动物细胞与组织培养技术

1、会计学1动物细胞与组织培养技术动物细胞与组织培养技术 v分类： 细胞培养 组织培养 器官培养有限细胞系有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的细胞株不能连续培养的细胞株。无限细胞系无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细胞株，能够连续培养的细胞株，也称无限系。也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。可能已成为恶性细胞。细胞株、细胞系的命名：细胞株、细胞系的命名：l以组织来源定名，如以组织来源定名，如BHK(BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞) )l以人名定名，

2、如以人名定名，如HeLaHeLa细胞细胞l以时间地点来定名，如以时间地点来定名，如S7811S7811细胞系细胞系l以临床疾病类型定名，如以临床疾病类型定名，如BALL-1BALL-1细胞系细胞系( (来自来自B B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性白血病人白细胞) ) )用于生产的用于生产的动物细胞株动物细胞株原代细胞原代细胞二倍体细胞二倍体细胞融合细胞融合细胞基因工程细胞基因工程细胞转化细胞转化细胞常用细胞株：常用细胞株：CHO细胞、细胞、Vero细胞、细胞、BHK-21细胞、细胞、WI-38细胞细胞平滑肌细胞平滑肌细胞神经元细胞神经元细胞血红细胞血红细胞形态上表现为形态上表现为多种多

3、样，如多种多样，如圆形、椭圆形圆形、椭圆形、正方形、柱、正方形、柱形、扁平形、形、扁平形、梭形、星形和梭形、星形和多边形等多边形等v维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。响，甚至死亡。 培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；v人体细胞在人体细胞在39-401小时，即能受到一定

4、损伤，但仍有可能恢复；小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；v在在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；v41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；复可能；v当温度在当温度在43以上以上1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低温下会使细胞代谢速率降低低（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 （二）培养细胞的生长特点（二）培养细胞的生长特点（三）（三）培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖

5、过程非贴壁依赖型非贴壁依赖型成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 于悬浮状态下于悬浮状态下即可生长即可生长 贴附于支持物表面贴附于支持物表面才能生长的细胞才能生长的细胞 人的成纤维细胞人的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞人骨髓间充质细人骨髓间充质细胞（胞（MSCMSC）大鼠血管平滑肌细胞大鼠血管平滑肌细胞成纤维细胞型成纤维细胞型单层扁平上皮细胞单层扁平上皮细胞人口腔皮样癌细胞人口腔皮样癌细胞人宫颈癌上皮细胞（人宫颈癌上皮细胞（HelaHela）成骨肉瘤细胞成骨肉瘤细胞(多角形多角形

6、)上皮细胞型上皮细胞型奶牛肾脏上皮细胞奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型上皮细胞型)不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。似多角型或成纤维细胞形态。如

7、单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。单 核 巨 噬 细 胞1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。、细胞胞质常伸出伪足和突起。3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。方向不规则。4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。单核巨噬细胞（未刺激状态）单核巨噬细胞（未刺激状态）游走细胞型游走细胞型单核巨

8、噬细胞（活化剂刺激单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足后）：向四周伸展伪足需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在2 2种及其以上种及其以上细胞形态；其影响因素包括（细胞形态；其影响因素包括（1 1）不同来源细胞细胞形态学表现）不同来源细胞细胞形态学表现不同；（不同；（2 2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成分，培养基，温气环境等分，培养基，温气环境等神经细胞（神经细胞（DAB显色）显色）多形型细胞多形型细胞神经细胞神经细胞大鼠大鼠 海马神经细胞海马神经细胞(二）培养细胞的生长

9、特点二）培养细胞的生长特点贴附和伸展贴附和伸展接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上 悬浮的圆形细胞与底物附着悬浮的圆形细胞与底物附着 细胞将伸展成其原来的形态细胞将伸展成其原来的形态。贴附过程贴附过程 体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段 原代培养期原代培养期 传代期传代期 衰退期衰退期 2、细胞系的生长过程：细胞系的生长过程： 结果：细胞群体中具有迅结果：细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占速增殖能力的细胞将渐占优势而非增殖的或增殖缓优势而非增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。慢的细胞将被减

10、弱。 3、每代细胞的生长过程、每代细胞的生长过程在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中称为接种。开而移至新的培养皿中称为接种。 细胞细胞”一代一代”：仅指从细胞接种到分离再培养的一：仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。段时间。潜伏期潜伏期每代细胞的生长阶段每代细胞的生长阶段：指数生长期指数生长期 停止期停止期一、体外培养的一般过程一、体外培养的一般过程二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法 三、动物细胞大规模培养技术三、动物细胞大规模培养技术 四、动物细胞体外培养举例四、动物细胞体外培养举例 五、动物细胞体外

11、培养现状与展望五、动物细胞体外培养现状与展望动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬液细胞悬液胰蛋白酶胰蛋白酶1代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维） 动物细胞培养的基本过程动物细胞培养的基本过程过程过程 组织组织取材取材 组织细胞的分离分离 培养培养 机械法机械法 消化法消

12、化法 机机械械法法分分离离胚胚胎胎 （一）取材（一）取材 基本步骤：无菌取出目的组织基本步骤：无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成用利刀无菌切割成1 12mm2mm小块小块 以以HanksHanks液漂洗干净液漂洗干净, ,低速离心，弃上清低速离心，弃上清 移入培养瓶，加入适当培养基浸润移入培养瓶，加入适当培养基浸润 培养瓶翻转培养瓶翻转1801800 0，置，置15153030分，使其贴壁分，使其贴壁 培养瓶翻回，置于培养瓶翻回，置于3737培养培养（1）组织块培养）组织块培养 组织块培养法组织块培养法 a：取材修剪冲洗：取材修剪冲洗b：剪切成：剪切成1mm3左右的小块左右的小块c：移入培养瓶

13、：移入培养瓶d：分布组织小块间距：分布组织小块间距5mme：翻转培养瓶并加培养液：翻转培养瓶并加培养液37静止静止1-2hf：翻正培养瓶进行培养：翻正培养瓶进行培养g：原代细胞生长：原代细胞生长 取材分离和组织消化取材分离和组织消化 无菌取出目的组织无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成细块用利刀无菌切割成细块 胰蛋白酶液消化胰蛋白酶液消化 Hanks Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清液漂洗两次，低速离心弃上清 吸管吹打分散细胞吸管吹打分散细胞 移入培养瓶薄层培养移入培养瓶薄层培养(2)组织消化培养组织消化培养 加入加入30-50倍体积倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液浓度胰蛋白酶溶液3737消

14、化消化30-60min30-60min，每，每5-10min5-10min摇动一次摇动一次相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用特点选择使用基本步骤：基本步骤： 吸出培养瓶内旧培养液吸出培养瓶内旧培养液 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混和液混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）以能覆盖整个瓶底为准） 吸出消化液，加入培养液终止消化吸出消化液，加入培养液终止消化 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 重新接种重新接种

15、于新的培养瓶内于新的培养瓶内1）贴壁生长细胞传代）贴壁生长细胞传代 培养培养2）悬浮生长细胞传代）悬浮生长细胞传代离心法传代离心法传代 直接传代法直接传代法 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分-800g）去）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除将上清培养液去除l2一一23，然后用，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。1)传统方法：冷存管置于传统方法：冷存管置于410分钟分钟 -2030分钟分钟 -801618小时小时(或

16、隔夜或隔夜)液氮槽长期储存。液氮槽长期储存。-20不可超过不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟分钟之速度由室温降至之速度由室温降至(-80以下以下)-120，再放在液氮长期储存。，再放在液氮长期储存。适用于悬浮型细胞与适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。之保存。 悬浮细胞培养瓶滚动培养瓶滚动培养瓶6、克隆培养法、克隆培养法就是将

17、细胞悬液中获得的单个细胞用于培养就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术技术 过程过程:制细胞悬液制细胞悬液连续稀释获得单细胞连续稀释获得单细胞单细胞接种单细胞接种培养培养细胞株细胞株 :由细胞系进一步克隆化，而获得由细胞系进一步克隆化，而获得的由单一细胞形成的细胞群体。的由单一细胞形成的细胞群体。 固定化培养固定化培养2 2、悬浮培养技术、悬浮培养技术适于少数悬浮生长型细胞适于少数悬浮生长型细胞微载体系统培养细胞具体步骤微载体系统培养细胞具体步骤 p110选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型浸泡水化及消毒浸泡水

18、化及消毒接种接种培养观察和细胞计数培养观察和细胞计数消化消化分离细胞分离细胞传代培养传代培养交联葡萄糖交联葡萄糖DEAE-DEAE-纤维素纤维素蛋白质：变性胶原蛋白质：变性胶原高分子材料：硅胶、聚丙烯酰高分子材料：硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯胺、聚苯乙烯无机玻璃基质无机玻璃基质常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 n多孔载体培养多孔载体培养优点：易固定化、比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可优点：易固定化、比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可以提高通气量，强化传质。适用于贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连以提高通气量，强化传质。适用于

19、贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连续灌流培养和大规模高密度培养系统。续灌流培养和大规模高密度培养系统。多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性（三）动物细胞大规模培养操作方式（三）动物细胞大规模培养操作方式 1.分批式操作分批式操作 2.流加式操作流加式操作 3.半连续式操作半连续式操作 4.连续式操作连续式操作 5.灌流式操作灌流式操作 优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低.优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下优点：