微生物的生长及控制(1)

1、第七章第七章微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制u 第一节、微生物的培养方法u 第二节、微生物的生长规律u 第三节、微生物的生长的测定u 第四节、环境对微生物生长的影响u 第五节、有害微生物的控制生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与量方面结构在的增加与量方面结构在的增加 生长生长（量变）（量变）指生物个体数目的增加指生物个体数目的增加 繁殖繁殖（质变）（质变） 在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，

2、因此实际上常以际上常以群体生长群体生长作为作为衡量微生物生长的指标衡量微生物生长的指标。注：这一。注：这一点与研究大生物时有所不同。点与研究大生物时有所不同。 个体生长个体生长 个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长 微生物生长微生物生长 = = 个体生长个体生长 + + 个体繁殖个体繁殖一、微生物纯培养的分离一、微生物纯培养的分离 平板划线分离法平板划线分离法 稀释倒平板法稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法单孢子或单细胞分离法 利用选择性培养基分离法利用选择性培养基分离法 平板划线分离法平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无

3、菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。得到单菌落。 稀释倒平板法稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。体进行培养以获得纯培养。 在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采

4、用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。 选择性培养基分离法选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。 微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较分

5、离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的适用于分离某些生理类型较特殊的微生物微生物二、微生物的培养方法二、微生物的培养方法 按物按物理状态理状态好氧菌好氧菌一般适用于兼性厌氧一般适用于兼性厌氧1 1、实验室培养法、实验室培养法常用于实验室培养菌种常用于实验室培养菌种扩大培养扩大培养2 2、工业生产培养法、工业生产培养法固态

6、培养法固态培养法液态培养法液态培养法好氧菌的曲法培养好氧菌的曲法培养厌氧菌的堆积培养法厌氧菌的堆积培养法浅盘培养：浅盘培养：青霉素、柠檬酸青霉素、柠檬酸深层液体通气培养深层液体通气培养广泛使用广泛使用制曲酿酒制曲酿酒同步培养法同步培养法：使群体中的细胞处于比较一致的同样使群体中的细胞处于比较一致的同样的生长发育阶段上，使大多数细胞达到同时生长或的生长发育阶段上，使大多数细胞达到同时生长或分裂的培养方法。分裂的培养方法。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式生长阶段，并同时进行分裂的生长方式 通过同步培养方法获得

7、的细胞被称为通过同步培养方法获得的细胞被称为 同步细胞或同步培养物同步细胞或同步培养物一、同步培养一、同步培养1 1、同步培养的方法、同步培养的方法获得同步生长细胞的方法获得同步生长细胞的方法机械方法机械方法 离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜法法离离心心法法 温度温度培养基成份控制培养基成份控制光照和黑暗交替培养光照和黑暗交替培养 诱导法诱导法（环境条件（环境条件控制技术）控制技术）2 2、同步生长、同步生长同步生长：表现为阶梯式的曲线；同步生长：表现为阶梯式的曲线；随即生长：表现为直线随即生长：表现为直线由于细胞的个体差异，同步

8、生长往由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持往只能维持2-3个世代，随后又逐渐个世代，随后又逐渐转变为随机生长。转变为随机生长。 同步培养物常被用来研究在单同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。种理想的材料。二、细菌群体的生长规律二、细菌群体的生长规律典型生长曲线典型生长曲线微生物的特点：微生物的特点： 个体微小个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长

9、微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础。 基本概念：基本概念：分批培养分批培养 是微生物培养的一种方式。指的是在三角瓶或者发酵罐等培养容器中，放入一定量的培养基，接种微生物细胞，置于合适的条件下进行培养。整个培养过程中，既没有新鲜培养基的加入，也没有内部培养物的移出，最后一次性收获细胞或者代谢产物的培养过程。对分批培养条件下的微生物生长进行测定：对分批培养条件下的微生物生长进行测定：定时取样测定细胞数量，以定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标培养时间

10、为横坐标，以，以细胞细胞数量的对数为纵坐标数量的对数为纵坐标作图，得到一条反映细菌在整个培养期作图，得到一条反映细菌在整个培养期间生长规律的曲线。间生长规律的曲线。 生长曲线生长曲线一条典型的细菌生长曲线可以分为四个生长时期：一条典型的细菌生长曲线可以分为四个生长时期： 延滞期，对数期，稳定期延滞期，对数期，稳定期和和衰亡期衰亡期生长曲线可分：生长曲线可分：迟缓期迟缓期对数期对数期 衰亡期衰亡期 稳定期稳定期 1.1.延滞期延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称加很少，

11、生长速度接近于零。也称延迟期、适应期延迟期、适应期。l 细胞生理特点：细胞生理特点： 分裂迟缓、菌体大、分裂迟缓、菌体大、DNADNA含量高代谢活跃含量高代谢活跃 细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓，此阶段后期，少数细胞开始分裂，细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓，此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。曲线略有上升。l 出现的原因：出现的原因： 为了调整代谢（需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物）为了调整代谢（需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物）l 影响因素：影响因素： 菌种的遗传性、菌龄、接种量、及移种前后所处的环境条件等。菌种的遗传性、菌龄、接种量、及移种前后所处的环境条件等。l

12、缩短意义：缩短意义：可以缩短生产周期，提高设备利用率。可以缩短生产周期，提高设备利用率。l 缩短措施：缩短措施：1 1）增加接种量）增加接种量 2 2）调整营养成分）调整营养成分 3 3）采用对数期的种子接种）采用对数期的种子接种 4 4）选用繁殖快的菌种）选用繁殖快的菌种 把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程谢产物，要经过一个调整和适应过程 。延滞期出现原因2.2.对数期对数期以以最大的

13、速率最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。有规律地增加，表现为平衡生长。l 细胞的生理特点：细胞的生理特点： 细胞生长速率最大细胞生长速率最大，细胞数量呈指数增加，细胞数量呈指数增加 均衡生长均衡生长：个体形态、化学组成和生理特性等均一致：个体形态、化学组成和生理特性等均一致 代时（代时（G，世代时间，增代时间）或倍增时间：最短世代时间，增代时间）或倍增时间：最短 酶系活跃，代谢旺盛酶系活跃，代谢旺盛l 出现原因：出现原因：细胞完成生理调整，基质营养和环境适宜细胞完成生理调整，基质营养和环境适

14、宜 l可作为代谢生理等研究材料，增殖酵母菌的最适材料，作为发酵的种可作为代谢生理等研究材料，增殖酵母菌的最适材料，作为发酵的种子可缩短延迟期。子可缩短延迟期。l影响影响指数期指数期代时长短的因素代时长短的因素 1） 菌种：菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同 2） 营养成分：营养成分：营养丰富的培养基中生长代时短营养丰富的培养基中生长代时短 3） 营养物浓度：营养物浓度： 低浓度（低浓度（0.12.0mg/ml）影响菌体产量、生长速率）影响菌体产量、生长速率 提高浓度（提高浓度（2.08.0mg/ml）影响菌体产量）影响菌体产量 进一步提高不影响菌

15、体产量、生长速率进一步提高不影响菌体产量、生长速率 生长限制因子：凡处于低浓度范围内可影响菌体产量、生长限制因子：凡处于低浓度范围内可影响菌体产量、R的某营养物的某营养物 4） 培养温度：培养温度：在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关3.3.稳定期稳定期l 出现原因：出现原因：营养尤其生长限制因子的消耗，营养物比例失调，有害代谢产营养尤其生长限制因子的消耗，营养物比例失调，有害代谢产物积累，物积累， Ph值等理化条件不适值等理化条件不适l 细胞生理特点：细胞生理特点： 分裂速度降低分裂速度降低 活细胞数达到最大值活细胞数达到最大值 开始积累储藏物质开始积

16、累储藏物质 积累发酵产物（次生代谢物，对数期积累发酵产物（次生代谢物，对数期-菌体生长期，稳定期菌体生长期，稳定期-代谢产物合成期）代谢产物合成期） 芽孢细菌产生芽孢芽孢细菌产生芽孢l 实践意义：实践意义：生产收获时期（菌体及相平行的代谢产物）；细胞物质生物测生产收获时期（菌体及相平行的代谢产物）；细胞物质生物测定；促进连续培养原理提出和工艺技术创建定；促进连续培养原理提出和工艺技术创建活细胞数保持动态平衡（活细胞数保持动态平衡（正生长和负生长相等正生长和负生长相等），生长曲线进入平坦阶），生长曲线进入平坦阶段，菌体产量与营养物质的消耗间呈有规律的比例关系。段，菌体产量与营养物质的消耗间呈有规

17、律的比例关系。l细胞生理特点：细胞生理特点：1）个体死亡的速度超过新生的速度）个体死亡的速度超过新生的速度(繁殖数繁殖数死亡数死亡数)，整个群体就呈现出，整个群体就呈现出负生长（负生长（R合成速度合成速度l细菌生长曲线的用途：细菌生长曲线的用途： 研究上研究上 生产上生产上4.4.衰亡期衰亡期稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，总活菌数明显下降，称为衰亡期。新生数，总活菌数明显下降，称为衰亡期。 三、连续培养三、连续培养反映的是分批培养时的典型生长曲线生长规律反映的是分批培养时的典型生长曲线生长规律将微

18、生物置于一定容积的培养基中，经过培养生将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获长，最后一次收获培养基一次加入，不予补充，不再更换，导致出现稳定培养基一次加入，不予补充，不再更换，导致出现稳定期和衰亡期。期和衰亡期。我们期望：长期保持对数生长期的平衡生长状态。我们期望：长期保持对数生长期的平衡生长状态。n连续培养：连续培养：在一定恒定的容积的流动系统中培养微生物，在在一定恒定的容积的流动系统中培养微生物，在分批培养达到对数期的后期时，一方面以一定速率不断地加分批培养达到对数期的后期时，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体入新的培养基，另一

19、方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。恒定。n连续培养用于生产实践就称连续培养用于生产实践就称连续发酵连续发酵. eg：丙酮丁醇发酵、酒精发酵：丙酮丁醇发酵、酒精发酵 优点：优点： 缩短发酵周期，提高设备利用率，缩短发酵周期，提高设备利用率， 节省培菌工作，便于自动控制等，节省培菌工作，便于自动控制等， 产品质量稳定。高效、节约产品质量稳定。高效、节约 缺点：缺点： 营养物利用率一般低于单批培养营养物利用率一般低于单批培养 染菌问题染菌问题 菌种退化问题等菌种退化问题等 微生物生长表现为微

20、生物数量或质量的变化，通过此类指微生物生长表现为微生物数量或质量的变化，通过此类指标测定可以了解微生物的生长状况，如：标测定可以了解微生物的生长状况，如：1 1、评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；、评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；2 2、评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的、评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果；效果；3 3、客观地反映微生物生长规律等、客观地反映微生物生长规律等计数法计数法生长量法生长量法微生物生长的测定：微生物生长的测定： 一、计数法一、计数法可用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的可用于细菌、酵母等单细胞微生

21、物，以及放线菌和霉菌的孢子计数。孢子计数。1. 显微镜下的显微镜下的直接计数法直接计数法（1 1） 血球计数板血球计数板（2 2） 细菌计数法细菌计数法2. 间接计数法间接计数法活菌计数法活菌计数法（1 1） 比浊法比浊法（2 2） 稀释平板计数法稀释平板计数法（3 3） 薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法原理：原理：将将1 1cmcm2 20.1mm0.1mm的薄层空间的薄层空间划分为划分为400400小格，从中均匀分布地小格，从中均匀分布地选取选取8080或或100100小格，计数其中的细小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。胞数。1.1.血球血球/ /

22、细菌计数板法细菌计数板法利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对微生物数量进利用血球计数板或细菌计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积的样品中微生物的数量）。行直接计数（计算一定容积的样品中微生物的数量）。每毫升原液中细菌数（每毫升原液中细菌数（cell / ml）=每小格平均细菌数每小格平均细菌数*稀释倍数稀释倍数*4*106 （血球计数板）（血球计数板）=每中方格平均细菌数每中方格平均细菌数*稀释倍数稀释倍数*1.25*106 （细菌计数板）（细菌计数板）优点优点：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征：快速简便，还可以知道细胞的大小和形态特征缺点：不进行特殊染色时，不

23、能区分死菌与活菌，所计为总菌数；缺点：不进行特殊染色时，不能区分死菌与活菌，所计为总菌数； 不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察； 采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，采用特定的染色技术也可对活菌和死菌分别进行计数，如利用美兰染液可进行酵母的活菌计数。如利用美兰染液可进行酵母的活菌计数。美兰染液美兰染液酵母细胞酵母细胞区分死活细胞区分死活细胞2.2.比浊法比浊法比浊法比浊法：样品中由于菌体细胞对光的消散作用而呈浑浊，细：样品中由于菌体细胞对光的消散作用而呈浑浊，

24、细胞数目越多，对光的消散作用越强，浑浊度越高。胞数目越多，对光的消散作用越强，浑浊度越高。浊度可以浊度可以用比色计或分光光度计测量，以光吸收值来表示用比色计或分光光度计测量，以光吸收值来表示。单细胞生单细胞生物在一定的范围内的光吸收值的大小与液体中细胞数目及细物在一定的范围内的光吸收值的大小与液体中细胞数目及细胞物质量成正比胞物质量成正比，因而可用做溶液中总细胞的计数。检测时，因而可用做溶液中总细胞的计数。检测时需用直接显微镜计数或平板活菌计数法制作标准曲线。需用直接显微镜计数或平板活菌计数法制作标准曲线。该方法缺点是灵敏度差，优点是简便、快速、不干扰或不破该方法缺点是灵敏度差，优点是简便、快

25、速、不干扰或不破坏样品。检测时可使用三角瓶在不同的培养时间重复测定样坏样品。检测时可使用三角瓶在不同的培养时间重复测定样品的浊度，因而广泛地用作生长速率的测定。品的浊度，因而广泛地用作生长速率的测定。3.3.稀释平板计数法稀释平板计数法活菌计数法活菌计数法原理原理：活菌计数法是通过在培养基形成的菌落来间接确定其：活菌计数法是通过在培养基形成的菌落来间接确定其活菌数的方法，也称平板计数法。原理是每个活细菌在适宜活菌数的方法，也称平板计数法。原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（技

26、术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成完成操作），严格无菌操作；操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作品内菌体分布不均匀、以及不当操作4.4.薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少

27、的空气和水中的微生物数目。常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。 二、生物量的测定二、生物量的测定1 1、重量法、重量法（1 1）以）以干重干重/ /湿重湿重 直接衡量微生物群体的生物量；直接衡量微生物群体的生物量；（2 2）通过样品中）通过样品中含量稳定的细胞成分含量稳定的细胞成分，如蛋白质，如蛋白质/ /核酸含量的核

28、酸含量的测定，间接推算微生物群体的生物量；测定，间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状的放线菌和真菌生长情况的有效方法测定多细胞及丝状的放线菌和真菌生长情况的有效方法n将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来, ,然后烘然后烘干干( (干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。一般干重、称重。一般干重为湿重的为湿重的10%10%20%20%，而一个细菌细胞一般重约，而一个细菌细胞一般重约1010-12-121010-13-13g g。n该法适合菌浓较高的样品。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞

29、一般重约举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物液体培养物中细胞浓度达到中细胞浓度达到2109个个/ml时，时，100ml培养物可得培养物可得1090mg干重的细胞。干重的细胞。干重法干重法将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。湿重法湿重法n蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。n一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法等

30、测其总量，再乘以系数等测其总量，再乘以系数6.256.25即为粗蛋白含量，蛋白含量即为粗蛋白含量，蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。越高，说明菌体数和细胞物质量越高。n一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%7.5%，霉菌为，霉菌为6.0%6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.256.25，就可，就可测得粗蛋白的含量。测得粗蛋白的含量。测含氮量测含氮量微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的生长成正相关。等与其群体

31、的生长成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此的样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此的可借助特定仪器如瓦勃氏呼吸仪等设备来测定相应的指标。可借助特定仪器如瓦勃氏呼吸仪等设备来测定相应的指标。DNADNA含量测定法含量测定法 微生物细胞的微生物细胞的DNADNA含量比较稳定，采用适当的荧光指示剂含量比较稳定，采用适当的荧光指示剂与菌体与菌体DNADNA作用，荧光比色或分光光度计法测作用，荧光比色或分光光度计法测DNADNA含量。含量。其它生理指标其它生理指标 环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生

32、长、繁殖等特征的改变，或抵抗、适应环境条件方生理、生长、繁殖等特征的改变，或抵抗、适应环境条件方面的改变。当环境条件的变化超过一定能够界限，则导致微面的改变。当环境条件的变化超过一定能够界限，则导致微生物的死亡。生物的死亡。一、营养物质一、营养物质二、水活度二、水活度三、温度三、温度四、四、pH五、氧五、氧影响微生物生长的环境因素主要有：影响微生物生长的环境因素主要有： 水活度（水活度（aw）可定量表示环境中微生物可实际利用的自由可定量表示环境中微生物可实际利用的自由水水(游离水游离水)的含量的含量各种微生物生长繁殖的各种微生物生长繁殖的aw范围在范围在0.600.998之间。除少数真菌之间。

33、除少数真菌外，多数微生物在外，多数微生物在aw 低于低于0.600.70的干燥条件下不能生长。的干燥条件下不能生长。 利用干燥来保存食品、衣物等的原理：低利用干燥来保存食品、衣物等的原理：低aw可防止微生物可防止微生物生长。生长。各种微生物对干燥的抵抗力不同。各种微生物对干燥的抵抗力不同。 如：醋酸菌失水后很快会死亡；但酵母菌可保存数月；如：醋酸菌失水后很快会死亡；但酵母菌可保存数月； 产生荚膜的细菌的抗干燥能力较强；产生荚膜的细菌的抗干燥能力较强； 细胞小形、厚壁的细菌抗干燥能力较强。细胞小形、厚壁的细菌抗干燥能力较强。 细菌芽孢、放线菌孢子、酵母菌子囊孢子、霉菌孢子抗细菌芽孢、放线菌孢子、

34、酵母菌子囊孢子、霉菌孢子抗干燥能力强，在干燥条件下可长期不死，可用于菌种保藏。干燥能力强，在干燥条件下可长期不死，可用于菌种保藏。 最低生长温度最低生长温度能生长的最低温度能生长的最低温度最适生长温度最适生长温度生长速度最高的温度生长速度最高的温度最高生长温度最高生长温度能生长的最高温度能生长的最高温度最适生长温度并非等于最适发酵温度，或生长得率最高时的温度。最适生长温度并非等于最适发酵温度，或生长得率最高时的温度。例：乳酸链球菌的生长最适温度为例：乳酸链球菌的生长最适温度为34， 发酵产酸最快的温度为发酵产酸最快的温度为30生长温度生长温度三基点三基点温度对微生物生长的影响：温度对微生物生长

35、的影响：1 1）影响酶的活性）影响酶的活性 ：酶促反应中每种酶都有最适酶促反应温：酶促反应中每种酶都有最适酶促反应温度，温度变化影响酶促反应速率；度，温度变化影响酶促反应速率；2 2）影响细胞质膜的流动性）影响细胞质膜的流动性 ：温度高流动性大，有利于物：温度高流动性大，有利于物 质的运输；质的运输；3 3）影响物质的溶解度）影响物质的溶解度 温度上升物质的溶解度增加；温度上升物质的溶解度增加；pH = - - lg H+微生物生长的微生物生长的pHpH值范围值范围每一种微生物都存在生长每一种微生物都存在生长pHpH的三基点：的三基点：最适生长最适生长pHpH 最适发酵最适发酵pHpH从而影响

36、微生物的生长速率从而影响微生物的生长速率最低生长最低生长pHpH；最适生长最适生长pHpH；最高生长最高生长pHpH；EgEg：大肠杆菌：大肠杆菌 最低最低pH4.3 , pH4.3 , 最适最适pH6.0-8.0 , pH6.0-8.0 , 最高最高pH9.5pH9.5嗜碱微生物嗜碱微生物: :喜欢偏碱环境，多数细菌、放线菌喜欢偏碱环境，多数细菌、放线菌 细菌：最适细菌：最适pH7.0-8.0 pH7.0-8.0 放线菌放线菌:7.:7.0-8.00-8.0嗜酸微生物嗜酸微生物：适合偏酸环境，多数真菌和酵母菌适合偏酸环境，多数真菌和酵母菌 霉菌：最适霉菌：最适pH3.8-6.0 pH3.8-

37、6.0 酵母菌酵母菌: 4.0-5.8 4.0-5.8 耐碱微生物耐碱微生物：pHpH9 9可生活可生活, ,如脱氮硫杆菌如脱氮硫杆菌pH11pH11下可生活下可生活耐酸微生物：耐酸微生物：pHpH4 4可生活，如氧化硫硫杆菌可生活，如氧化硫硫杆菌pH1pH1下可生活下可生活微生物的类型（按最适生长微生物的类型（按最适生长pHpH范围来分）范围来分） 不同微生物最适生长不同微生物最适生长pH可能不同，同种微生物在不同生长可能不同，同种微生物在不同生长阶段和不同生理、生化过程中，也有不同的最适阶段和不同生理、生化过程中，也有不同的最适pH要求。要求。 黑曲霉：在黑曲霉：在pH2.02.5时，有利

38、于合成柠檬酸，时，有利于合成柠檬酸， 在在pH2.56.5范围内，就以菌体生长为主，范围内，就以菌体生长为主， 在在pH7左右时，则大量合成草酸。左右时，则大量合成草酸。丙酮丁醇梭菌：在丙酮丁醇梭菌：在pH5.57.0内，以菌体生长繁殖为主，内，以菌体生长繁殖为主， 在在pH4.35.3范围内进行丙酮、丁醇发酵。范围内进行丙酮、丁醇发酵。 无论微生物生长的无论微生物生长的pH范围多广泛，细胞内的范围多广泛，细胞内的pH一般都接一般都接近中性。胞内酶的最适近中性。胞内酶的最适pH也接近中性，而位于周质空间的酶也接近中性，而位于周质空间的酶和分泌到细胞外的胞外酶的最适和分泌到细胞外的胞外酶的最适p

39、H则接近环境的则接近环境的pH。 微生物的代谢对环境微生物的代谢对环境pHpH影响影响微生物生长环境微生物生长环境pHpH调节措施调节措施“治标治标” 外源直接流加酸、碱中和外源直接流加酸、碱中和（直接，快速但不能持久）直接，快速但不能持久）“治本治本”治本：（缓慢，但较持久）治本：（缓慢，但较持久）过酸过酸加适当氮源加适当氮源（尿素、尿素、NaNONaNO3 3、NHNH4 4OHOH或蛋白质）或蛋白质）提高通气量提高通气量过碱过碱加适当碳源加适当碳源（糖、乳酸、醋酸或油脂等糖、乳酸、醋酸或油脂等）降低通气量降低通气量pHpH调节调节根据微生物与氧的关系，可将微生物分为好氧和厌氧两大类。根据

40、微生物与氧的关系，可将微生物分为好氧和厌氧两大类。 必须在高浓度分子氧条件下（必须在高浓度分子氧条件下（20%20%以上）生长。以上）生长。（绝大多数真菌，多数放线菌，部分细菌）（绝大多数真菌，多数放线菌，部分细菌）不需氧可生长，而在有氧条件下生长更好不需氧可生长，而在有氧条件下生长更好 （酵母菌，许多细菌）（酵母菌，许多细菌）只能在较低的氧浓度（只能在较低的氧浓度（2 2-10%-10%）下生长）下生长 （弯曲杆菌）（弯曲杆菌）不需要氧，只以发酵产能，但氧无毒害作用不需要氧，只以发酵产能，但氧无毒害作用 （乳酸杆菌，肠膜明串珠菌，粪肠球菌）（乳酸杆菌，肠膜明串珠菌，粪肠球菌）专性厌氧菌专性厌

41、氧菌只能在无氧条件下生长，有氧时即被杀死只能在无氧条件下生长，有氧时即被杀死（拟杆菌，梭菌属，双歧杆菌属，甲烷菌）（拟杆菌，梭菌属，双歧杆菌属，甲烷菌）u专性好氧微生物专性好氧微生物 分子氧作为最终电子受体，氧参与合成固醇及不饱和分子氧作为最终电子受体，氧参与合成固醇及不饱和脂肪酸；细胞含有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。脂肪酸；细胞含有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。 对氧化还原电位的要求：对氧化还原电位的要求： E Eh h+0.1v +0.1v 可生长，最适在可生长，最适在+0.3-0.4v+0.3-0.4v 如：霉菌、大部分放线菌及部分细菌如：霉菌、大部分放线菌及部分细菌u兼性须氧微生物兼性须

42、氧微生物 E Eh h+0.1v +0.1v 通过好氧呼吸获取能量通过好氧呼吸获取能量 E Eh h+0.1v +0.1v 通过发酵或无氧呼吸获取能量通过发酵或无氧呼吸获取能量 细胞含有细胞含有SODSOD和过氧化氢酶和过氧化氢酶 如：许多酵母和细菌如：许多酵母和细菌 酿酒酵母、大肠杆菌、产气杆菌等酿酒酵母、大肠杆菌、产气杆菌等 u微好氧菌微好氧菌 只能在较低的氧分压下才能正常生长；也通过有氧呼吸只能在较低的氧分压下才能正常生长；也通过有氧呼吸获取能量。获取能量。 如：霍乱弧菌、氢单胞菌属等如：霍乱弧菌、氢单胞菌属等u耐氧微生物耐氧微生物 一类可在分子氧存在条件下进行厌氧生活的厌氧菌。仅一类可

43、在分子氧存在条件下进行厌氧生活的厌氧菌。仅依靠发酵获得能量细胞内有依靠发酵获得能量细胞内有SODSOD和过氧化物酶，但无过氧化和过氧化物酶，但无过氧化氢酶。氢酶。 如：乳链球菌、乳酸乳杆菌、膜明串珠菌如：乳链球菌、乳酸乳杆菌、膜明串珠菌u耐氧微生物耐氧微生物 一类可在分子氧存在条件下进行厌氧生活的厌氧菌。仅一类可在分子氧存在条件下进行厌氧生活的厌氧菌。仅依靠发酵获得能量细胞内有依靠发酵获得能量细胞内有SODSOD和过氧化物酶，但无过氧化和过氧化物酶，但无过氧化氢酶。氢酶。 如：乳链球菌、乳酸乳杆菌、膜明串珠菌如：乳链球菌、乳酸乳杆菌、膜明串珠菌微生物与氧的关系微生物与氧的关系 类型类型最适生长

44、的最适生长的O O2 2体积体积分数分数代谢类型代谢类型好好 氧氧专性好专性好氧氧等于或大于等于或大于20%20%有氧呼吸有氧呼吸兼性好兼性好氧氧有氧或无氧有氧或无氧有氧呼吸；无氧有氧呼吸；无氧呼吸、发酵呼吸、发酵微好氧微好氧2-10%2-10%有氧呼吸有氧呼吸厌厌氧氧耐氧厌耐氧厌氧氧不需要氧，但有不需要氧，但有O O2 2存在无害存在无害发酵发酵专性厌专性厌氧氧不需要氧，有氧时不需要氧，有氧时死亡死亡发酵、无氧呼吸发酵、无氧呼吸第五节第五节 有害微生物的控制有害微生物的控制 在微生物研究、生产实践与现实生活中，我在微生物研究、生产实践与现实生活中，我们需要控制所不期望的微生物的生长。任何杀死

45、们需要控制所不期望的微生物的生长。任何杀死或抑制微生物生长的方法都可以达到控制微生物或抑制微生物生长的方法都可以达到控制微生物生长的目的，他们包括加热、低温、干燥、辐射、生长的目的，他们包括加热、低温、干燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗等过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗等化学方法两大类。化学方法两大类。控制微生物的生长速率或消灭不需要微生物的几种措施：控制微生物的生长速率或消灭不需要微生物的几种措施：消毒消毒 ：利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或：利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或动植物有害的病原菌，对被消毒对象基本无害的措施。动植物有害的病原

46、菌，对被消毒对象基本无害的措施。包括化学消毒剂和巴氏消毒法等。包括化学消毒剂和巴氏消毒法等。 灭菌灭菌 :采用强烈理化因素，使物体内外包括芽孢在内的所有微采用强烈理化因素，使物体内外包括芽孢在内的所有微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。包括杀菌和溶菌等生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。包括杀菌和溶菌等手段。手段。 化疗：即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质，抑化疗：即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质，抑制或杀死宿主体内病原微生物，对宿主本身没有或基本制或杀死宿主体内病原微生物，对宿主本身没有或基本没有毒害作用的一种治疗措施。没有毒害作用的一种治疗措施。防腐：在某些理化因素作用下抑

47、制霉腐微生物的生长繁殖，防腐：在某些理化因素作用下抑制霉腐微生物的生长繁殖，以防止食品和其他物品等发生霉腐的措施。防腐方法：以防止食品和其他物品等发生霉腐的措施。防腐方法：低温、干燥、缺氧、高渗、防腐剂等。低温、干燥、缺氧、高渗、防腐剂等。 理化因子抑菌还是杀菌作用的相关因素：理化因子抑菌还是杀菌作用的相关因素：1. 理化因子的性质和作用机制；2.理化因子的强度或浓度；3.同一浓度理化因子作用时间的长短；4.不同种类的微生物；5.同种微生物的不同生长时期；一、控制微生物的物理方法 杀灭或抑制杀灭或抑制微生物的物理因素微生物的物理因素l 温度温度l 辐射作用辐射作用l 过滤过滤l 渗透压渗透压l

48、 干燥干燥l 超声波超声波（一）（一） 温度温度当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。对微生物产生杀灭作用或抑制作用。高温使高温使蛋白质、核酸蛋白质、核酸等重要生物大分子发生等重要生物大分子发生变性、破坏变性、破坏，以及，以及破坏破坏细胞膜上的类脂细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。成分，导致微生物死亡。1 1、干热灭菌、干热灭菌干热灭菌干热灭菌烘箱内热空气灭菌烘箱内热空气灭菌火焰灼烧法火焰灼烧法170 170 ，1 1小时小时160 160 ，2 2小时小时121 121 ，1616小时小时

49、干热灭菌原理：干热灭菌原理：破坏细胞膜、蛋白质变性、原生质干燥、破坏细胞膜、蛋白质变性、原生质干燥、 高温下的氧化作用。高温下的氧化作用。2 2、湿热灭菌、湿热灭菌湿热灭菌：是利用热蒸汽灭菌，在同样的温度和相同作用湿热灭菌：是利用热蒸汽灭菌，在同样的温度和相同作用时间下，效果要好于干热灭菌。因为：时间下，效果要好于干热灭菌。因为：湿热蒸汽穿透力强湿热蒸汽穿透力强能破坏维持蛋白质空间结构和氢健的稳定性，加速这一能破坏维持蛋白质空间结构和氢健的稳定性，加速这一重要生命大分子物质的变性。重要生命大分子物质的变性。蒸汽存在潜热，当气体变为液体时可释放出大量热量，蒸汽存在潜热，当气体变为液体时可释放出大

50、量热量，能迅速提高灭菌物体的温度。能迅速提高灭菌物体的温度。湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件多数细菌和真菌的营养细胞：在多数细菌和真菌的营养细胞：在6060左右处理左右处理5-105-10分钟；分钟； 酵母菌和真菌的孢子：用酵母菌和真菌的孢子：用8080以上温度处理；以上温度处理； 细菌的芽孢：细菌的芽孢：121121处理处理1515分钟可被杀死；分钟可被杀死；1 1）巴氏消毒法）巴氏消毒法2 2）煮沸消毒法）煮沸消毒法3 3）间歇灭菌法）间歇灭菌法常常压压法法适用于牛奶、啤酒、果酒和饮料等液态食品适用于牛奶、啤酒、果酒和饮料等液态食品低温维持（低温维持（LTH

51、）法法 ： 63 ，30min 高温瞬时（高温瞬时（HTST）法：法： 72 ，15s 目前一般都采用超高温灭菌法：目前一般都采用超高温灭菌法：135150，26s 用较低的温度处理不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料，以用较低的温度处理不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料，以杀灭其中的无芽孢病原菌，又不影响其原有风味的消毒方法。杀灭其中的无芽孢病原菌，又不影响其原有风味的消毒方法。 巴氏消毒条件：巴氏消毒条件： 采用在采用在100100下煮沸下煮沸3030分钟的方法，可杀死细菌的营养细胞和部分分钟的方法，可杀死细菌的营养细胞和部分芽孢，一般用于饮用水的消毒。芽孢，一般用于饮用水的消毒。 分段

52、灭菌法，适用于不耐热培养基（如含硫培养基）。分段灭菌法，适用于不耐热培养基（如含硫培养基）。80100 下下蒸煮蒸煮1560min，然后在然后在37 下保温过夜，如此重复下保温过夜，如此重复23次。次。4 4）常规高压灭菌）常规高压灭菌5 5）连续加压灭菌）连续加压灭菌加加压压法法 利用提高压力使水的沸点升高，以提高水蒸气的温度，从而有利用提高压力使水的沸点升高，以提高水蒸气的温度，从而有效地杀灭微生物。效地杀灭微生物。0.1MPa（121），），1530min适用于各种耐热耐湿物品的灭菌，如一般培养基、生理盐水等各种适用于各种耐热耐湿物品的灭菌，如一般培养基、生理盐水等各种溶液、工作服及实验

53、器材等。溶液、工作服及实验器材等。 用于大规模发酵工厂的大批量培养基的灭菌。让培养基在管道用于大规模发酵工厂的大批量培养基的灭菌。让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却。一般加热至的流动过程中快速升温、维持和冷却。一般加热至135140下维下维持持515s。优点：优点： 灭菌彻底，有效减少营养成分的破坏，提高原料利用率。灭菌彻底，有效减少营养成分的破坏，提高原料利用率。灭菌时间短，蒸汽负荷均衡，提高锅炉利用率，适宜于自动化操作灭菌时间短，蒸汽负荷均衡，提高锅炉利用率，适宜于自动化操作（二）（二） 辐射辐射 辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电

54、磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波，紫外线用于灭菌的电磁波有微波，紫外线( (UV)UV)、X-X-射线和射线和-射线等射线等用于灭菌的电磁波有用于灭菌的电磁波有: :微波微波: :通过热产生杀死微生物的作用；通过热产生杀死微生物的作用；紫外线紫外线( (UV):UV):使使DNADNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNADNA复制与转录等功能，杀死微生物；复制与转录等功能，杀死微生物；X X射线和射线和y y射线射线: :使其他物质氧化或产生自由基使其他物质氧化或产生自由基( (OHOH、H H

55、) )破坏和破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。 （三）过滤（三）过滤原理：原理：气体或液体中微生物被微孔过滤介质除去。气体或液体中微生物被微孔过滤介质除去。用具：用具：滤膜过滤装置、石棉板过滤器和硅藻土过滤器等。滤膜过滤装置、石棉板过滤器和硅藻土过滤器等。适用：适用：对热不稳定的物质对热不稳定的物质对于蛋白质、酶、血清、维生素对于蛋白质、酶、血清、维生素等热敏性物质，常采用过滤除菌法。等热敏性物质，常采用过滤除菌法。（四）干燥和渗透压（四）干燥和渗透压通过降低微生物可利用水的数量或活度而影响微生物的生长。通过降低微生物可利用水的数量或活度

56、而影响微生物的生长。1.1.干燥：干燥：使细胞失水造成代谢停止而抑制微生物生长，有时使细胞失水造成代谢停止而抑制微生物生长，有时也可引起某些微生物细胞的死亡也可引起某些微生物细胞的死亡。2.2.渗透压：渗透压：通过限制微生物可利用水而控制其生长的方法。通过限制微生物可利用水而控制其生长的方法。高渗环境中，水从细胞中流出，是细胞脱水。高渗环境中，水从细胞中流出，是细胞脱水。（五）超声波（五）超声波空穴作用空穴作用，可用于破碎细胞或者灭菌。，可用于破碎细胞或者灭菌。二、控制微生物的化学方法一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质 。 抗微抗微生物剂生物剂 表面消毒剂表面消毒剂（非选择性，对所有细胞均有毒性非选择性，对所有细胞均有毒性） 化学治疗剂化学治疗剂（有选择性，对病原微生物毒性更强有选择性，对病原微生物毒性更强）消毒剂消毒剂防腐剂防腐剂抗代谢药物抗代谢药物抗生素抗生素消毒剂：消毒剂：可抑制或杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌可抑制或杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。或消毒。防腐剂：防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组能