秀丽线虫的研究和饲养

1、秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途 By 王传杰介绍 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）,属于线形动物门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。 线 虫 是 细 胞 定 数 动 物 ， 两性 成虫 只有 9 5 9 个 体 细 胞 ， 雄 性 成 虫 只 有 1 0 3 1 个 体细 胞 ， 其 中 1 3 1个 细 胞 注 定 要 接 一 定 的发 育 程 序 陆续 死 亡 。 神 经 系统解 剖结 构 十 分 简 单 ， 仅有 3 0 2个细 胞 ， 约 占整 个 动 物 体 细 胞 总 数 的 三 分 之 一 。它身体透明,能感知气味和味道,对光线、温度有反应。研究

2、者很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察 饲养与冻存设备试剂： 大肠杆菌大肠杆菌OP50 大肠杆菌大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型是尿嘧啶渗漏突变型,作为作为秀丽隐杆线虫的食物。秀丽隐杆线虫的食物。 NGM培养基培养基1000ml的的NGM培养基内加有培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋蛋白胨白胨,17g琼脂琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液缓冲液(pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固胆固醇溶液醇溶液(5mg/ml乙醇乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的的 CaCl 21ml M9缓冲

3、液每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现用现配S缓冲液0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0)喂养方法 用冰M9缓冲液清洗虫体 置4环境20min 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 置4环境20min 弃上清 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌大肠杆菌OP50的的NGM培养基上培养基上将培养基放置到将培养基放置到16生化培养箱中，72h后可繁育至第二代 冻存准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲液

4、溶解）用冰M9缓冲液清洗虫体置4环境20min，1000r离心弃去上清将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室温解冻重置培养基研究范围 细胞程序性死亡的遗传调控机制 RNAi 及其作用机制 秀丽线虫的功能基因组学及其他研究秀丽线虫的功能基因组学及其他研究 低氧应答模式生物 基因组学和功能蛋白组学的研究基因组学和功能蛋白组学的研究 其他（其他（MAPK 信号传导信号传导 、 TGF- b 信号传递途径信号传递途径 、衰老和年龄及脂、衰老和年龄及脂肪代谢等）肪代谢等） 方法 线虫基因显微注射显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对线虫进行转基因操作的一种高效

5、且相对简单的方法，主 要用于研究线虫突变种系的功能恢复(mutant rescue)、特定基因的过表达或异位表达、标 签 蛋白的 表达、特 定 蛋白 质 结构域的功 能、DNA 或 RNA 调节元件的分析及 RNA 干扰等 此外，这项转基因技术对于特异表型的筛选也是个强有 力 的 工具 ， 并 且 它还 可 用于 将人 工 合 成 mRNAs 或其他分子接引入细胞设备 显微注射全套仪器 琼脂糖固定垫 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 缓 冲液注射步骤制剂及破针制剂及破针固定虫固定虫将纯化的将纯化的 DNA 溶解在溶解在 Tris-EDTA(TE)缓冲液中即可接用缓冲液中即

6、可接用于注射。在注射液中加入终浓于注射。在注射液中加入终浓度约度约 10 mg/L 的线虫基因组的线虫基因组 DNA，则会有效地提高转基因，则会有效地提高转基因效率。效率。将一小玻片放在加了注射油的将一小玻片放在加了注射油的固定垫上，操纵微操使注射针固定垫上，操纵微操使注射针与玻片边缘相撞，若针头尖端与玻片边缘相撞，若针头尖端撞破，可观察到有液泡自动渗撞破，可观察到有液泡自动渗出出注射时将注射时将线虫挑至线虫挑至琼脂糖固琼脂糖固定垫上，定垫上，调整线虫调整线虫使性腺暴使性腺暴露，滴加露，滴加注射油覆注射油覆盖整个虫盖整个虫体体 固定固定好后的操好后的操作要迅速，作要迅速，否则线虫否则线虫容易脱

7、水容易脱水而死而死将琼脂糖固定垫放将琼脂糖固定垫放在载物台上，在载物台上，40 x物物镜下找到线虫，使镜下找到线虫，使性腺聚焦在正确的性腺聚焦在正确的平面平面 操作微操或操作微操或轻移滑动载物台，轻移滑动载物台，将注射针尖刺入性将注射针尖刺入性腺腺 启动微量加压启动微量加压器进行注射，能观器进行注射，能观察到注射液在性腺察到注射液在性腺中快速流动，注射中快速流动，注射后的性腺被液体充后的性腺被液体充满满在体视显微镜下，在体视显微镜下，滴加恢复缓冲液至滴加恢复缓冲液至注射后的线虫正上注射后的线虫正上方，由于与油互不方，由于与油互不相溶，缓冲液会渗相溶，缓冲液会渗入油下使线虫浮入油下使线虫浮起起

8、一般等待一般等待 2 5 min，线虫活力，线虫活力恢复，身体开始游恢复，身体开始游动，即可挑至培养动，即可挑至培养板上，板上，20 常规培常规培养养注射注射恢复恢复 琼脂糖固定垫 取约 50 ul 加热溶解的 2%琼脂糖(agarose)溶液滴在长宽 50 mmx24 mm，厚 0.13 0.17 mm 的载玻片上，用另一载玻片轻压其上，待琼脂糖凝固后( 约 2 min)，将上面的玻片从侧面滑下即可 制作好的固定垫室温过夜或 65 干燥 1h 后可叠放起来备用 恢复缓冲液5.8 g Na2HPO4， 3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl， 1.0gNH4Cl加水至 1L，高压灭菌，

9、用于注射后线虫的恢复 注射子代目的基因表达检测注射后约 3 天，观察孵出的 F1 代是否有目的DNA 表达 目前，线虫外源基因表达的标记通常用：a 荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能；需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能；b 目的基因与荧光标记基因共注射；目的基因与荧光标记基因共注射；c 目的基因目的基因与具有明显表型的标记基因共注射，与具有明显表型的标记基因共注射，我们通常使用易观察的 pmyo-3:TDimer II作为荧光标记，它在所有体壁肌肉细胞表达，转基因效率高且本身对线虫的行为 和功能没有 影响。显微

10、注射后的整合目前常用的整合方法有：用 y射线和 X射线照射，或用光敏剂补骨脂素加长波紫外线照射整合(TMP/UV integration) 基本策略是大量筛选经射线照射过的转基因线虫，一般挑取数百只 F1 代繁殖，筛选 F4 代，检测是否有 100%的转基因表达，若是则说明整合成功 一般一次整合能得到若干个独立种系，可选择最好的一个进行实验 整合TMP/UV 整合无需 酌 或 X 射线源，可在普通实 验室 进 行 诱 变 剂 TMP (Trioxsalen 或 4,5忆 ,8-Trimethylpsoralen, 三甲基补骨脂素)，剧毒，避光，对其操作都需避光进行 TMP/UV 的处理可使线虫

11、 DNA 发生随机断裂，从而使染色体外的 DNA片段整合至染色体上 TMP/UV 整合法的流程为：a 用 M9 缓冲液将同步好的 L4 龄线虫从培养板中清洗下来，加 TMP(溶于 DMSO，现用现配，存于-80 )使其终浓度为 50 mg/L b 室温下轻柔振荡15 min，将线虫转至未铺菌的 9 cm 培养板上紫外线照射，照射能量为 35 000 滋J/cm2，换算成瞬时功率即 350 滋W/cm2, 100s c 照射完毕后，在培养板上加大肠杆菌 OP50，室避光培养 5h，使线虫活力恢复 d 挑取 15 25 只状态较好的 P0 代个体，每板 1 只，等待大肠杆菌被吃完，挑 100300

12、 只 F2 代，每板 1 只，观察 F4 代是否全部表达注射 DNA 根据我们的经验，如果经紫外线照射后，后代出现很多具有短粗、致死表型的线虫，甚至 1/4 没有后代，则预示整合成功 整合成功的标准是 F4 代全部表达目的基因，若没有，一般没必继续筛选，可认为该克隆的整合不成功细胞程序性死亡的遗传调控机制 现阶段研究已发现了十几个控制细胞凋亡的基因，这些凋亡基因之间通过遗传相互作用组成一条线性的调控途径控制细胞程序性死亡，包括凋亡的激活阶段、凋亡的起始 、凋亡细胞的清除及凋亡细胞内部的 DNA 降解线虫PCA关键阶段EGL-1：促凋亡蛋白，属BCl2蛋白家族，与哺乳动物BAD、BIK/NBK及

13、HRK同源CED-9:抗凋亡蛋白,与人体bcl-2同源CED-4:促凋亡蛋白,同源体为Apaf-1CED-3:凋亡蛋白,与ICE(caspase家族)同源低氧应答模式生物低氧能够引起秀丽线虫发生相应的生理和行为学变化，并可保护机体免受缺氧损伤。秀丽线虫的低氧诱导因子(HIF-1)的恒定性调控通路和人类的相应通路之间具有高度保守性，因此秀丽线虫也已成为研究低氧应答调控通路进化保守性的重要工具之一。阐明秀丽线虫的低氧应答机制将为了解人类低氧相关疾病的发病机制提供有价值的线索。相关机制低氧环境秀丽线虫的非HIF一1介导的低氧应答通路秀丽线虫的氧感知神经回路胰岛素胰岛素样受体DAF-2通路热休克蛋白及其它秀丽线虫中低氧诱导因子HIF1介导的低氧应答m i R N A 作用机制的研究首个时序调控的miRNA 基因 lin-4发现于线虫，转录后形成两种长度的RNA，较小的一个与基因lin-14的mRNA互补配对阻碍其翻译，随后又发现了类似作用的let-7.通过研究miRNA在线虫细胞内对于靶基因翻译表达的阻碍作用，为疾病治疗提供新手段，特别是探究其对RNA病毒侵染的抑制作用其他方面 衰老和寿命控制机制衰老和寿命控制机制DAF-16 蛋白可以转运到细胞核中激活靶基因