生物化学与分子生物学实验

1、1生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学实验教学课件实验教学课件生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验一：实验一： 基本操作与分光光度计的使用基本操作与分光光度计的使用实验二：实验二： 蛋白质的两性反应与等电点测定蛋白质的两性反应与等电点测定实验三：实验三： 福林福林酚试剂法测定血清总蛋白酚试剂法测定血清总蛋白实验四：实验四： 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾实验五：实验五： 蔗糖酶与淀粉酶的专一性蔗糖酶与淀粉酶的专一性实验六：实验六： 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质实验七：实验七： 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血

2、清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质实验八：实验八： 酵母酵母RNA的提取及成分鉴定（浓盐法）的提取及成分鉴定（浓盐法）实验九：实验九： 葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 实验十：实验十： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)实验十一：实验十一： 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验十二：实验十二： 微量快速质粒微量快速质粒DNA的提取与纯化的提取与纯化生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验一实验一基本操作与分光光度计基本操作与分光光度计的使用的使用生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验目的实验目的u 了解实验室的一般规则，点

3、收仪器了解实验室的一般规则，点收仪器u 掌握一般玻璃仪器的洗涤法和刻度掌握一般玻璃仪器的洗涤法和刻度 吸量管的使用吸量管的使用一、基本操作一、基本操作生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 试管试管u 吸量管吸量管(0.1mL(0.1mL、0.5mL0.5mL、1mL1mL、2mL2mL、 5mL5mL及及10mL10mL各一支各一支) )。u 微量加样器（微量加样器（2020 L L、100100 L L 、 200200 L L 、10001000 L L 、50005000 L L ）实验器材及试剂实验器材及试剂生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验点收仪器点收仪器

4、u逐项清点各种仪器是否完整无缺，逐项清点各种仪器是否完整无缺，若有破损或缺失；应向指导老师报若有破损或缺失；应向指导老师报告并请求更换或补发。告并请求更换或补发。 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验玻璃仪器的洗涤玻璃仪器的洗涤u 一般玻璃仪器的洗涤一般玻璃仪器的洗涤分类：试管、烧杯等分类：试管、烧杯等洗涤过程：洗涤过程：合成洗涤水刷洗合成洗涤水刷洗自来水冲洗干净自来水冲洗干净蒸馏水润洗蒸馏水润洗2-3遍遍沥干沥干备用备用自来水冲洗自来水冲洗生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 容量分析仪器的洗涤容量分析仪器的洗涤分类：滴定管、移液管、刻度吸量管和容量瓶等分类：滴定管

5、、移液管、刻度吸量管和容量瓶等洗涤过程：洗涤过程：自来水冲洗自来水冲洗铬酸洗液浸泡铬酸洗液浸泡2-4小时小时自来水冲洗干净自来水冲洗干净蒸馏水润洗蒸馏水润洗2-3遍遍沥干沥干备用备用生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验吸量管吸量管u 吸量管的种类吸量管的种类1、奥氏吸量管：、奥氏吸量管：2、移液管或、移液管或 移液吸量管移液吸量管3、刻度吸量管、刻度吸量管 2 1 3 3 3 3生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 奥氏吸量管：奥氏吸量管： 规格：规格： 只有一个刻度线只有一个刻度线 放液时最后须放液时最后须吹出吹出残留在管尖的液体残留在管尖的液体0.5mL、1mL、

6、2mL、5mL及及10mL 同一容量的吸量管中它的内表面积最小同一容量的吸量管中它的内表面积最小 准确度最高准确度最高常作为量取粘度较大的液体之用常作为量取粘度较大的液体之用生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 移液管或移液吸量管移液管或移液吸量管 规格：规格： 只有一个刻度只有一个刻度 放液时管尖残留液体放液时管尖残留液体不得不得吹出吹出1mL、5mL、10mL、20mL、25mL、50mL及及100mL常作为容量分析、定量稀释之用常作为容量分析、定量稀释之用生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 刻度吸量管：刻度吸量管： 规格：规格： 吸量管刻度分到尖端和不到尖端

7、两种吸量管刻度分到尖端和不到尖端两种 所标刻度有自上而下所标刻度有自上而下或或自下而上的两种自下而上的两种0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、 2mL、 5mL和和10mL 刻度到尖端且小于或等于刻度到尖端且小于或等于2ml的吸量管，的吸量管，在取液时要吹出残留在尖端的液体在取液时要吹出残留在尖端的液体生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验吸量管的使用方法吸量管的使用方法 拿法拿法 取液取液 调刻度调刻度 放液放液定量法与卸量法取液的不同定量法与卸量法取液的不同生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验吸量管的选用原则吸量管的选用原则u 量取整数量液体时，应尽量选用奥氏

8、吸量管量取整数量液体时，应尽量选用奥氏吸量管u 量取液体体积较大时可用移液管量取液体体积较大时可用移液管u 选用与取液量最近的吸量管选用与取液量最近的吸量管u 在同一实验中，若几支试管中需加入不同量的在同一实验中，若几支试管中需加入不同量的 同一种液体时、要根据加入液体的体积酌情选用同一种液体时、要根据加入液体的体积酌情选用u 尽量选用卸量法来量取液体尽量选用卸量法来量取液体生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验微量加样器微量加样器u 常用规格：常用规格：10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L和和5000 L生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 微量移

9、液器的使用方法微量移液器的使用方法设设定体积积套上适当的套上适当的tip头头 ，方可吸取溶液，方可吸取溶液 一档取液，二档放液一档取液，二档放液生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验试管中液体的混匀法试管中液体的混匀法u 旋转法旋转法u 指弹法指弹法u 甩动法甩动法u 倒转法与玻棒搅拌法（不常用）倒转法与玻棒搅拌法（不常用）生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 二、二、722722型分光光度计的使用型分光光度计的使用 722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、定量的分析。该仪器

10、广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生物化学实验室常用分析仪器之一是生物化学实验室常用分析仪器之一生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验基本原理基本原理u 溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收 的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不 同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色 光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量光通过溶液时，其能量就会被吸收而

11、减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即 符合于比色原理符合于比色原理-朗伯朗伯-比耳定律比耳定律 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 朗伯比尔定律：朗伯比尔定律： A=lc ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度：溶液的浓度 l：液层的厚度：液层的厚度 A：物质的吸光度：物质的吸光度 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验操作方法操作方法u 预热仪器预热仪器 u 选定波长选定波长 u 调节调节T=100 u 固定灵敏度档固定灵敏度档 u 调节调节“0”点点 u 测定测定 u 关机关机 生物化学与分子

12、生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验注意事项注意事项u 该仪器应放在干燥房间内，使用温度为该仪器应放在干燥房间内，使用温度为5-35。 远离强电场、磁场远离强电场、磁场u 每次做完实验时，应立即洗净比色皿每次做完实验时，应立即洗净比色皿 u 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 u 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记切断。并且用套子

13、盖住仪器，做好使用登记 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 比色皿的使用方法比色皿的使用方法 拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污不要碰比色皿的透光面，以免沾污 洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净 比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸干，比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸干， 以保护透光面以保护透光面 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验内容实验内容u 利用标准对比法测定待测利用标准对

14、比法测定待测CuSO4的浓度的浓度u 标准对比法：标准对比法： A标标=lc标标A待待=lc待待 C待待=A待待A标标C标标生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验结果与讨论实验结果与讨论u 登记原始数据登记原始数据u 计算并讨论计算并讨论 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验思考题思考题u 为什么测待测为什么测待测CuSO4时用蒸馏水做空白时用蒸馏水做空白管调管调“0”和和“100%T”？u 朗伯比尔定律为什么只适用于单色光？朗伯比尔定律为什么只适用于单色光？生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实实 验验 二二蛋白质的两性反应与蛋白质的两性反应与等电点测定

15、等电点测定生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n 了解蛋白质的两性解离性质了解蛋白质的两性解离性质n 掌握测定蛋白质等电点的方法掌握测定蛋白质等电点的方法实验目的实验目的生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pH线状线状DNA单链开单链开环。环。u低电压时，线状低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。片段的迁移速率与所加电压成正比。为了使分辨效果好，凝胶上所加电压不超过为了使分辨效果好，凝胶上所加电压不超过5V/cmu碱基组成与温度：碱基组成一般影响

16、不大，温度：碱基组成与温度：碱基组成一般影响不大，温度：430 u嵌入染料的存在：降低线性嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率迁移率u电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率的迁移率生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。台面污染。n 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯氰呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，蓝紫色；二甲苯氰呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的

17、迁移率比溴酚蓝慢。在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验思考题n 制备凝胶时梳板的作用是什么？制备凝胶时梳板的作用是什么？n 点样时要注意什么？点样时要注意什么？生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验十二实验十二微量快速质粒微量快速质粒DNA的的提取与纯化提取与纯化生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验碱裂解法碱裂解法生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验1掌握质粒提取的原理及方法掌握质粒提取的原理及方法2掌握琼脂糖凝胶电泳的方法掌握琼脂糖凝胶电泳的方法生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 质粒是独立于细菌染

18、色质粒是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传体之外进行复制和遗传的一类双链闭环的一类双链闭环DNA分分子。在分子生物学研究子。在分子生物学研究中常用做基因的运载工中常用做基因的运载工具，携带外源基因进入具，携带外源基因进入细菌体内进行扩增或表细菌体内进行扩增或表达。达。生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验l 分子相对小分子相对小l 有高效的自主复制成分有高效的自主复制成分l 相容性相容性l 转移性转移性 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 分离菌落分离菌落为了提高质粒为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清。细的纯度，离心弃上清。细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等接种接种扩增扩增质粒质粒DNA自主复制自主复制生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验