生化检验技术基础

1、生化检验技术基础与进展上海长征医院实验诊断科上海长征医院实验诊断科 于嘉屏一、比色分析1 1比色分析理论比色分析理论Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律 A = lgA = lg（I I0 0/I/I）KCL KCL 或或 I II I0 01010-KCL-KCL I I0 0：入射光强度：入射光强度 I I：透过光强度：透过光强度 K K：常数：常数 C C：溶液浓度：溶液浓度 L L：溶液的厚度：溶液的厚度（1 1）郎伯定律）郎伯定律I0ItlL-dIIdl，-dIaIdl，dI/I=-adl积分ItLdI/I-adl得：ln(I0/It)-aLI00将ln改为l

2、g，则为：lg（I0/It）-0.434aLKL令lg（I0/It）A，则AKL（2 2）比尔定律）比尔定律 A AK”CK”C（3 3）郎伯）郎伯- -比尔定律比尔定律 A AKLCKLC透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（epticaleptical density density，D D或或ODOD） A Alglg I I0 0/I/I-lgT-lgT T T1010-A-A1010-KCL-KCL A AKCL

3、KCL当当L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，则表示，则K K即称之为摩即称之为摩尔吸光系数，用尔吸光系数，用表示。表示。当当C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，则，则A A。T T与与A A的关系的关系透光率（透光率（T） 吸光度（吸光度（A）10.0000.750.1250.50.3010.250.6020.170.7700.11.0000.051.3010.012.0000.0013.0002 2影响因素影响因素（1 1）化学因素的影响）化学因素的影响 溶液中溶质可因浓度的改变而发生溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而离解、

4、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。致偏离比尔定律。（2 2）非单色光的影响）非单色光的影响 比尔定律的一个重要条件是单色光，比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。离比尔定律。波长的选择可见绿色带黄深黄桔红深红深紫青紫紫蓝蓝色带绿绿色带蓝深绿Ul

5、tra-violet紫外200400深紫深红桔红深黄绿色带黄暗绿绿色带蓝蓝色带绿紫蓝青紫被测溶液颜色颜色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波长(nm)（3 3）光学因素的影响）光学因素的影响 散射是向空间各个方向，而使透射散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。时，导致吸收值的偏差。（4 4）非平

6、行光通过吸收池时，由于光线的）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度倾斜使厚度L L增大而影响测量值。增大而影响测量值。3 3比色法的误差比色法的误差（1 1）仪器误差）仪器误差 滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。仪器结构，散热不良。（2 2）方法误差）方法误差 （3 3）操作误差）操作误差比色法举例1. 1. 总蛋白总蛋白( (TP)TP)蛋白质中的肽键+Cu 2+ 碱性条件 紫红色络合物引起在波长540560nm范围内吸光度的上升, 与总蛋白含量成正比2. 2. 白蛋白白蛋白( (ALB)ALB)白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2 白蛋白溴甲酚绿

7、复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋白含量成正比二、分光光度计1 1光源光源热光源热光源: : 钨灯、卤钨灯（钨灯、卤钨灯（32032025002500nmnm）气体放电光源：气体放电光源： 氢灯、氘灯（氢灯、氘灯（185185375375nmnm）。）。 氘灯发光强度比氢灯强氘灯发光强度比氢灯强3 35 5倍，是目前倍，是目前紫外光区常用光源。紫外光区常用光源。 2. 2. 单色器单色器 单色器是一种用来把光源发出的复合光单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。置。 (1)(1)棱镜棱镜 玻璃棱镜的折

8、射率大、色散能力也大，玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于适用于3503503000nm3000nm的波长范围。的波长范围。 石英棱镜对紫外光吸收少，适用于石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-195-4000nm4000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低于间分光。但由于石英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力差。玻璃，因而色散能力差。 (2)(2)光栅光栅 光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光

9、栅。因光栅分光在紫外上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。色器。3 3比色杯比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻璃适用于玻璃适用于350nm350nm以上光区，而石英杯以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。则适用于紫外和可见光区。4 4检测器检测器 在分光光度计中，把光信号转在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。变成电信号输出的装置称检测器。 光电池光电池 光电管光电管 光电

10、倍增管光电倍增管 双波长分光光度计 来自光源的光被两个单色器分别分离出来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为波长为1 1和和2 2的两束单色光。经过折波的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差吸光度之差A A。三、酶法分析 酶法分析包括两方面的内容：酶法分析包括两方面的内容： 借助酶来测定某一化合物的浓度，借助酶来测

11、定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借助酶来测定另一种酶的活性，借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺H2O尿素尿素尿素H2O脲酶2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸NADH谷氨酸脱氢酶谷氨酸NAD+H2O肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADPCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖

12、-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O酶催化特点 高度的特异性 高催化效率 作用条件温和酶的活性部位 底物结合部位 催化部位酶的辅助因子 金属离子 辅基和辅酶 NAD ，NADP酶的分类 1. 氧化还原酶 2. 转移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶 5. 异构酶 6. 合成酶酶的系统命名 应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。 乳酸脱氢酶 L-乳酸：NAD+氧化还原酶 肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸转移酶酶的活性单位 一国

13、际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量. IUU U/L 1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量 1国际单位=16.67nKatal 1Katal=6107国际单位酶活性测定 影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。 在最适条件下以求达到最大的反应速度。 但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。酶活性测定的最适条件1. 1.合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度的种类和浓度2. 2.指示酶和辅助酶的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度3. 3.反应混合液的最适反应混合液的最

14、适pHpH，缓冲液种类和，缓冲液种类和浓度浓度4. 4.去除各种抑制剂去除各种抑制剂酶促反应的两个阶段反应级数0级1级P1.可逆反应可逆反应 2.产物抑制产物抑制 3.酶变性失活酶变性失活v=dP/dt4.底物不饱和底物不饱和S时间t酶反应进程和酶浓度曲线酶量E401.E越大，线性反产应期越短物2.E相同，S越小，P20线性反应期越短10505101520时间(min)酶反应时间曲线时间(min)5(t0)反应时间越短，10(t1)线性范围越大15(t2)20(t3)010203040酶量E米氏方程E+SESE+Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+Sv V2SKm米氏曲线SVVmaxKmV

15、max2KmKm米氏常数米氏常数 米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmVmS/(KmS/(KmS)S) 当当SKmSKmSKm时，则时，则v vVmVm，即反应，即反应速度是一个常数，为零级反应。速度是一个常数，为零级反应。 如如SSKmKm时，混合级反应时，混合级反应。米氏常数的意义 如如v v0.5Vm0.5Vm，则，则KmKmSS，KmKm值等于酶促反值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。物浓度。 KmKm等于等于ESES的解离常数；而的解离常数；而KmKm的倒数可代表的倒数可代表酶和底物的亲和力。酶和底物的亲和力。 KmKm是酶

16、的特征性常数，当是酶的特征性常数，当pHpH、温度和离子、温度和离子强度恒定时，强度恒定时，KmKm只和酶及底物的性质有关，只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。而与酶浓度无关。 纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则抑制剂，则KmKm的变化不大。的变化不大。米氏常数的应用（1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可计算某一底，可计算某一底物浓度时的物浓度时的v/Vmv/Vm。（2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，也一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其可算出

17、所需底物浓度为其KmKm的多少的多少倍。倍。（3 3）利用工具酶来测定某一底物的）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。浓度时，可计算工具酶的用量。（4 4）测定几个同工酶对同一底物的）测定几个同工酶对同一底物的KmKm，可估计是原级（，可估计是原级（ KmKm常有差异）常有差异）还是次生性同工酶（还是次生性同工酶（ KmKm接近或相接近或相同）。同）。（5 5）测定正逆方向底物的）测定正逆方向底物的KmKm，可大，可大体知道该酶催化哪一方向为主。体知道该酶催化哪一方向为主。（6 6）如已知一组酶中各酶的）如已知一组酶中各酶的KmKm及其及其相应底物的浓度，有助于寻找限速相应底

18、物的浓度，有助于寻找限速步骤。步骤。Km的求取 Lineweaver-Burk作图法作图法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vm Eadie-Hofstee作图法作图法 vVmKm(v/S) Eisenthal和和Cornish-Bowden作图法作图法 设设Y轴和轴和X轴分别为求取轴分别为求取Vm及及Km的座的座标，将不同标，将不同S浓度点在浓度点在X轴的负侧；相应的轴的负侧；相应的反应速度点在反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在轴上，连接各线，交点在Y轴上的座标为轴上的座标为Vm，在，在X轴上的座标为轴上的座标为Km。酶活性测定的基本知识 酶活性是通过测定酶促反应过程中酶活性是通过测定酶

19、促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得成量，即测定酶促反应的速率来获得的。的。（1 1）定时法）定时法 测定酶反应开始后某一时间内（测定酶反应开始后某一时间内（t t1 1到到t t2 2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。速度的方法称为定时法。 产产 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t t1 1 t t2 2 （2 2）连续监测法）连续监测法 连续测定（每连续测定（每15s15s1min1min监测一次）监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度

20、酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。称为连续监测法，又称动力学法或速率法。这种方法的优点是可将多点的测定结果连这种方法的优点是可将多点的测定结果连接成线，很易找到成直线的区段，来计算接成线，很易找到成直线的区段，来计算酶活性。此法较为准确。酶活性。此法较为准确。 分为直接连续监测法和间接连续监测法。分为直接连续监测法和间接连续监测法。 法法. .连续监测法的测定时间吸光度A3A2A1t1t2t3t4时间（3 3）平衡法）平衡法 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底通过测定酶反应开

21、始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把应时间不成线性，故不能把PP或或SS的总变化量除的总变化量除以以t t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短结果

22、也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。速度，也只得采用平衡法测定。定时法与连续法比较 定时法定时法 条件无限制条件无限制 试剂需量少，经济试剂需量少，经济 采用放射性试剂时，采用放射性试剂时，灵敏度高灵敏度高 结果不能立刻揭晓结果不能立刻揭晓 人工操作多，费时人工操作多，费时 毋需偶联酶毋需偶联酶 产物会生抑制作用产物会生抑制作用 连续法连续法 因偶联酶使条件受限因偶联酶使条件受限制制 需量较大需量较大 与放射性试剂来比，与放射性试剂来比，灵敏度低灵敏度低 结果立刻揭晓结果立刻

23、揭晓 人工操作少人工操作少 偶联酶的费用很大偶联酶的费用很大 偶联作用能消耗产物偶联作用能消耗产物（一）工具酶及酶偶联反应 通过酶偶联反应间接地测出第通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于测测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。具酶。AB酶1CDC（或D）E酶2FGF（或G）H酶3IJ酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶E、H：辅助底物 在利用工具酶的反应中，唯一的限在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。速因子应该是待测化合物或待测酶。

24、对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。以减少或避免干扰测定的副反应。如果工具酶制剂中污染了待测酶会对如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。测定结果产生严重影响。 如天冬氨酸转氨酶（如天冬氨酸转氨酶（ASTAST）测定的工具酶）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（是苹果酸脱氢酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ASTAST，则当，则当ASTAST活性为活性为7U/L7U/L时，测定误差为时，测定误差为6%6%。 而测定丙氨酸转氨酶（而测定丙氨酸转氨酶（A

25、LTALT）的工具酶是）的工具酶是乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT，则当则当ALTALT活性为活性为5U/L5U/L时测定误差也是时测定误差也是6%6%。（二）常用监测物质的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +苹果酸脱氢酶（苹果酸脱氢酶（MDHMDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +谷氨酸脱氢酶（谷氨酸脱氢酶（GLDHGLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +6- 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（磷酸葡萄糖脱氢酶（G6

26、PDG6PD） 动物动物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ + NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有特征性光吸有特征性光吸收，而它们的氧化型收，而它们的氧化型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +则则没有这个吸收峰，没有这个吸收峰，340nm340nm波长处的吸波长处的吸光度与光度与NADNAD（P P）H H的浓度成正比。的浓度成正比。 另外另外NADNAD（P P）H H有强烈的荧光，其激有强烈的荧光，其激发波长为发波长为340nm340nm，发射波长为，发射波长为460460nmnm。max ：3

27、40nm肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADPCK肌酸ATP葡萄糖ATPHK葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADPG6PDH6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基转移酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸ALT丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+LDH乳酸NAD+H2O2 2H H2 2O O2 2指示反应指示反应 葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、酶、胆固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使尿酸、甘油、胆固醇的测定，可使相应底物被相应底物被O O2 2氧化成氧化成H H2 2O O2 2，H H2 2

28、O O2 2可通可通过下列指示反应来检测过下列指示反应来检测。 使单一的色素原显色。无色色素原过氧使单一的色素原显色。无色色素原过氧化物酶（化物酶（PODPOD）存在下被）存在下被H H2 2O O2 2氧化后可生成氧化后可生成有色的色素。有色的色素。 使成对的色素原显色。必须要两个色素使成对的色素原显色。必须要两个色素原共同存在，再在指示酶原共同存在，再在指示酶PODPOD的催化下生成的催化下生成色素。色素。 发光反应。发光反应。H H2 2O O2 2也可用化学发光反应来也可用化学发光反应来监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后，监测，它是凭借某些荧光前身物在氧化后，处于激发状态的分子可发射

29、光子，光子量和处于激发状态的分子可发射光子，光子量和H H2 2O O2 2的浓度成正比。的浓度成正比。葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖氧化酶葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺H2O甘油三酯甘油三酯甘油三酯H2O脂蛋白脂酶甘油脂肪酸甘油ATP甘油激酶-磷酸甘油ADP-磷酸甘油O2甘油磷酸氧化酶磷酸二羟丙酮H2O2H2O2+4-氨基安替比林+ESPAS过氧化物酶醌亚胺H2OESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-间-茴香胺3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：对- -硝基酚硝基酚和有机酸或无机酸形成的酯类和有机

30、酸或无机酸形成的酯类 糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物糖苷酶：对硝基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：谷氨酰转肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：对对- -硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物 故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化故硝基苯酚或硝基苯胺作为底物的结合型化合物均无色，而一旦水解或游离型产物在合物均无色，而一旦水解或游离型产物在pHpH大于大于8 8的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型的碱性条件下能生成黄色的醌类离子型化合物，在化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸收峰，其吸有光吸收峰，其吸光度与浓度成正比。光度与浓度成正比。max：405nm碱性磷

31、酸酶（碱性磷酸酶（ALPALP）磷酸对硝基苯H2OALP磷酸盐对硝基苯酚 - -谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（ -GT-GT）-谷氨酰对硝基苯胺双甘肽-GT谷氨酰基双甘肽对硝基苯胺（三）酶法分析的类型 用工具酶测定体液中代谢物的浓用工具酶测定体液中代谢物的浓度，一般可用两种不同的测定方法。度，一般可用两种不同的测定方法。1 1代谢物浓度的酶法分析代谢物浓度的酶法分析（1 1）终点法）终点法 将待测底物与工具酶保温一定时间后，将待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变成可监测的化合物，然后测定后者全部转变成可监测的化合物，然后测定后者的总量来计算待测物的总量或浓度。的总量来计算待测物的总量或浓度。

32、 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶尿素酶 COCO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脱氢酶醇脱氢酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反应常呈一级反应。反应常呈一级反应。 使待测底物完全转变所需的时间取决于使待测底物完全转变所需的时间取决于加入的工具酶量。加入的工具酶量。（2 2）动力学法）动力学法 待测物不必完全转变成可监测的化待测物不必完全转变成可监测的化合物，而是利用工具酶反应速率来定量合物，而是利用工具酶反应速率来定量其浓度：其浓度： 一是利用零级反应，如待测物是某一是利用零级反应，如待测物是某个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓度可个工具酶的激活剂或抑制剂，其浓

33、度可决定该工具酶的反应速度，可采用此方决定该工具酶的反应速度，可采用此方法。因测定时该工具酶本身及其底物都法。因测定时该工具酶本身及其底物都是足量的，故反应为零级反应。是足量的，故反应为零级反应。 例：测定血清中肝素AT肝素AT（AT为肝素与AT复合物）AT凝血酶凝血酶-AT（无活性）残余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺 二是利用一级反应，本法的基本要求二是利用一级反应，本法的基本要求是作为某一工具酶底物的待测物的浓度是作为某一工具酶底物的待测物的浓度SS必须远小于该工具酶的必须远小于该工具酶的KmKm。此时反应速度。此时反应速度基本上与基本上与SS成正

34、比，呈一级反应。成正比，呈一级反应。 动力学法较终点法具有简便、省时、动力学法较终点法具有简便、省时、干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对干扰少、可测定低浓度物质、不需样品对照以及易于自动化等优点，成为自动化分照以及易于自动化等优点，成为自动化分析的主要方法。但此法必须同时测定标准析的主要方法。但此法必须同时测定标准样品的反应速度，来推算未知样品中待测样品的反应速度，来推算未知样品中待测物的浓度。物的浓度。2 2酶活性测定的酶法分析酶活性测定的酶法分析 这类酶学分析法是用工具酶来测定待这类酶学分析法是用工具酶来测定待测酶的产物以求取待测酶的活性，适合测酶的产物以求取待测酶的活性，适合于待测酶产

35、物不能直接监测的情况。于待测酶产物不能直接监测的情况。 也可有终点法和动力学法两种。也可有终点法和动力学法两种。 （1 1）终点法）终点法 将底物与待测酶反应一定时间后，将底物与待测酶反应一定时间后，终止反应，再用指示酶测定该时间终止反应，再用指示酶测定该时间内产物的生成量即可算出酶活性。内产物的生成量即可算出酶活性。 （2）偶联反应的基本动力学SExP1EiP2 应先将样品与工具酶预保温，使样品中的应先将样品与工具酶预保温，使样品中的内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物内源性干扰物充分催化消耗，然后加入底物S S起动反应。起动反应。 起动后，因起动后，因P P从零开始升高，故工具酶反应从零

36、开始升高，故工具酶反应速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这速度也较低，不能代表待测酶反应速度，这一时期称为延滞期。一时期称为延滞期。 随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶随着反应进行，进入恒态期，只要工具酶用量足够，就能正确地反映酶的活性用量足够，就能正确地反映酶的活性. . A 延迟期 恒态期 非恒态期 1.5 1.0 SExP1EiP2 0.5 0 30 60 90 120 150 180 秒 （以NADH减少为指示反应） 如Ei用量过少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可导致P1的逐渐堆积，不能成为恒态或其延滞期极长。但如Ei用量足够，Vi等于或大于V

37、x，则P1一旦生成可较快或很快转变成P2，P1产生与消失速度一致而成为恒态。（四）酶活性浓度的计算Vt106U/L（A/min） VsLA 吸光度变化吸光度变化V Vt t为反应系统总体积为反应系统总体积V Vs s为样品体积为样品体积 为被测物的摩尔吸光系数为被测物的摩尔吸光系数( (molmol-1 -1 cm cm-1 -1) )L L为光径为光径10106 6是将是将molmol转化成转化成molmol。常数K值的意义和设置 Vt106U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 常数K值的检验 ：pHpH；温度；单色光；仪器信号接收；温度；单色光；仪器信号接

38、收V V：仪器加样系统：仪器加样系统 对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基对一些性质稳定的物质如对硝基酚、对硝基苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们苯胺，可以用高纯试剂配成标准品，将它们作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光作为标本进行酶的测定，根据其浓度和吸光度变化可计算出实际度变化可计算出实际K K值。值。 对对NAD(P)HNAD(P)H，可使用测葡萄糖试剂盒，对，可使用测葡萄糖试剂盒，对已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，已知浓度的葡萄糖标准品进行终点法测定，此法产生与葡萄糖相等摩尔数的此法产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)HNAD(P)H，故不难从吸光度变化求出故不难从吸光度

39、变化求出K K值。值。 利用标准管的方法较简单，但标准利用标准管的方法较简单，但标准管的浓度必须在该比色法或紫外分光光管的浓度必须在该比色法或紫外分光光度法测定的浓度线性范围内。标准曲线度法测定的浓度线性范围内。标准曲线法可得浓度和吸光度的线性范围，消除法可得浓度和吸光度的线性范围，消除浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线浓度过高偏离线性的影响，但标准曲线的制备时间与测定样品的时间不同，容的制备时间与测定样品的时间不同，容易产生试剂批号、配制、实验温度、仪易产生试剂批号、配制、实验温度、仪器工作状态等因素造成的误差。器工作状态等因素造成的误差。单试剂、双试剂、液体试剂1. 1. 单试剂的优缺点单

40、试剂的优缺点 优点：优点：操作简便适用于各类生化分析仪操作简便适用于各类生化分析仪 缺点：缺点：配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性配方复杂（稳定剂、掩蔽剂），稳定性差，不能完全避免内外源物质干扰。差，不能完全避免内外源物质干扰。2. 2. 双试剂的特点双试剂的特点 （1 1）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物）可较彻底排除样品空白和内外源干扰物 （2 2）更加符合酶偶联反应的特性和过程）更加符合酶偶联反应的特性和过程 （3 3）试剂配方简单）试剂配方简单 （4 4）试剂稳定，便于储存，运输和使用）试剂稳定，便于储存，运输和使用 （5 5）可用抑制法直接测定某些同工酶）可用抑制法直接测定某些同工

41、酶3. 3. 液体试剂的优点液体试剂的优点 （1 1）不需手工调制，省工省时）不需手工调制，省工省时 （2 2）试剂批间差小，重复性好）试剂批间差小，重复性好 （3 3）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起）杜绝干粉试剂重溶时因水质差引起试剂变质试剂变质 （4 4）有利于急诊标本）有利于急诊标本 （5 5）按需取量，避免浪费）按需取量，避免浪费自动生化分析仪主要参数1.1. 测定方法学类型的选择测定方法学类型的选择: : 终点法终点法, ,速率速率法法, ,固定时间法固定时间法2.2. 温度温度3.3. 波长波长4.4. 样品与试剂量样品与试剂量5.5. 延迟时间延迟时间6.6. 测定时间测定时间7

42、.7. 浓度校正因子浓度校正因子四、免疫浊度分析法 抗体（抗体（AbAb）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（AgAg）反应，）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形于反应溶液中的微粒。在沉淀反应中形成的复合物微粒具有特殊的光学性质，成的复合物微粒具有特殊的光学性质，可用仪器检测，提高了方法的速度、灵可用仪器检测，提高了方法的速度、灵敏度和易操作性。敏度和易操作性。抗原-抗体沉淀反应的特征1. 1. 抗体过剩区：抗体过剩区：随着抗原浓度增加，随着抗原浓度增加，ICIC也相应增加，浊度增加。也相应增加，浊度增加。2. 2. 等价点：

43、等价点：抗原抗体相当时，所有抗体抗原抗体相当时，所有抗体与抗原形成与抗原形成ICIC，浊度最大，达到等价点。，浊度最大，达到等价点。3. 3. 抗原过剩区：抗原过剩区：抗原过量存在，不但不抗原过量存在，不但不会形成更多的会形成更多的ICIC，反而会引起原先的，反而会引起原先的ICIC溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结溶解，浊度下降，产生虚假的低浓度结果。果。1 1透射比浊测定法透射比浊测定法 是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。这一点与分光光度测定法极为类似。用这种这一点与分光光

44、度测定法极为类似。用这种方法时，多用聚乙二醇（方法时，多用聚乙二醇（PEGPEG）作为反应增）作为反应增强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗体复合物的溶解度。体复合物的溶解度。2 2散射比浊测定法散射比浊测定法 它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。它是直接测定溶液中微粒所散射的光强。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。散射比浊法也已经用于自动分析仪器中。3 3免疫浊度测定中应注意的问题免疫浊度测定中应注意的问题（1 1）伪浊度的影响。）伪浊度的影响。 非特异的交叉反应非特异的交叉反应 增浊剂浓度增浊剂浓度 反应时间反应时间 样品本身的浊度样品本身的浊度

45、试剂的污染和变质试剂的污染和变质 器材不够清洁器材不够清洁(2)(2)钩状效应（钩状效应（hook effecthook effect）的影响。当）的影响。当AgAg和和AbAb浓度比例不当时，不能有效浓度比例不当时，不能有效地形成免疫复合物，产生弱阳性甚地形成免疫复合物，产生弱阳性甚至假阴性结果。至假阴性结果。(3)(3)严格的室内质控是极必要的。严格的室内质控是极必要的。(4)(4)标准曲线的制作标准曲线的制作. .五、方法学评价（一）准确度试验 准确度是指测定值与准确度是指测定值与“真值真值”的符合程的符合程度。是评价一项实验方法是否可取的重度。是评价一项实验方法是否可取的重要指标。要指

46、标。 1 1标准物鉴定标准物鉴定 为了确定和评价方法的准确性，常用基为了确定和评价方法的准确性，常用基准标准液或参考血清为样本进行检测，准标准液或参考血清为样本进行检测，所得结果经统计学处理，以衡量方法的所得结果经统计学处理，以衡量方法的准确性。准确性。2 2回收试验回收试验 回收率的计算是（回收值回收率的计算是（回收值/ /加入值）加入值）100100，这里的回收值是指标本中，这里的回收值是指标本中加入标准液后的测定值减去标本原加入标准液后的测定值减去标本原来的测定值。回收率达到来的测定值。回收率达到1001005 5者为准确性符合要求的方法。者为准确性符合要求的方法。回收试验应注意：回收试

47、验应注意： 样品的选用样品的选用 样品最好应用新鲜混合血清。样品最好应用新鲜混合血清。 标准物的加入标准物的加入 应先配制成适当浓度的标准应先配制成适当浓度的标准物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液物溶液，再加入到基础样品中。所加标准溶液量越少越好。量越少越好。 标准物的加入浓度标准物的加入浓度 最好同时设计几个加入最好同时设计几个加入不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的不同浓度标准液的试验样品。加入标准液后的试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。试验样品的总浓度不能超过本方法的线性范围。 操作准确操作准确 标准液的加入量必须准确无误，标准液的加入量必须准确无误，应经多次试验。应经

48、多次试验。（二）精密度试验 目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度。目前常以重复性试验来衡量一个方法的精密度。一般来说，标准差、变异系数（一般来说，标准差、变异系数（CVCVs/xs/x100100）小的实验方法精密。小的实验方法精密。 1 1批内精密度试验批内精密度试验 取一份样品，用欲测项目实取一份样品，用欲测项目实验方法进行操作，反复测定验方法进行操作，反复测定2020次以上，计算每一次以上，计算每一次的测定结果，然后计算次的测定结果，然后计算x x、s s、CVCV。 2 2批间精密度试验批间精密度试验 这种试验也是同一份标本进这种试验也是同一份标本进行重复测定，至少为行重复测定，至

49、少为2020次。但是重复测定不是在次。但是重复测定不是在一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，再一天内完成，而是每天随患者标本一起测定，再计算计算x x、s s、CVCV。（三）灵敏度试验 灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物灵敏度是单位浓度变化所引起的指示物理量的变化。在定量分析中是指被检测理量的变化。在定量分析中是指被检测物单位浓度的变化所引起的物理量的变物单位浓度的变化所引起的物理量的变化。化。 所选用的方法，应进行线性试验，选用所选用的方法，应进行线性试验，选用线性范围宽度适宜的方法。线性检验所线性范围宽度适宜的方法。线性检验所得结果，可用回归方程（得结果，可用回归方程（Y Ya ab

50、XbX）处）处理，回归系数（理，回归系数（b b）为灵敏度大小的指标，）为灵敏度大小的指标，回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不回归系数大，灵敏度高，反之亦然。不同方法也可用回归系数进行比较，回归同方法也可用回归系数进行比较，回归系数大的灵敏度高。系数大的灵敏度高。（四）线性试验 线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种线性试验是衡量一个方法的检测范围的一种实验。通过线性试验，可以了解该方法的最实验。通过线性试验，可以了解该方法的最高检测值和最低检测值。高检测值和最低检测值。 超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果超出上下限值的结果是不可靠的，为使结果可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释可靠，遇到这种情况应加大样品用量或稀释样品后再次检测。样品后再次检测。 线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一线性试验的方法基本同标准曲线的制备。一般先进行线性试验，然后在线性范围内制备般先进行线性试验，然后在线性范围内制备标准曲线。标准曲线。（五）特异性及干扰试验 干扰是指标本中存在分析物以外的其他物质，干扰是指标本中存在分析物以外的其他物质，致使测定结果有误差。致使测定结果有误差。 首先确定被试的可疑干扰物是否会引起误差，首先确定被试的可疑干扰物是否会引起误差，再进一步分析和试验误差的原因，是由于缺乏特异再进一步分析和