吴洪超 中期考核汇报

1、 汇报人：吴洪超 导 师：陈立志 研究员致病性坏死梭杆菌血凝素相关基因的克隆致病性坏死梭杆菌血凝素相关基因的克隆及其原核表达及其原核表达中期考核汇报中期考核汇报 汇报内容 :立题依据和意义立题依据和意义研究内容研究内容下一步计划下一步计划立题依据及意义立题依据及意义坏死梭杆菌（坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）分为分为Fnn亚种亚种和和Fnf亚种亚种。国内外对坏死梭杆菌白细胞毒素进行了大量研究，国内外对坏死梭杆菌白细胞毒素进行了大量研究，而对而对粘附作用粘附作用的研究却很少。由于血凝素和粘附素的研究却很少。由于血凝素和粘附素的作用非常相似，那么为了明确血凝素在粘附

2、中的作的作用非常相似，那么为了明确血凝素在粘附中的作用，阐明坏死梭杆菌的致病机理，有必要对坏死梭杆用，阐明坏死梭杆菌的致病机理，有必要对坏死梭杆菌血凝素进行研究，进一步为坏死梭杆菌基因工程亚菌血凝素进行研究，进一步为坏死梭杆菌基因工程亚单位疫苗的研究提供理论依据单位疫苗的研究提供理论依据12研究内容研究内容实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验二、坏死梭杆菌对小鼠实验二、坏死梭杆菌对小鼠LDLD5050的测定的测定实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆 实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定参考相关文献参考相关文献 p

3、细菌培养、染色镜检结果：细菌培养、染色镜检结果： 在在BHI血平板上，菌落呈小而凸起、表面湿润、边缘光滑的血平板上，菌落呈小而凸起、表面湿润、边缘光滑的菌落，菌落， 溶血。溶血。实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定p 生化鉴定结果生化鉴定结果在在种种的水平上鉴定为的水平上鉴定为 Fusobacterium necrophorum （99%） 实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定p 分子鉴定结果分子鉴定结果在在亚种亚种水平上鉴定为水平上鉴定为Fnn亚种亚种 参考相关文献参考相关文献 参考地方标准参考地方标准实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死

4、梭杆菌的纯化与鉴定p 测序结果测序结果1. lkt A启动子区启动子区 1076bp2. rpo B 926bp3. HA 253bp 实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定实验一、坏死梭杆菌的纯化与鉴定p LDLD5050的测定的测定实验二、坏死梭杆菌对小鼠实验二、坏死梭杆菌对小鼠LDLD5050的测定的测定染色体步移染色体步移巢式巢式PCR胶回收、初步验证胶回收、初步验证连接克隆载体、转化、测序连接克隆载体、转化、测序设计特异性引物、使用高保真酶进行再次验证设计特异性引物、使用高保真酶进行再次验证序列拼接、比对序列拼接、比对实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆53未知序

5、列未知序列已知序列已知序列 2445bp未知序列未知序列795bp1248bp1000bp序列拼接结果：分别重叠序列拼接结果：分别重叠174bp、272bp、112bp 拼接为拼接为4930bp的片段。的片段。实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆待扩增待扩增待扩增待扩增p 5端第一次延伸端第一次延伸 1248bp实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆p 3端第一次延伸端第一次延伸 1000bp实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆p 5端第二次延伸端第二次延伸 795bp拟发表拟发表致病性坏死梭杆菌血凝素相关基因的克隆、测序及序列分析致病性坏死梭杆菌血凝素相关基因的克隆、测序及序列分析实验三、血凝素相关基因全长的克隆实验三、血凝素相关基因全长的克隆3下一步计划下一步计划抗原优势区的表达抗原优势区的表达 软件预测软件预测 原核表达原核表达 制备抗血清制备抗血清 ELISA、CIEP Western Blot 蛋白质亚细胞定位蛋白质亚细胞定位 全细胞（细胞破碎）全细胞（细胞破碎） 间接免疫荧光间接免疫荧光 免疫