PCR质量控制2013.3.26

1、医疗机构临床实验室管理办法医疗机构临床实验室管理办法（卫医发（卫医发200673200673号）号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办（卫办医政发医政发20101942010194号）号）医学实验室质量和能力认可准则医学实验室质量和能力认可准则 ISO15189(CNAS-CL02)ISO15189(CNAS-CL02)医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明（应用说明（CNAS-CL36CNAS-CL36）医学实验室质量和能力认可准则在病理学检查领域的应医学实验室质量和能力认可准则

2、在病理学检查领域的应用说明（用说明（CNAS-CL37CNAS-CL37）分析前分析前患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请生报告单申请分析中分析中样本分样、仪器、检测过程、结果的有效性判断样本分样、仪器、检测过程、结果的有效性判断分析后分析后检测报告、报告传递、结果的接收、结果解释检测报告、报告传递、结果的接收、结果解释标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量标本的类型和采集量采样及运输容器采样及运输容器采样质量的评价采样质量的评价标本采集中的防污染标本采集中的防污染1 1、血清（浆）血清

3、（浆）：无特殊要求无特殊要求2 2、如用泌尿生殖道分泌物做如用泌尿生殖道分泌物做CTCT、NGNG项目：项目：应在抗生素应用前或停应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。前采集。3 3、如用、如用痰痰做做TBTB：应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，应在抗结核药物应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。 因为因为PCRPCR方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生物活性的方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生

4、物活性的限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。检测。采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血

5、浆标本，用检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTAEDTA抗凝，不使用肝素，因其是抗凝，不使用肝素，因其是 TaqTaq酶的强抑制剂，酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。且在核酸提取过程中很难完全去除。 使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌，以使可能存在的以使可能存在的RNaseRNase永久性失活。永久性失活。血液标本：溶血、严重脂血等应拒收血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般1

6、02525个。个。标本拒收原因分析，采取有效措施予以纠正标本拒收原因分析，采取有效措施予以纠正实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为靶核酸为DNADNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后建议采集后8h8h之内送至实验室；之内送至实验室；靶核酸为靶核酸为R RNANA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后较长时

7、间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h4h之内送至实验之内送至实验室；室； 所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放实验室前，均应放2 288临时保存。临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。 靶核酸靶核酸( (尤其是尤其是RNA)RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为靶核酸为DNADNA的标

8、本的标本2-82-8保存保存1-31-3天，天，靶核酸为靶核酸为R RNANA的标本应的标本应2020下保存下保存2020下保存下保存1 1个月个月7070以下可长期保存以下可长期保存如为提取核酸后用于如为提取核酸后用于DNADNA扩增分析的样本，可于扩增分析的样本，可于10TE10TE缓冲液缓冲液mmolmmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)2-88.0)2-8下保存。下保存。 用于用于RNARNA扩增分析的样本，则应于上述扩增分析的样本，则应于上述 TETE缓冲液中缓冲液中-70-70保存。保存。 标本接收建

9、议在三个测定区之外标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性因其有较大的发生标本间污染的可能性 血清（浆）：血清（浆）：应应1 1小时内分离血清，抗凝后小时内分离血清，抗凝后4 4小时内分离血浆，然后转移至小时内分离血浆，然后转移至1.5ml1.5ml灭菌离心灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm1500rpm离心离心5min 5min 。如甘油三酯含量超过如甘油三酯含量超

10、过6mmol/L6mmol/L或肉眼可见血清或肉眼可见血清/ /血浆呈白色浑浊状的标本，应血浆呈白色浑浊状的标本，应413 000rpm413 000rpm离心离心15min,15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml1.5ml灭菌离心管灭菌离心管中保存中保存 泌尿生殖道分泌物泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液）配套棉拭子（不含保养液） 痰液痰液结核分枝杆菌结核分枝杆菌DNADNA检测标本：用检测标本：用4%NaOH4%NaOH摇匀，室温下放置摇匀，室温下放置3030分钟左右液化，分钟左右液化，转移至转移至

11、1.5ml1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。是液化时不能加热，液化时间不能过长。 非结核分枝杆菌非结核分枝杆菌DNADNA检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分检测标本：痰标本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。取。切记不能用切记不能用NaOHNaOH液化痰标本液化痰标本。 分册建立仪器档案分册建立仪器档案仪器卡、仪器运行状态标识仪器卡

12、、仪器运行状态标识定期维护保养定期维护保养定期校准定期校准/ /检定检定相同检测项目在不同的仪器或系统上进行检测时，应做比对相同检测项目在不同的仪器或系统上进行检测时，应做比对 （2 2次次/ /年，每次至少年，每次至少2020份标本，计算回归方程，系统误差应份标本，计算回归方程，系统误差应7.5%7.5%）当设备出现故障时当设备出现故障时 ： 1 1）应立即停止使用，并加上明显标识）应立即停止使用，并加上明显标识 2)2)修复的设备必须经校准、检定（验证）或检测满足要求后方修复的设备必须经校准、检定（验证）或检测满足要求后方 能再次投入使用能再次投入使用 3)3)实验室应检查由于上述缺陷对以

13、前所进行的检测工作的影响，实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测工作的影响， 并记录相关分析、处理意见并记录相关分析、处理意见 可校准的项目实施校准可校准的项目实施校准质控品检测结果在允许范围内质控品检测结果在允许范围内与其他仪器的检测结果比较（与其他仪器的检测结果比较（5 5个样本，覆盖测量范围，个样本，覆盖测量范围，至少至少4 4个样本测量结果偏移个样本测量结果偏移 7.5% 7.5% ）使用留样再测结果进行判别使用留样再测结果进行判别(5(5个样本，覆盖测量范围，个样本，覆盖测量范围，至少至少4 4个样本测量结果偏移个样本测量结果偏移 7.5% 7.5% ）需校准仪器：温度计、温湿度

14、计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高需校准仪器：温度计、温湿度计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪、测序仪速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪、测序仪校准单位资质校准单位资质合格的校准合格的校准/ / 检定报告检定报告校准周期：参照国家计量部门或生产厂商的要求进行，厂家没有规定的则校准周期：参照国家计量部门或生产厂商的要求进行，厂家没有规定的则每年至少进行一次每年至少进行一次 内部校准的辅助设备，实验室应根据国家计量部门或生产厂商的规定制定内部校准的辅助设备，实验室应根据国家计量部门或生产厂商的规定制定内部校准操作规程和要求，并有内部校准的详细记录内部校准操作规程和要求

15、，并有内部校准的详细记录校准或检定的设备，应贴校准或检定标贴，标明其校准或检定状态，并标校准或检定的设备，应贴校准或检定标贴，标明其校准或检定状态，并标明下次校准或检定的日期明下次校准或检定的日期 结构：温度控制及导热系统、光路系统、结构：温度控制及导热系统、光路系统、 检测系统检测系统 维护：维护： 75%75%乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔 用无水乙醇清洁光路部分用无水乙醇清洁光路部分校准：校准： 校准单位：厂家校准单位：厂家 校准周期：定期校准、仪器搬动校准周期：定期校准、仪器搬动 校准参数：光路部分、背景荧光、温控部分（温度准校准参数：光路部分、背景荧光、温控

16、部分（温度准确度、均一性、温度升降速率）确度、均一性、温度升降速率） 维护：维护：75%75%乙醇擦拭加热孔乙醇擦拭加热孔校准：校准： 校准单位：厂家、计量院、内部校准校准单位：厂家、计量院、内部校准 温度准确度（温度准确度（11 ）（）（应涵盖试验过程中所涉及的温度应涵盖试验过程中所涉及的温度） 孔间温度的均一性（孔间温度的均一性（11 ）（内部校准应规定测定孔的（内部校准应规定测定孔的选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）维护：维护： 75%75%乙醇擦拭乙醇擦拭校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、 校准量程校准

17、量程（应涵盖试验过程中所涉及的量程）（应涵盖试验过程中所涉及的量程） 计量性能要求（容量允许误差、测量重复性）计量性能要求（容量允许误差、测量重复性）内部校准内部校准- -参照参照定量、可调移液器试行检定规程定量、可调移液器试行检定规程(JJG646-2006)(JJG646-2006) 注意：环境的要求注意：环境的要求 计量性能要求（标称容量、标定点、容量允许误差、测量计量性能要求（标称容量、标定点、容量允许误差、测量 重复性）重复性） 校准点涵盖试验过程中所涉及的量程校准点涵盖试验过程中所涉及的量程清洁清洁: : 75%75%乙醇擦拭乙醇擦拭, ,不宜用次氯酸钠溶液清洁不宜用次氯酸钠溶液清

18、洁检定：有资质的第三方检测机构检定：有资质的第三方检测机构检定参数：检定参数：高效过滤器完整性、流入气流流速、下降高效过滤器完整性、流入气流流速、下降气流流速、气流模式气流流速、气流模式 维护保养：维护保养：75%75%乙醇擦拭乙醇擦拭校准：转速、温度校准：转速、温度耗材耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检试剂盒的质检试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检包括外观质检和性能质检 选择或更换试剂品牌：试剂性能评估选择或更换试剂品牌：试剂性能评估 更换试剂批号：试剂批间差，应评价核酸提取效率和更换试剂批号：试剂批间差，应评价核酸提取效率和扩增效率扩增效率设置阴性

19、对照、低值阳性对照设置阴性对照、低值阳性对照试剂不合格试剂不合格 1)1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。 2)2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。 3) 3) 阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。阴性对照有扩

20、增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。 4)4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CTCT值偏大值偏大5 5个循环个循环以上，提示阳性标准品存在问题。以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格试剂合格 阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出 或高、低两个临床样本检测结果在或高、低两个临床样本检测结果在0.4log100.4log10范围内，可接受范围内，可接受目的目的 监测和控制实验室常规工作的精密度，监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性即实验室测定的批内和批间重复性

21、IQCIQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性和有效性来源来源: :第三方、试剂盒自带、自制第三方、试剂盒自带、自制使用使用: : 1) 1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（剂为焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）水时，在操作中应尽量在）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPCDEPC是一种是一种潜在的致癌物质潜在的致癌物质. .它可灭活各种蛋白质，是它可灭活各种蛋白质，是RNARNA酶的强酶的强抑制物。抑制物。 2)

22、2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确 3)3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇 4 4）避免反复冻融）避免反复冻融 5 5）自制室内质控品应监测检测全过程）自制室内质控品应监测检测全过程 定性检测定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带至少带1 1份，监测核酸提取和扩份，监测核酸提取和扩增检测的有效性增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带至少带1 1份，判断核酸提取过程中份，判断核酸提取过程中是否发生污染是否发生污染( (实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强

23、阳性标实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染 翻盖离心管在翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染 定量检测定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置, ,尽尽可能监测每一个孔扩增有效性可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和板上杂交和膜上斑点印迹杂交的

24、质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。不同杂交条件所致的对结果的错误解释。暂定均值的建立：暂定均值的建立：20d20d内得到内得到2020个数值，或至少在个数值，或至少在5d5d内，每天作内，每天作不少于不少于4 4次重复检测获得次重复检测获得2020个数值。对数据进行离群值检验（剔个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过除超过3s3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。外的数据），计算出均值，作

25、为暂定均值。若使用定值质控品，若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初常规均值的建立：以最初2020个数据和三至五个月在控数据汇集个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。并以此作为以后室内质控图的均值。符符 号号 定定 义义1 12S2S 一个质控测定值超出一个质控测定值超出2s2s控制限

26、。控制限。1 13S3S 一个质控测定值超出一个质控测定值超出3s3s控制限。控制限。2 22S2S 两个连续的质控测定值同时超出两个连续的质控测定值同时超出+2s+2s或或2s2s控制限。控制限。R R4S4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间 的差值超出的差值超出4s4s控制限。控制限。4 41S1S 四个连续的质控测定值同时超出四个连续的质控测定值同时超出+1s+1s或或1s1s控制限。控制限。1010X X 十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。LeveyLevey-Jennings-

27、Jennings质控图方法质控图方法 LeveyLevey-Jennings-Jennings质控图结合质控图结合WestgardWestgard多规则质控方法多规则质控方法 “即刻法即刻法”质控方法质控方法 根据常规条件下的变异（根据常规条件下的变异（RCVRCV）计算中的平均值和）计算中的平均值和SDSD确定质控线，确定质控线，一般以一般以X X2S2S为告警限，为告警限，X X3S3S为失控限，将所得质控结果标在一为失控限，将所得质控结果标在一张质控图上，简单明了。但如果以张质控图上，简单明了。但如果以X X2S2S为失控限，假失控概率为失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以太高，通常

28、不能接受；以X X3S3S为失控限假失控概率低，但误差为失控限假失控概率低，但误差检出能力不强。检出能力不强。 xl l 。XXX10X10 只要有只要有3 3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。将连续的质控测定值按从小到大排列，即将连续的质控测定值按从小到大排列，即x x1 1、x x2 2、x x3 3、x x4 4、x x5 5、x x6 6、x xn n（x x1 1为最小值，为最小值，x xn n为最大值）；为最大值）； 计算均值和标准差计算均值和标准差(s);(s);按下述公式计算按下述公式计算SISI上限上限和和SISI下限下限值；值；

29、 SISI上限上限= =（x x最大值最大值 均值）均值）/s/s SI SI下下限限= =（均值（均值 x x最小值最小值 ）/s/s将将SISI上限上限和和SISI下限下限值与值与SISI值表中的数值比较。值表中的数值比较。 n nn n3s3s n n2s 2s n nn n3s3s n n2s2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 5 1.75 1.67 14 2.66 2.3

30、7 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56 11 2.48 2.23 20 2.88 2

31、.56SISI上限上限和和SISI下限下限值均值均 n3s对应的值时，说明该质控测定对应的值时，说明该质控测定值的变化已超出值的变化已超出3s3s，属，属“失控失控”。优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控缺点：繁琐缺点：繁琐 初始阶段的质控数据，前初始阶段的质控数据，前3 3个质控值的个质控值的CVCV对随后的结果对随后的结果影响大。影响大。前前2020个数据使用即刻法，可对第个数据使用即刻法，可对第3 32020个数据进行质控判断个数据进行质控判断第第2121个数据开始使用常规质控方法进行质控判断个数据开始使用常规质控方法进行质控判断及

32、时查找原因，采取纠正措施及时查找原因，采取纠正措施填写失控原因分析报告填写失控原因分析报告相关负责人决定报告是否可发放相关负责人决定报告是否可发放核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。所示温度的不一致性等。试剂的问题。如试剂的问题。如TaqTaq酶和酶和/ /或逆转录酶的失活、探针的纯度或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提

33、取试剂的效率等。及标记效率和核酸提取试剂的效率等。扩增产物的扩增产物的“污染污染” 临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染污染”. .严格的实验室分区严格的实验室分区使用带使用带“滤芯滤芯”的吸头的吸头设立设立“阴性阴性”质控（与标本同时处理）质控（与标本同时处理）使用防使用防“污染污染”（含（含UNGUNG）的）的PCRPCR试剂试剂临床临床“假阳性假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但后已死亡，但PCRPCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做

34、宜做PCRPCR检测。检测。避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准进行检查和校准在在PCRPCR试剂准备区配置反应混合液，先将试剂准备区配置反应混合液，先将dNTPdNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再、引物、酶和缓冲液混合后，再分装；分装；配制反应体系时，应注意移

35、液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含优先选择含UNGUNG的试剂盒的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实

36、验用品，均需高压灭菌扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-5-10min10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降

37、低。标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的本中的DNADNA或或RNARNA完全释放；完全释放；将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。生物污染废弃物进行处理。扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。

38、扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离好远离PCRPCR实验室的洗涤间消毒处理；实验室的洗涤间消毒处理；工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。基线值（阈值）设定：遵从厂商规定基线值（阈值）设定：遵从厂商规定标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数

39、值标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。 以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。复

40、星复星CTCT：38Ct38Ct值值4040为检测灰区，建议重复检测为检测灰区，建议重复检测2 2次。如次。如果检测结果至少果检测结果至少1 1次为次为Ct40Ct40判断为阳性，否则判为阴性。判断为阳性，否则判为阴性。达安达安CT:CT:ABI7000ABI7000：27Ct27Ct值值3030为检测灰区，重复检测为检测灰区，重复检测1 1次。如重次。如重复试验复试验CtCt值值3030判为阳性，否则判为阴性。判为阳性，否则判为阴性。Roche LightCyclerRoche LightCycler：37Ct4037Ct40为检测灰区，重复检测为检测灰区，重复检测1 1次。如重复试验次。如

41、重复试验CtCt值值4040判为阳性，否则判为阴性判为阳性，否则判为阴性定性检测定性检测 定性检测的结果报定性检测的结果报“阴性阴性”或或“阳性阳性”。但由于目。但由于目前国内商品试剂盒的灵敏度多为前国内商品试剂盒的灵敏度多为500-1000IU/ml500-1000IU/ml，在报告结果，在报告结果时应告知临床医生方法的局限性。时应告知临床医生方法的局限性。定量检测定量检测 1 1）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。 2 2）样本未出现扩增曲线，则报告为）样本未出现扩增曲线，则报告为“低于检测下限低于检测下限”，不能，不能报告为报告为“0”0”或或“阴性阴性”。如果低于检测下限，但又有扩增曲。如果低于检测下限，但又有扩增曲线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为“低于检测低于检测下限下限”。 3 3）结果高于检测上限，则报告）结果高于检测上限，则报告“高于检测上限高于检测上限”，如果需要，如果需要精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行100-1000100-1000倍稀释后再重新进行检测，结