动物细胞培养

1、1会计学动物细胞培养动物细胞培养2牛牛文库文档分享（一）贴附型细胞：（一）贴附型细胞：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞贴附贴附: :是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式在方式结果结果: : 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须织，有机体的绝大多数细胞必须贴附贴附于一于一固相表面固相表面才能才能生生存存和和生长生长。培养时：培养时：这些细胞被放到体外环境中以后这些细胞被放到体外环境中以后, ,同样需要贴附

2、于同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞属于贴附型细胞贴附贴附( (锚定或锚着锚定或锚着) )依赖型依赖型( (性性) )细胞细胞牛牛文库文档分享细胞在体内、外的贴附方式存在差异细胞在体内、外的贴附方式存在差异体内：体内：贴附是全方位贴附是全方位, ,外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征体外：体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同形一般与体内时明显不同贴附的固相表面：贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为按照培养细胞的主要形态，可分

3、为四大类型四大类型 牛牛文库文档分享1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型：牛牛文库文档分享名称：名称：成纤维细胞成纤维细胞来源：来源：由中胚层间充质组织起源的组织由中胚层间充质组织起源的组织真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮血管内皮形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出三角形，胞质向外伸出2323个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞-

4、-细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起样细胞，常有几个伸长的细胞突起牛牛文库文档分享2 2、上皮细胞型、上皮细胞型牛牛文库文档分享名称：名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源于外胚层、内胚层细胞, , 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, , 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核有圆形核 生长特点：生长特点：易相

5、连成片，相靠易相连成片，相靠紧密相连成薄层紧密相连成薄层铺石铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动牛牛文库文档分享3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。其他细胞相区别。4 4、多形型细胞：、多形型细胞：有一些细胞，如神经细胞难以确定有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。其规律和稳定的形态，可统归于此类。 牛牛文

6、库文档分享（二）悬浮型细胞：（二）悬浮型细胞：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。类细胞容易大量繁殖。来源：来源：血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞特点：特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形、单个或小细胞在悬浮中生长良好，细胞圆形、单个或小细胞团团优点：优点：生存空间大，提供数量大，传代方便生存空间大，提供数量大，传代方便( (不需消不需消化化) )，易于收获，可获得稳定状态，易于收获，可获得稳定状态缺

7、点：缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享12牛牛文库文档分享细胞贴壁过程牛牛文库文档分享14 2. 2.接触抑制接触抑制 细胞接触细胞接触停止移动停止移动 正常细胞成单层生长正常细胞成单层生长 肿瘤细胞无接触抑制肿瘤细胞无接触抑制，可，可以堆积生长。以堆积生长。 接触抑制可作为区分正常细胞接触抑制可作为区分正常细胞与癌细胞的标志之一与癌细胞的标志之一牛牛文库文档分享15 3. 3.密度抑制密度抑制 细胞增殖，密度加大，培养液细胞增殖，密度加大，培养液营养成分消耗，细胞代谢物增营养成分消耗，细胞代谢物增多，导致发生

8、密度抑制，细胞多，导致发生密度抑制，细胞分裂停止分裂停止牛牛文库文档分享培养细胞的生长和增殖过程（一）单个细胞的生长过程（二）细胞系的生长过程（三）每代细胞的生长过程牛牛文库文档分享（一）单个细胞的生长过程牛牛文库文档分享（二）细胞系的生长过程培养细胞的生命期：培养细胞的生命期：是指细胞在培养中持续增是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括殖和生长的时间。包括原代培养期、传代期及衰退原代培养期、传代期及衰退期。期。牛牛文库文档分享细胞的生长曲线细胞的生长曲线牛牛文库文档分享1 1原代培养期：原代培养期：从体内取出组织从体内取出组织, ,接种培养到第一次传代阶段（接种培养到第一次传代阶段（初代

9、培养）初代培养）特点特点：1-41-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈性大、多呈二倍体核型二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。胞独立生存性差。牛牛文库文档分享2 2传代期：传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系细胞系。在全。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，情况下，细胞增殖旺

10、盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系二倍体细胞系。为保持二。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代期冻存。一般情况下当传代10105050次左右，细胞次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 牛牛文库文档分享3 3衰退期：衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期在细胞生命期阶

11、段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发生自发转化转化。转化的标志之一是细胞可能获得。转化的标志之一是细胞可能获得永生性永生性或或恶性性恶性性。牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享（三）每代细胞的生长过程所谓细胞的所谓细胞的“一代一代”是指从细胞接种到分是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。这已成为培养工作中离再培养的一段时间。这已成为培养工作中的一种习惯说法，它的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一与细胞倍增一代非同一含义含义。如某一细胞系为第。如某一细胞系为第153153代细胞，即指代细胞，即指该细胞系已传代该细胞系已传代

12、153153次。它与细胞世代或倍次。它与细胞世代或倍增不同；在增不同；在细胞一代中，细胞能倍增细胞一代中，细胞能倍增3 36 6次次。牛牛文库文档分享25牛牛文库文档分享1 1潜伏期潜伏期游离游离: :悬浮悬浮, ,胞质回缩胞质回缩, , 全部细胞全部细胞变为圆球形变为圆球形吸附吸附: :贴附底物贴附底物, ,一般一般2424小时内贴小时内贴壁壁潜伏潜伏: :可有运动活动可有运动活动, ,基本无增基本无增殖殖, , 少见分裂相少见分裂相 牛牛文库文档分享2 2指数生长期：指数生长期：细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。细胞细胞活力最旺盛活力最旺盛的阶段，

13、培养物中的阶段，培养物中细胞数量细胞数量呈指数增长呈指数增长, ,细胞群体均一，是理想的实验用细胞群体均一，是理想的实验用细胞细胞接触抑制：细胞运动停止接触抑制：细胞运动停止密度抑制：细胞终止分裂密度抑制：细胞终止分裂牛牛文库文档分享3 3停止期：停止期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期，也称入停止期，也称平台期平台期。停滞期细胞虽不增。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、趋耗尽，代谢产物积累、pHpH降低。此时需降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生做

14、分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡形态改变，重则从底物脱落死亡牛牛文库文档分享潜伏期潜伏期指数生长期指数生长期停止期停止期牛牛文库文档分享培养细胞的遗传学特征（一）染色质与染色体：（一）染色质与染色体： 正常细胞：二倍体正常细胞：二倍体 细胞发生转化：多倍体或异倍体细胞发生转化：多倍体或异倍体（二）细胞性别（二）细胞性别 女性：女性：BarrBarr小体小体 男性：男性：Y Y小体小体牛牛文库文档分享体内外细胞的差异及培养细胞的分化 经多次传代增殖后，培养细胞将失去原有经多次传代增殖后，培养细胞将失去原有的组织结构和细胞形态，分化逐渐减弱或的组织结构和细胞形态，分

15、化逐渐减弱或不显。形态与功能逐渐单一化，细胞衰老不显。形态与功能逐渐单一化，细胞衰老或死亡，或发生转化，获得不死性或恶性或死亡，或发生转化，获得不死性或恶性性。性。牛牛文库文档分享32牛牛文库文档分享33牛牛文库文档分享34牛牛文库文档分享35牛牛文库文档分享36牛牛文库文档分享1. 1. 天然培养基天然培养基37牛牛文库文档分享38牛牛文库文档分享2. 2. 合成培养基合成培养基39牛牛文库文档分享40牛牛文库文档分享3.3.无血清培养基无血清培养基41牛牛文库文档分享42牛牛文库文档分享43牛牛文库文档分享44牛牛文库文档分享45牛牛文库文档分享46牛牛文库文档分享影响动物细胞培养的因素影

16、响动物细胞培养的因素 （1 1）温度）温度 ：哺乳动物最适温度哺乳动物最适温度36.536.50.5 0.5 ；对低温耐受性比高温强。对低温耐受性比高温强。 （2 2）p pH H：甚至死亡。甚至死亡。偏酸性耐受较强，偏碱性很偏酸性耐受较强，偏碱性很快死亡。快死亡。 （3 3）气体）气体：O O2 2；COCO2 2，还可调节，还可调节p pH H。 （4 4）渗透压）渗透压：不同细胞要求不同。不同细胞要求不同。47牛牛文库文档分享48牛牛文库文档分享动物细胞体外培养的特点动物细胞体外培养的特点: :牛牛文库文档分享幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养养单个细胞牛牛文库文档分享

17、转入培养液中进行转入培养液中进行原代培养原代培养牛牛文库文档分享52牛牛文库文档分享过程过程 组织组织取材取材 组织细胞的分离分离 培养培养 机械法机械法 消化法消化法 牛牛文库文档分享动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬液细胞悬液胰蛋白酶胰蛋白酶1 1代细胞代细胞原代培养原代培养5050代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液动物组织细胞间隙动物组织细胞间隙中含有一定量的弹中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形将细胞网络起来形成具有一定弹性和成具有一定弹性和韧性的组织和器官韧性的组织和器官。（分解弹性

18、纤维）（分解弹性纤维）牛牛文库文档分享55牛牛文库文档分享56牛牛文库文档分享机机械械法法分分离离胚胚胎胎 牛牛文库文档分享58牛牛文库文档分享59 （二）组织细胞的分离（二）组织细胞的分离 有有机械法机械法和和消化法消化法两大类两大类 1. 1.机械法：机械法： 离心分离法：离心分离法：适用于细胞悬液组织。适用于细胞悬液组织。500-1000rpm500-1000rpm离心离心5-10min5-10min。 切割分离法：切割分离法：用剪刀剪切成用剪刀剪切成1mm1mm3 3左右的小块。左右的小块。 机械分散法：机械分散法：挤压和研磨，适用于纤维含量少的挤压和研磨，适用于纤维含量少的组织。组织

19、。牛牛文库文档分享60 （二）组织细胞的分离（二）组织细胞的分离 2. 2.消化法：可使组织疏松，细胞分开，细胞容易消化法：可使组织疏松，细胞分开，细胞容易生长，成活率高。生长，成活率高。 胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：适于消化细胞间质较少的适于消化细胞间质较少的软组织，对传代细胞也适用。使用浓度一般为软组织，对传代细胞也适用。使用浓度一般为0.1%-0.5%0.1%-0.5%，用不含钙、镁离子的，用不含钙、镁离子的BSSBSS配制，配制，PH8-9PH8-9。血清有抑制其活性作用。血清有抑制其活性作用。 胰蛋白酶消化法有热胰蛋白酶消化法有热(37)(37)和冷和冷(4 )(4 )两种处理两

20、种处理。牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享62 胶原酶消化法：胶原酶消化法：胶原酶是由细菌中提取出的胶原酶是由细菌中提取出的酶，适用于消化纤维组织、上皮组织或胶原成酶，适用于消化纤维组织、上皮组织或胶原成分的组织。可用含钙、镁离子的分的组织。可用含钙、镁离子的BSSBSS配制或溶配制或溶于含血清的培养液中。使用浓度一般为于含血清的培养液中。使用浓度一般为0.1-0.1-0.3mg/mL0.3mg/mL，3737温育。温育。 优点：消化缓和、无需机械振荡优点：消化缓和、无需机械振荡 缺点：价格昂贵缺点：价格昂贵 可与胰蛋白酶混用可与胰蛋白酶混用牛牛文库文档分享63其他消化酶消化法其他消化酶消化法：

21、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、透：链霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明质酸酶等。明质酸酶等。螯合剂消化法：螯合剂消化法：常用螯合剂有柠檬酸钠、常用螯合剂有柠檬酸钠、EDTA-EDTA-NaNa2 2等。可用不含钙、镁离子的等。可用不含钙、镁离子的BSSBSS配制成配制成0.02%0.02%溶液溶液。EDTAEDTA适于消化传代细胞，不受血清抑制，消化后适于消化传代细胞，不受血清抑制，消化后需彻底清洗。需彻底清洗。牛牛文库文档分享64 （三）培养方法（三）培养方法 1. 1.组织块培养法组织块培养法：简便，成功率较低：简便，成功率较低牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享66牛牛文库文档分享67牛牛文库文档分享牛牛文库

22、文档分享牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享71牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享悬浮细胞培养瓶悬浮细胞培养瓶滚动培养瓶滚动培养瓶贴壁细胞培养瓶贴壁细胞培养瓶牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享牛牛文库文档分享76牛牛文库文档分享774. 4.克隆培养法克隆培养法：又称单细胞分离培养法，：又称单细胞分离培养法，就是将就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术。繁殖成一个新的细胞群体的培养技术。 细胞株细胞株 : :由由细胞系细胞系进一步克隆化，而获得进一步克隆化，而获得的由的由单一细胞单一细胞形成的细胞群体。形成的细胞群体。

23、 初代细胞和有限细胞系的克隆培养比较困难，初代细胞和有限细胞系的克隆培养比较困难，无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易容易牛牛文库文档分享78牛牛文库文档分享79牛牛文库文档分享80牛牛文库文档分享815. 5.细胞同步化培养细胞同步化培养：用自然的或人工的方法获：用自然的或人工的方法获得细胞周期同步化的细胞群体。得细胞周期同步化的细胞群体。筛选同步化细胞筛选同步化细胞 诱导同步化细胞诱导同步化细胞 M期细胞震荡脱落法期细胞震荡脱落法 离心洗脱法离心洗脱法 梯度沉降法梯度沉降法 血清饥饿法血清饥饿法 异亮氨酸营养缺乏法异亮氨酸营养缺乏法 DNAD

24、NA合成抑制剂阻断法合成抑制剂阻断法 秋水仙素阻断法秋水仙素阻断法 牛牛文库文档分享6. 6.动物细胞的大规模培养动物细胞的大规模培养牛牛文库文档分享1. 1. 分批式操作分批式操作 2. 2. 流加式操作流加式操作 3. 3. 半连续式操作半连续式操作 4. 4. 连续式操作连续式操作 5. 5. 灌流式操作灌流式操作 优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低的准备工作，此期间生产停

25、工。而且收液率低. .优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下生长。生长。缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对设备等要求高。设备等要求高。优点：培养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等优点：培养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等. .6. 6.动物细胞的大规模培养动物细胞的大规模培养牛牛文库文档分享84牛牛文库文档分享85牛牛文库文档分享86牛牛文

26、库文档分享细胞系或细胞株的命名细胞系或细胞株的命名 HeLaHeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHOCHO：中国地鼠卵巢细胞（：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Chinese Hamster OvaryOvary）宫宫-743-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，19741974年年3 3月建立月建立NIH3T3NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National National Institute of HealthInstitute of Health）建立；每）建立；每3 3天传代，每次接天传代，每次

27、接种种3 310105 5细胞细胞mLmL。牛牛文库文档分享细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的鉴定、管理和使用 ATCCATCC入库细胞要求检测项目如下：入库细胞要求检测项目如下：培养简历：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等代数等冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称培养基和防冻液名称细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性融解前后细胞接种存活率和生长特性培培 养养 液：液：培养基种类和名称（一般要求不含抗培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量生素）、血清来源和含量牛牛文库文档分享细胞形态：细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性，融解后细胞生长特性核核 型：型：二倍体或多倍体，标记染色体的有二倍体或多倍体，标记染色体的有无无无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原包括细菌、真菌、支原体、原虫和