发酵工艺综合实验

1、发酵工程实验发酵工程实验生命科学技术系生命科学技术系发酵工程综合实验发酵工程综合实验2012.05发酵工程实验发酵工程实验实验内容实验内容发酵工程实验发酵工程实验 - -酵母的液体发酵酵母的液体发酵发酵工程实验发酵工程实验 - -黑曲霉的固体发酵黑曲霉的固体发酵发酵工程实验发酵工程实验内容内容 本次实验分本次实验分酵母的液体发酵酵母的液体发酵和和黑曲霉固体发酵黑曲霉固体发酵两两个内容；以个内容；以实验小组实验小组为单位，为单位，分发、清洗分发、清洗本小组实验本小组实验所需要玻璃仪器、结束后清洗回收；所需要玻璃仪器、结束后清洗回收；配制配制本小组所需本小组所需基本试剂。基本试剂。准备准备 每班选

2、出每班选出1-21-2个同学跟着实验室个同学跟着实验室毛会丽毛会丽老师准备老师准备实验，配制试剂，活化菌种，准备时间段在第十五周。实验，配制试剂，活化菌种，准备时间段在第十五周。选出人员后报与毛会丽老师。选出人员后报与毛会丽老师。发酵工程实验发酵工程实验分组分组 每个实验室由班长总负责，分为每个实验室由班长总负责，分为2 2大组大组； 每一每一大组分大组分2 2小组小组，自由组合分别作液体、固体发酵实验；，自由组合分别作液体、固体发酵实验；分组名单由班长报给辅导老师，向辅导老师分组名单由班长报给辅导老师，向辅导老师留联系留联系方式方式。发酵工程实验发酵工程实验发酵工程实验发酵工程实验 -液体发

3、酵液体发酵v实验目的实验目的v实验材料和器材实验材料和器材v实验内容实验内容v作业及思考题作业及思考题实验一实验一 酵母的液体摇瓶发酵实验酵母的液体摇瓶发酵实验发酵工程实验发酵工程实验掌握液体发酵种子液的制备和摇瓶发酵技术及掌握液体发酵种子液的制备和摇瓶发酵技术及方法方法掌握总糖和还原糖含量的测定方法掌握总糖和还原糖含量的测定方法掌握常用的比色分析方法的操作技术掌握常用的比色分析方法的操作技术熟悉酵母菌的微生物学特性及培养方法熟悉酵母菌的微生物学特性及培养方法 一、实验目的一、实验目的发酵工程实验发酵工程实验二、实验材料和试剂配制方法二、实验材料和试剂配制方法1.1.实验菌种：酵母菌实验菌种：

4、酵母菌菌丝显微照片菌丝显微照片平板照片平板照片发酵工程实验发酵工程实验2.2.实验仪器：实验仪器：玻璃试管、试管架、吸管（玻璃试管、试管架、吸管（1mL1mL，2mL2mL，10mL10mL）、吸耳球、容量瓶、烧杯、三角瓶（）、吸耳球、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 mL250 mL，500mL500mL）、量筒（）、量筒（250mL250mL，500mL500mL，1000mL1000mL）、玻璃棒、）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤等。恒温箱、台秤等。发酵工程实验发酵工程实验3.3.培养基培养基(1)(1)

5、斜面培养基斜面培养基麦芽汁培养基麦芽汁培养基：10o麦芽汁麦芽汁100mL，琼脂，琼脂2g(2%)， 加热加热煮沸溶解，蒸发所失体积用水补足，定容至煮沸溶解，蒸发所失体积用水补足，定容至100mL。PDAPDA培养基：培养基：取去皮马铃薯取去皮马铃薯20g20g，切成小块，加水，切成小块，加水100mL100mL。微沸微沸30min30min，用纱布过滤，加，用纱布过滤，加2g2g葡萄糖，加热煮沸后加葡萄糖，加热煮沸后加入入2g2g琼脂，继续加热融化并补足失水，定容至琼脂，继续加热融化并补足失水，定容至100mL100mL。发酵工程实验发酵工程实验(2)(2)种子培养基：种子培养基：10麦芽汁

6、，麦芽汁，pH5.0或或葡萄糖葡萄糖10%，玉米浆玉米浆1%，尿素，尿素0.2%，pH5.0。(3)(3)发酵培养基：发酵培养基：玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖玉米粉经液化、糖化，折合葡萄糖浓度为浓度为10%，玉米浆，玉米浆1%，硫酸铵，硫酸铵0.4%，pH5.5。装量：装量：30mL/250mL发酵工程实验发酵工程实验4.4.试剂的配制试剂的配制(1) 1mg/mL1mg/mL葡萄糖标准液：葡萄糖标准液：准确称取准确称取100mg100mg分析纯葡萄分析纯葡萄糖，置于小烧杯中用少量的蒸馏水溶解后，定容转移糖，置于小烧杯中用少量的蒸馏水溶解后，定容转移到到100mL100mL的容量瓶中，以蒸馏

7、水定容至刻度，摇匀，的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱保存备用。（冰箱保存备用。（每小组！每小组！） DNS试剂：试剂：称取称取20.00g 3,5-二硝基水杨酸溶解于二硝基水杨酸溶解于1.5L水，一边不断地搅拌一边逐渐加入水，一边不断地搅拌一边逐渐加入32.0gNaOH，让其溶解。然后逐渐加入苯酚让其溶解。然后逐渐加入苯酚10g，亚硫酸钠，亚硫酸钠10g，酒石酸钾钠酒石酸钾钠600g，加热至，加热至45，冷却后在，冷却后在2.0L的容量的容量瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。（瓶中定容。室温存放在棕色瓶中。（已经配制！已经配制！）发酵工程实验发酵工程实验(3) 酚酞指示剂：酚酞指示剂：称

8、取称取5g酚酞，溶于酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。乙醇中。(4)6moL/L HCL: 先于先于1000mL容量瓶中加入约容量瓶中加入约200mL蒸蒸馏水，然后取馏水，然后取540mL浓盐酸沿瓶壁浓盐酸沿瓶壁缓慢缓慢加入，加水定容加入，加水定容至至1000mL。(5)6moL/L NaOH ：称取称取240g NaOH ，溶于，溶于800mL 蒸蒸馏水中，待散热冷却后，加水定容至馏水中，待散热冷却后，加水定容至1000mL。（每个实验室！每个实验室！）发酵工程实验发酵工程实验三、三、实验内容实验内容摇瓶酵母的接种与培养摇瓶酵母的接种与培养总糖含量的测定总糖含量的测定还原糖含量的测定还原糖

9、含量的测定pH值的测定值的测定发酵工程实验发酵工程实验 无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在取适量孢子涂在PDAPDA斜面上，然后置斜面上，然后置28-3028-30的恒温箱的恒温箱培养培养2-3d2-3d。斜面菌种的制备斜面菌种的制备内容内容1 1摇瓶酵母的接种与培养摇瓶酵母的接种与培养发酵工程实验发酵工程实验斜面培养基斜面培养基 按照按照 配方配方 种子培养基种子培养基 称量称量分装分装250mL250mL锥形瓶锥形瓶(50mL) (50mL) 加封口膜加封口膜 121下下灭菌灭菌30min冷却备用冷却备用 种子培养基种子培养基

10、置于超净工作台上置于超净工作台上种子培养基的制备种子培养基的制备发酵工程实验发酵工程实验PDAPDA酵母酵母斜面斜面刮取刮取2-32-3环环菌体细胞悬浮液菌体细胞悬浮液 28摇床摇床 140rpm 培养培养2d摇瓶接种摇瓶接种 加入无菌水加入无菌水洗下细胞洗下细胞移液管吸移液管吸取孢子液取孢子液加入摇瓶加入摇瓶接种量接种量10%种子液种子液种子液制备流程种子液制备流程发酵工程实验发酵工程实验发酵培养基发酵培养基发酵培养物发酵培养物 接种量接种量10%种子液种子液发酵设置及培养发酵设置及培养140rpm 28 Ps：每个瓶子设一个平行：每个瓶子设一个平行发酵工程实验发酵工程实验发酵培养物发酵培养

11、物 取样时间：取样时间：0、8、16、24、32、40、48h测定：测定：pH、总糖含量、还原糖含量、总糖含量、还原糖含量注意！注意！0h培养液要留一部分放置冰箱作为菌体浓培养液要留一部分放置冰箱作为菌体浓度测定的度测定的对照对照。取样和需测定的指标取样和需测定的指标发酵工程实验发酵工程实验内容内容2 2 总糖与还原糖含量的测定总糖与还原糖含量的测定DNSDNS法法发酵工程实验发酵工程实验 取取2.5mL2.5mL发酵上清液，加入装有发酵上清液，加入装有5mL6moL/L HCL5mL6moL/L HCL及及10mL10mL蒸馏水的蒸馏水的50mL50mL的三角瓶中，微沸加热水解的三角瓶中，微

12、沸加热水解30min30min。待。待三角瓶冷却后，加入三角瓶冷却后，加入1 1滴酚酞指示剂，以滴酚酞指示剂，以6moL/L NaOH6moL/L NaOH中中和至微红色，将水解液全部收集在和至微红色，将水解液全部收集在50mL50mL的容量瓶中，用的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为总糖待测液。蒸馏水定容至刻度，混匀，作为总糖待测液。总糖的水解和提取总糖的水解和提取注意！注意！微沸加热水解时一定注意锅内的水不要烧干！微沸加热水解时一定注意锅内的水不要烧干！发酵工程实验发酵工程实验CW定容至定容至25mL0mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL1.2mL1mg/mL葡葡萄

13、糖标准液萄糖标准液沸水浴沸水浴5min后冷却至室温后冷却至室温540nm波长处比波长处比色，以色，以0管调零管调零 标准曲线的绘制标准曲线的绘制2.0mL1.8mL1.6mL1.4mL1.2mL1.0mL0.8mL加入加入1.5mLDNS后混匀后混匀注意！注意！测定前一定要检测定前一定要检查波长是否正确！查波长是否正确！发酵工程实验发酵工程实验然后沸水浴然后沸水浴5分钟，冷却到室温，于分钟，冷却到室温，于540nm波长处进行测定。波长处进行测定。总糖和还原糖的测定总糖和还原糖的测定发酵工程实验发酵工程实验计算公式计算公式 还原糖（还原糖（g/mL）=）样品体积数（反应体积）葡萄糖质量（mlg

14、总糖（总糖（g/mL）=）样品体积数（反应体积水解体积）葡萄糖质量（mlg 发酵工程实验发酵工程实验内容内容3 3 pHpH值的测定值的测定 将发酵液混匀后，用玻璃将发酵液混匀后，用玻璃棒沾取发酵液，用棒沾取发酵液，用4.0-5.8或或5.5-9.0pH试纸检测，测出发试纸检测，测出发酵液的酵液的pH值。值。发酵工程实验发酵工程实验四四、作业及思考题作业及思考题1.1.观察记录酵母菌细胞液体发酵过程中发酵液的颜色，观察记录酵母菌细胞液体发酵过程中发酵液的颜色，粘度，菌丝形态以及气味。粘度，菌丝形态以及气味。2.2.测定酵母菌的简单分批发酵中每次取样中菌体细胞测定酵母菌的简单分批发酵中每次取样中

15、菌体细胞生长量、总糖和还原糖含量和生长量、总糖和还原糖含量和pHpH值，绘制发酵曲线。值，绘制发酵曲线。发酵工程实验发酵工程实验实验二实验二 木聚糖酶（木聚糖酶（XyLanaseXyLanase）固体发酵）固体发酵实验目的实验目的实验原理实验原理实验材料和器材实验材料和器材实验内容实验内容作业及思考题作业及思考题发酵工程实验发酵工程实验 -固体发酵固体发酵发酵工程实验发酵工程实验（1 1）熟悉实验室固体发酵技术）熟悉实验室固体发酵技术（2 2）观察并记录黑曲霉培养过程中菌种生长）观察并记录黑曲霉培养过程中菌种生长变化情况变化情况（3 3）掌握）掌握xyLanasexyLanase酶活力的测定方

16、法酶活力的测定方法一、实验目的一、实验目的发酵工程实验发酵工程实验在畜禽和水产动物在畜禽和水产动物肠道内形成较高的肠道内形成较高的粘度的食糜，不易粘度的食糜，不易被动物消化。被动物消化。 同时肠道粘度增加导致同时肠道粘度增加导致营养物质在肠道内蓄积，形营养物质在肠道内蓄积，形成富含养分的食糜，使得微成富含养分的食糜，使得微生物增殖，损害肠道黏膜正生物增殖，损害肠道黏膜正常形态与功能，还可导致腹常形态与功能，还可导致腹泻和死亡率的增加。泻和死亡率的增加。 导致动物采食量下降，导致动物采食量下降，妨碍消化液与底物的混妨碍消化液与底物的混合，从而阻止脂肪的消合，从而阻止脂肪的消化吸收化吸收 二、实验

17、原理二、实验原理发酵工程实验发酵工程实验1.实验菌种：黑曲霉实验菌种：黑曲霉（Aspergillus niger）2.实验仪器及设备实验仪器及设备玻璃试管、试管架、吸管（玻璃试管、试管架、吸管（1mL，2mL，10mL）、吸）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 mL）、电）、电子分析天平、移液枪、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉等。子分析天平、移液枪、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉等。自动灭菌锅、无菌间、超净工作台。自动灭菌锅、无菌间、超净工作台。振荡培养箱、分光光度计，振荡培养箱、分光光度计，三、实验材料三、实验材料发酵工程实验发酵工程实验3.3.试

18、剂配制试剂配制1%（W/V）木聚糖底物）木聚糖底物 ：称取称取1.00g木聚糖加入木聚糖加入80mL预热至预热至80的蒸馏水中，再加热至沸点，冷却的蒸馏水中，再加热至沸点，冷却后定容至后定容至100mL，4保存备用。保存备用。 （每小组！每小组！）10mg/mL木糖母液木糖母液 ：准确称取准确称取1.0000g分析纯木糖，分析纯木糖，用适量蒸馏水溶解，定容到用适量蒸馏水溶解，定容到100mL， 4保存备用，保存备用，用时稀释用时稀释10倍。倍。（每小组！每小组！）发酵工程实验发酵工程实验 每个三角瓶（每个三角瓶（500mL500mL）麸皮）麸皮6g6g，玉米芯，玉米芯4g4g，以固水比为以固水

19、比为1:1.21:1.2的比例加入自来水，的比例加入自来水， pHpH自然。自然。 121121下灭菌下灭菌30min30min （装量（装量30ml/500ml30ml/500ml）4.4.发酵培养基的配制与灭菌发酵培养基的配制与灭菌 发酵工程实验发酵工程实验四、实验内容四、实验内容u发酵培养基接种发酵培养基接种u取样及样品处理取样及样品处理uXylanaseXylanase酶活测定酶活测定发酵工程实验发酵工程实验 超净工作台上，制备孢子悬液超净工作台上，制备孢子悬液( (50mL/250mL50mL/250mL) ) ，混匀后取混匀后取5mL5mL接入三角瓶中，于室温培养接入三角瓶中，于室温培养48h48h。发酵培养基接种发酵培养基接种发酵工程实验发酵工程实验取样取样取样：取样：0 0、2424、3232、4040、4848、5656、6464、72h72h测定：测定：xyLanasexyLanase的活力的活力 酶液浸提：采用四分取样法，精确称量样品酶液浸提：采用四分取样法，精确称量样品2g2g，40 40 用用25mL25mL蒸馏水浸提蒸馏水浸提4h4h，过滤，所得滤液作为，过滤，所得滤液作为待测酶样待测酶