第6章_DNA重组与转座!!!!.

1、第第6章章 DNA重组与转座重组与转座概述概述第一节第一节 同源重组同源重组第二节第二节 特异位点重组特异位点重组第三节第三节 DNA的转座的转座第四节第四节 逆转录转座子逆转录转座子 重点内容：重点内容：几个基本概念：同源重组、几个基本概念：同源重组、转座子转座子、插入序插入序列列、复合转座子复合转座子、控制元件、自主控制元件、控制元件、自主控制元件、非自主控制元件、非自主控制元件、逆转录转座子逆转录转座子；转座子的特征转座子的特征；转座子的分类；转座子；转座子的分类；转座子的的转座机理转座机理；转座产生的遗传学效应；转座产生的遗传学效应；概述：概述： 只要有只要有DNA，就会发生重组，就会

2、发生重组减数分裂减数分裂高等高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体温和噬菌体转座子转座转座子转座 生存生存变异变异突变，重组突变，重组 损伤修复、适应环境、加速进化损伤修复、适应环境、加速进化 广义遗传重组：任何造成广义遗传重组：任何造成基因型变化基因型变化的基因交流过程的基因交流过程 DNA重组重组 (遗传重组遗传重组或基因重排）基因重排）1、概念：、概念： DNA分子内或分子间发生分子内或分子间发生遗传信息遗传信息的的重新组合重新组合,形成新的形成新的DNA分子的过程。分子的过程。2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有、意义：重组是遗传学的灵魂

3、，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术隆技术（1）同源重组）同源重组（2）位点特异性重组）位点特异性重组（3）转座重组）转座重组（4）异常重组）异常重组 DNA重组可分为四类（重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）序列、蛋白质因子） 重组重组DNA技术技术 第一节第一节 同源重组同源重组1、 同源重组（同源重组（homologous recombination）: 发生在发生在同源同源DNA序列序列之间之间一、特征一、特征2、 特征：特征： 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大 涉

4、及涉及DNA分子在特定的交换位点发生分子在特定的交换位点发生断裂和错接断裂和错接的生化过程的生化过程 异源双链区的生成异源双链区的生成 存在重组热点存在重组热点 需要需要重组酶重组酶 单链单链DNA分子分子或或单链单链DNA末端末端是交换发生的重要信号是交换发生的重要信号细线期细线期合线期合线期粗线期粗线期双线期双线期终变期终变期 e.g. Euk.减数分裂减数分裂时的染色单体之时的染色单体之间的交换间的交换 细菌的转化，细菌的转化， 转导，接合，噬转导，接合，噬菌体重组菌体重组双倍体染色体交换双倍体染色体交换二二 同源重组的分子模型同源重组的分子模型1.Holliday于于1964年提出年提

5、出Holliday模型模型（1）两个同源染色体）两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐（2）两）两DNA分子同一部位分子同一部位两单链两单链发生断裂引发生断裂引发重组发重组（3）断裂的单链游离末端彼此交换形成）断裂的单链游离末端彼此交换形成Holliday中间体中间体（4）通过）通过分支迁移分支迁移产生产生异源双链异源双链DNA分子。分子。（5）中间体在）中间体在内切酶内切酶和和连接酶连接酶作用下，形成作用下，形成拼接重组体和片段重组体。拼接重组体和片段重组体。55（1）（2）片段重组体拼接重组体Holliday中间体3553Meselson-Radding模型模型单链入侵模型（链转移模型）单链

6、入侵模型（链转移模型）置换置换侵入侵入Loop切除切除同化同化 异构化异构化 分支迁移分支迁移5切割切割双链断裂修复模型双链断裂修复模型 2、分枝迁移和分枝迁移和Holliday中间体结构的拆分中间体结构的拆分 分枝迁移（分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散Holliday的异构化的异构化产生重组体的拆分产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可结构一经生成即可不断地处于异构化不断地处于异构化异源双链异源双链 heteroduplex DNA重组结果取决于拆分时重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置配对链

7、上的切口位置（1）（2）（1）（2） Holliday结构的拆分结构的拆分产生含异源双链产生含异源双链的的片段重组体片段重组体产生产生拼接重组体拼接重组体“亲本链亲本链-片段重组体片段重组体”“拼接重组体拼接重组体”三、原核同源重组（三、原核同源重组（E.coli） 发生在双方发生在双方DNA的同源区域的同源区域 部分复制的染色体部分复制的染色体DNA之间或染色体之间或染色体DNA与外源与外源DNA之间之间 细菌的转化、结合和转导细菌的转化、结合和转导 1、RecBCD酶和酶和 Chi 位点位点 RecBCD酶具有酶具有ATP依赖的依赖的解旋酶活性、依赖于解旋酶活性、依赖于ATP的的核酸核酸外

8、切酶外切酶活性、活性、序列特异性的单链内切酶活性序列特异性的单链内切酶活性. 单链内切酶单链内切酶活性和解旋酶活性使活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点的作用位点 Chi位点含有位点含有GCTGGTGG序列序列,是基因是基因recBCD编码编码RecBCD酶作用酶作用的靶的靶位点位点3 RecBCD的识别和切割位点的识别和切割位点a、 RecBCD结合在结合在DNA的平的平 头末端（产生机制不清楚）头末端（产生机制不清楚）b、 外切、外切、解链、移动解链、移动 （ATP）c、 兔耳状兔耳状 loop 结构产生结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性

9、）（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、 RecBCD 在在 loop 单链区的单链区的 chi 位点位点3方方46NT处切处切 断单链（单链内切酶）断单链（单链内切酶） chi位点：位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点目前发现的重组热点 E.coli 含含 1000 个、个、Euk.e、 RecBCD 切割产生切割产生3单链末端单链末端 2、RecA 蛋白蛋白 （1） 活性活性a、 RecA 有有单单、双链双链 DNA 结合活性结合活性 b、 RecA 有有 NTPase 活性（底物差异活性）活性（底物差异活性） 与与单链单链 DNA 结合时活性最大结合时活性最大-依赖于依赖于 DNAc、

10、RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力的能力，即联会同源，即联会同源 DNA （但其靶（但其靶 DNA 必须有缺口结合必须有缺口结合DNA）RecA入侵单链入侵单链被置换连被置换连RecA引发链侵入模型引发链侵入模型RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA启动的单链入侵启动的单链入侵RecA引起的链交换和引起的链

11、交换和Holliday结构的生成结构的生成 （2）RecA 蛋白催化双链和单链蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段的反应阶段a、 联会前阶段（缓慢）联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合与单链结合b、 单链与双螺旋的单链与双螺旋的互补链互补链迅速配对，形成迅速配对，形成双链连接分子双链连接分子 Holliday（5侵入）侵入）c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链链 DNA反应结束时，反应结束时，RecA 结合到双链上结合到双链上 其中其中单链同化有固定的方向单链同化有固定的方向 入侵单链为入侵单链为53 双链双链 DNA 的互

12、补链是的互补链是35 RecBCD 和和 RecA 的共同作用的共同作用 3、原核同源重组的其它蛋白、原核同源重组的其它蛋白 需要需要 E.coli 中三个基因中三个基因 ruvA,ruvB 和和 ruvC 的产物的产物 a、 RuvA 识别识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s） c、 RuvC 核酸内切酶核酸内切酶-专一性识别专一性识别 Holliday 结构的连接点结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体体外切段连接点以拆分重组体p119 E.coli 重组的各阶段重组的各阶段 （损伤修复）（

13、损伤修复）损伤损伤DNADNA复复制产生缺口制产生缺口RecARecA链交换链交换第二次链交换第二次链交换DNApolDNApol通过通过DNADNA合成填满缺口合成填满缺口RuvA,BRuvA,B分枝迁移分枝迁移RuvCRuvC切割切割HollidayHolliday连接点连接点第二节第二节 特异位点重组特异位点重组一、特异位点重组（一、特异位点重组（ site-specific recombination）1、概念：发生在专一序列的、概念：发生在专一序列的DNA分子间的重组分子间的重组,有特异的有特异的 重组酶重组酶和和辅助因子辅助因子对其识别和作用。对其识别和作用。噬菌体噬菌体基因组整合

14、到基因组整合到细菌染色体基因组细菌染色体基因组中属此种重组中属此种重组2、位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向二、二、phagephage的整合与切除的整合与切除1、实现机制：、实现机制：均是通过均是通过-细菌细菌DNADNA和和DNADNA上特定位点之间的重组上特定位点之间的重组2、特定位点、特定位点-附着位点（附着位点（attachment site att） E.coli attB 含含BOB序列序列 23bp phage attP 含含 POP序列序列 240bp 核心序列核心序列 “ “O区区”完全一致完全一致 （同源部分（同源

15、部分15bp15bp） -位点特异性重组发生的地方位点特异性重组发生的地方3、整合过程、整合过程 整合后的附着位点为整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB） 整合位点整合位点-attB、attP 切除位点切除位点-attL、attR 整合过程需要整合过程需要整合酶整合酶 （integrase Int）（）（编码编码） 和和寄主的整合宿主因子寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用共同作用溶源性细菌溶源性细菌(lysogen)溶菌周期溶菌周期（lysis）原噬菌体原噬菌体4、整合分子机制、整合分子机制 核心序列核心序列O全长全长15

16、bp，富含，富含A-T 发生在发生在O内的重组交换位点相距内的重组交换位点相距 7bp 整合酶的结合位点：整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同两者的作用不同) attP位点的负超螺旋为重组所必须位点的负超螺旋为重组所必须-加强了加强了Int和和IHF的亲和力的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合结合 -核心序列的反向位点（切割位置）核心序列的反向位点（切割位置） -结合在结合在att臂上（臂与核心区靠近）臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis 整合体及其作用整合体及其作用 整合体（整合体（inta

17、some）- Int和和IHF结合到结合到attP时的复合物时的复合物 整合体捕获整合体捕获attB 说明说明- a、attB和和attP的的最初识别靠最初识别靠Int 识别两序列的能力识别两序列的能力 b、两序列的同源性两序列的同源性在链交换时为在链交换时为 重要因素重要因素 Int蛋白能蛋白能切断切断DNA，并使它重新，并使它重新连接连接，近而使，近而使holliday结构结构拆分拆分 重组时重组时attP和和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交5、整合与切除的控制、整合与切除的控制（1） 整合整合 C-促使阻遏蛋白促使阻遏蛋白C的产生的产生

18、 -与与int gene 的的PI结合，转录产生结合，转录产生Int蛋白蛋白 -且且PI位于位于xis基因内，基因内，C与与PI结合导致结合导致xis gene失活失活（2） 切除切除 寄主寄主SOS反应时反应时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白大量产生，促使阻遏蛋白C的水解的水解 -把把OL和和OR从阻遏状态释放出来从阻遏状态释放出来 -从从PL转录使转录使int和和xis表达表达细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换第三节第三节 转座子转座子一、转座子概述一、转座子概述1、转座子转座子(元元)或转座元件或转座元件(transposon or transposable ele

19、ment): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（转座（transposition）：转座子的转移过程：转座子的转移过程2、发现和发展、发现和发展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米果皮、糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 跳跃基因（跳跃基因（jumping gene） 1947 冷泉港实验室（

20、美）冷泉港实验室（美） Barbara McClintock 基因转座现象的再次发现与证实基因转座现象的再次发现与证实 在一个操纵子中，在一个操纵子中， 与操纵基因毗连的结构基因发与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。有极性梯度的特征。 插入型极性突变的发现与机理插入型极性突变的发现与机理Operon & Polarity Mutation 极性突变的基本概念极性突变的基本概念A酶活性酶活性 O gene Z 基因终止突变

21、位基因终止突变位 点离点离O基因的距离基因的距离 I p o Z Y Ao 20世纪世纪60年代末期年代末期,在不同实验室发现一在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子系列可转移的抗药性转座子o 1983年年Barbara McClintock被授予诺贝被授予诺贝尔生理学与医学奖。尔生理学与医学奖。a) 不依赖不依赖供体序列供体序列与靶位点间序列的同源性与靶位点间序列的同源性b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制转座不是简单的转移，涉及转座子的复制HotspotsHotspots (热点热点)Regional preferenceRegional preference ( 在在3kb区域

22、内的随机插入区域内的随机插入) d) 某些转座因子（某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）（免疫性）e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复靶序列在转座因子两侧会形成正向重复 f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点、转座重组的特点c) 转座插入的靶位点并非完全随机转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）（插入专一型）二、二、Prok.转座子种类转座子种类 两种类型：两种类型： 简单转座子简单转座子（simple transposon） （插入序列（插入序列 inse

23、rtion sequence IS ） 复合转座子复合转座子（composite transposon） 共同特征：共同特征： a）两端有）两端有2040bp的的IR b）具有编码）具有编码转座酶转座酶（transposase）的基因）的基因1、插入序列、插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名：命名： IS编号（鉴定类型）编号（鉴定类型） 长度长度 7002000bp 特点：特点： a）两端）两端IR为转座酶的识别位点（突变）为转座酶的识别位点（突变） b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（）插入靶位点后会出现靶位点的

24、正向重复（39bp） IS 可以正反方向插入到可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），（宿主、质粒或某些噬菌体）， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a)a) Tn / TnA family Tn / TnA family l 具有具有IR、转座酶基因、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因调节基因（解离酶）、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn

25、10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶转座酶 regulator - 内酰胺酶内酰胺酶 2、复合转座子、复合转座子 两种类型两种类型 b）两端重复序列为两端重复序列为IS的复合转座子的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂臂 中心区中心区 臂臂transposition 当两个当两个IS组件相组件相同时，其中任一个都同时，其中任一个都可行使转座功能可行使转座功能 不同时，主要依不同时，主要依靠一个靠一

26、个 两侧的两侧的IS既可以是既可以是IR，又可以是，又可以是DR状态状态（IR多）多）3 转座噬菌体转座噬菌体 Mu phageMu phage （巨型转座子（巨型转座子 ） C repressor for A, Brepressor for A, BB 33 kd 与转座有关与转座有关A 70 kd 转座酶转座酶U, S 毒性蛋白毒性蛋白attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶区倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位区倒位区 38kbPgin 以以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源

27、、裂解）为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解） Mu的插入途径的插入途径a） 侵入的侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主在溶源化过程中任意插入寄主DNA（两侧各（两侧各5bp的靶位点序列重复）的靶位点序列重复）b） 进入进入裂解生长后，复制产生后代裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主几乎全部插入寄主DNA中，并可继续转座（形中，并可继续转座（形成寄主成寄主DNA和和Mu的共合体），噬菌体成熟时，的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装切段共合体包装三、转座子的转作机制及模式三、转座子的转作机制及模式 三种类型：复制型、非复制型和保守型三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座

28、模式、复制型转座模式 实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝（供、受点）扩增了转座子的拷贝（供、受点） 需两种酶：需两种酶： 转作酶（作用于原拷贝两末端）转作酶（作用于原拷贝两末端） 解离酶（作用于复制后的拷贝）解离酶（作用于复制后的拷贝） 模式：模式： 两大步两大步 a) 共合体形成共合体形成 切口连接复制切口连接复制 b) 拆分拆分 靶位点的靶位点的DR形成形成2、非复制型转座模式、非复制型转座模式 供体上最终产生双链断裂供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复则有供体位点如不能被修复则有致死效应

29、致死效应3、保守型转座模式、保守型转座模式 另一种非复制型另一种非复制型 与与整合机制相似整合机制相似 其转座酶与其转座酶与整合整合酶家族有关酶家族有关4、TnA转座模式转座模式 复制型转座复制型转座 转座酶转座酶(tnpA)、 解离酶解离酶(tnpR) 解离酶需要特异的内解离酶需要特异的内 部位点部位点 双重功能：解离功能双重功能：解离功能 tnpA及自身的阻遏物及自身的阻遏物 拆分位点拆分位点 res 共合体拆分位点共合体拆分位点 转座结果产生转座结果产生5bp 的正向重复序列的正向重复序列 四、转座子转座频率的调控四、转座子转座频率的调控 每个转座子控制自身转座的核心每个转座子控制自身转

30、座的核心-控制转座酶的水平控制转座酶的水平 1、Tn10转座机制转座机制 Tn10为复合型转座子为复合型转座子 IS10R元件提供转座酶活性元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列合成转座酶的序列 自发转座频率自发转座频率-107 Tn10转座酶水平是控制转座的关键转座酶水平是控制转座的关键 有两种控制转座的方式有两种控制转座的方式 a） 通过反义通过反义RNA的翻译水平控制的翻译水平控制 IS10R外侧边缘两个启动子外侧边缘两个启动子 PIN控制控制IS10R的转录的转录 弱启动子弱启动子 POUT强启动子强启动子 右向转录宿主右向转录宿主DNA INRNA和和OUTRNA 有有36bp的重叠的

31、重叠 稳定性：稳定性： OUTRNAINRNA 大量大量OUTRNA作为作为 INRNA的反义的反义RNA b） 甲基化作用控制转座酶合成及其与甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合的结合 Tn10转座酶启动子含有转座酶启动子含有GATC序列（其它转座子）序列（其它转座子） E.coli中中Dam甲基化酶甲基化酶 作用使启动子相对钝化作用使启动子相对钝化 只能利用刚刚复制完成只能利用刚刚复制完成 时出现少数转座酶时出现少数转座酶 此外，此外，IS10R的末端的末端 IR也含有也含有GATC， 甲基化的甲基化的GATC不能不能 结合转座酶结合转座酶 Tn10在在DNA刚刚刚刚 复制后发生转座

32、复制后发生转座五、转座子的某些遗传学效应五、转座子的某些遗传学效应1.转座频率转座频率10-810-3，引起插入突变；，引起插入突变；2.插入位置染色体重排而出现新基因；插入位置染色体重排而出现新基因；3.影响插入位置邻近基因的表达影响插入位置邻近基因的表达,使宿主表现型改变；使宿主表现型改变；4.引起染色体插入位点两侧染色体畸变。引起染色体插入位点两侧染色体畸变。 真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类： a) 转座机制与细菌的转座子类似转座机制与细菌的转座子类似 遗传信息：遗传信息： DNADNA 玉米的玉米的Ac-Ds元件、果蝇的元件、果蝇的P元件和元件和FB元件等元件等 b) 转作机制类似逆转录病毒转作机制类似逆转录病毒 遗传信息：遗传信息： RNADNARNA 如：逆转录病毒、果蝇的如：逆转录病毒、果蝇的copia元件、酵母的元件、酵母的Ty元件元件 真核生物的转座真核生物的转座逆转录转座子逆转录转座子o 将将DNADNA的转移过程称转座。的转移过程称转座。o DNARNADNA的转移过程的转移过程逆转录转座。逆转录转座。o 逆转录子逆