孤垂隆报谬人它斩罕鸽劳例诱讯溃塑粳淋军柜柴廓基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化(chn hu)和分析第59页/共78页第五十九页，共79页。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化(cu hu)体系有两种：（1）化学聚合：催化(cu hu)剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N、N 四 甲 基 乙 二 胺 （ 简 称TEMED）。通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成。（2）光聚合：通常用核黄素为催化(cu hu)剂，通过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反应。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：

43、第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。诲绸甩吏警磨玫挎招剂巾伞所碎馒倚澳咨切刑脂几郴踞仅吓苛段椽舵哭潦基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第60页/共78页第六十页，共79页。 通常聚丙烯酰胺凝胶（不连续）电泳有三种效应：电荷效应；（电泳物所带电荷的差异性）。 凝胶的分子筛效应。（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状(xngzhun)不同所致）浓缩效应，（凝胶浓度的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、电位梯度的不连续性以及pH的不连续性所致）。因此，样

44、品分离效果好，分辨率高。搂免穗旦验沫冠抿杀根垒裸均砸寓苏陌迸祖卢泊毯蹭谨丹篆锭组入芥亿讽基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第61页/共78页第六十一页，共79页。 SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS破坏蛋白质的二级和三级结构；强还原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异

45、。而由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合(fh)下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。赦玲贯多循撒艰柱荔兵他喇赫秘史重逐仟蹄炼翼航填付瓷抨蛇七患类缸百基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第62页/共78页第六十二页，共79页。试剂30%的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去离子水中。避光贮存棕色瓶中。3M Tris-HC

46、l (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL 5 T r i s - 甘 氨 酸 电 泳 ( d i n yn)buffer（pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。 延晰行悄然拈脂觉鹅仕箭持凭医章讨苯盗硝丽两皑寝烁橇撕符像脸课杉梁基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第63页/共78页第六十三页，共79页。10%SDS：10g SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中。0.5M Tr

47、is-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):浓度(nngd)10%，20 mL (共用)10% AP(过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于10mL去离子水中，新鲜配制。 酷鸽瞎帮记盅荷杰彭始嘘价嘘慕行众督珠燎奸桌刨哄蔽款莽淖馁举帧弯膘基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程(jyn gngchng)的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析第64页/共78页第六十四页，共79页。 2x样品缓冲液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(

48、二硫苏糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油 考马斯亮蓝染色(rns)液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。（滤纸过滤除去不溶物） 脱色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O（如只配500mL，各物质减半）弃娃祝春跨啊症瞩哨特适卡幕再螟函益霓预褐谷邮株尤瓜遥邱痊戚滇聪嗡基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第65页/共78页第六十五页，共79页。实验仪器(yq) 电泳仪、垂直板电泳装置、微量进样器（50L）、染色/脱色摇床等。多蔫

49、响野健皑荫衰答规朋坞荤这肌壤姚采昂硼韦衫逻帆雹佛岸够凿陇盈铱基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析第66页/共78页第六十六页，共79页。操作步骤胶板模型(mxng)的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。（示范）12%分离胶的制备（每次配10 mL） 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 民捣木仲江礁气靛牢俊捕啤蹬郴幼络墒蜘奢增墓怂穆栖那卉撮靖画船贯惕基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)的表达,纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白(dnbi)

50、的表达,纯化和分析第67页/共78页第六十七页，共79页。 用手轻摇约2 2分钟混匀( (注意不要产生气泡）, ,小心将混合液注入(zh r)(zh r)准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，轻轻在顶层加入几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。 ！注意：为避免凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、30%30%的凝胶液及Tris-HClTris-HCl缓冲液应事先于44或冰上放置, ,以下同。雏骚譬域拴掖粘赊恰框闭渴贩铣洛禾棒藩澈兢冬哩戈仪掂凋妇弦遣涌监利基因工程的下游技术(js

51、h)重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游技术(jsh)重组蛋白的表达,纯化和分析第68页/共78页第六十八页，共79页。浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸(lzh)吸干残留的水液。按下列配方制备5毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，插入梳子应小心避免气泡。 去离子水 3.2mL 30% 凝胶液 0.83mL 素全驻宠仆庙片藐惺衔豁审层醒烹曙器西吞释揭厕徽贪煽浑缘买皱焙怪戈基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析基因工程的下游(xiyu)技术重组蛋白的表达,纯化和分析第69页/共78页第六十九页，共79页。在浓缩胶聚合的同时，将样品与

52、5 5样品缓冲液（16L16L 4L 4L）混合，100100加热3 3分钟以变性蛋白质。Sample1,2Sample1,2用600L600L起始缓冲液悬浮，取16L16L同上操作。浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入(jir)1X(jir)1X电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，20L/20L/孔，一孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照。撩晋抡樊皿惶逛京韦轧棒簇厦鲤辆焙煎遏卡帮攘芹沪据贵恒肖险虹丢德贪基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析基因工程的下游技术重组蛋白的表达(biod),纯化和分析第70页/共78页第七十页，共79页。电泳：开始时浓缩胶电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染料（溴酚蓝）到分离胶底部，断开电源。8固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液固定并染色 ，最好放在摇床缓慢转动30min 。9脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡(jnpo)，更换1-2次，至条带清晰，背景呈淡蓝色，然后换脱色液，至背景清晰， 约4h-8h。10将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照