第六章热原的去除及验证

1、热原的去除及验证热原(Pyrogens)是微生的代谢产物。大多数细菌都能产生，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌所产生的热原。霉菌甚至病毒也能产生热原。含有热原的输液注入人体，大约半小时以后，就使人体发冷、寒战、体温升高、身痛、出汗、恶心呕吐等不良反应，有时体温可升至40°C，严重者出现昏迷、虚脱，甚至有生命危险。热原反应的温度变化曲线，因热原种类不同而有差异。一般先经过一个短的潜伏期后，温度略微上升，然后又略微下降，接着又很快上升，并出现一个高峰，根据这种现象而导致一个假设：即细菌性热原本身不引起发热反应。但热原使多型核白细胞(polymorphonuclerleucocyte)及其他

2、细胞释放一种内源性热原(endogenouspyrogen)，虽然有人提出内源性热原可能是蛋白质或脂蛋白(lipoprotein)组成，但其确切组成尚未肯完，它作用于视丘下部体温调节中枢，可能引起5-羟色胺的升高而导致发热1，热原的致热量因菌种而异，由于注射途径不同，引起发热反应的程度也有差异。1.热原的组成热原是微生物的一种内毒素，它存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖(lipopolysaccharide)是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性，因而大致可以认为内毒素=热原=脂多糖。脂多糖的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分出来的脂多

3、糖中有68%69%的糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、氨基葡萄糖、鼠李糖等)，1213%的类脂化合物，7%的有机磷和其它一些成分。热原的分子量一般为10105左右。热原的结构2.热原的性质(1)耐热性一般说来，热原在60°C加热1小时不受影响，100°C也不会发生热解，在180°C34小时，250C3045分钟或650C1分钟可使热原彻底破坏。虽然已经发现某些热原具有热不稳定性，但在通常注射剂灭菌的条件下，往往不足以使热原破坏，这点必须引起注意；(2) 滤过性热原体积小，约在15nm之间，故一般滤器均可通过。即使微孔滤膜，也不能截留。但活性炭可以吸附热原；(3) 水溶性热

4、原能溶于水；(4) 不挥发性热原本身不挥发，但在蒸馏时，往往可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水，故应设法防止；(5) 吸附性热原对许多分子有亲和性，优其是蛋白质类，因此较难去除。(5) 其它热原能耐受酸碱和化学试剂的处理，但热原能被强酸、强碱破坏，也能被强氧化剂如高锰酸钾或过氧化氢所钝化，超声波也能破坏热原。热原对干涸的耐受性较强。3. 污染热原的途径(1)从溶剂中带入这是注射剂出现热原的主要原因。蒸馏器结构不合理，操作不当，注射用水贮藏时间过长都会污染热原。故应使用新鲜注射用水，最好随蒸随用；(2) 从原料中带入容易滋长微生物的药物，如葡萄糖因贮存年久包装损坏常致污染热原。用生物方法制造的药品如右旋糖

5、酐、水解蛋白或抗生素等常因致热物质未除尽而引起发热反应；(3) 从容器、用具、管道和装置等带入因此在生产中对这些容器用具等物要认真处理，合格后方能使用；(4) 制备过程中的污染制备过程中，由于室内卫生条件差，操作时间长，装置不密闭，均增加污染细菌的机会，而可能产生热原；(5) 从输液器带入有时输液本身不含热原，但仍发现热原反应。这往往是由于输液器具(如输液吊瓶、胶皮管等)污染所致。4. 热原的除去方法除热原的定义是除去所有使病人体温升高的物质。制药生产中指除去内毒素。除热原的方法主要有物理去除，钝化。物理去除法包括反渗透法、蒸馏法、超滤法、活性炭吸附法、疏水性吸附法、静电修饰过滤法、吸附色谱法

6、、用粘合剂或色谱柱提取、漂洗。（1）蒸馏法水系统中使用的最古老的方法。机理简单，包括水的双相转变，沸点使液体变为蒸气，蒸气挥发，分子量大的热原被留下，设计良好的隔析使气体凝固，重力使其下降，使热原的分子量加大。通常需要>80oC再循环温度。（2）超滤法超滤的原理通常认为是分子筛，其有效性与筛的大小有关。LPS的分子量约为10,000-20,000道尔顿，因此可以被10,000道尔顿的超滤膜除去。实际上热原聚合物的分了量约100,000道尔顿，所以0.1um的滤膜通常能有效的除去热原。（3）活性炭吸附法古老的方法之一，很早就有文献记载。活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤脱色作用，所以

7、在注射剂中使用较广。常用量为0.1%0.5%。此外还可用活性炭与白陶土合用除去热原。活性炭适用的pH范围较宽，不受电解质浓度影响。这种方法在制剂应用较广，如生理盐水，葡萄糖和抗生素等的除热原。缺点是对某些活性成份有吸附。（4）疏水吸附法很多的脂肪族聚合物对热原有吸附性，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二乙烯，聚四氟乙烯。这些聚合物的非极性基团使滤膜有疏水性。膜和脂多糖A之间的疏水吸附是溶液中的热原被吸附的原因。（5）静电修饰过滤这种滤膜利用两种作用方式：pH>2.0时原热带负电其行为像阴离子，因此滤膜中使用阳离子吸附热原。也利用滤膜中纤维分支与热原的碰撞、沉积、筛分来捕获热原。这些滤膜通常较厚，也有

8、一些仅带正电的滤膜。（6）吸附色谱法这是一个应有较广的方法，吸附剂包括PolymixinB,SubstrateAnalogueSepharose，LALSepharose，DEAESepharose。Sepharose色谱柱可以在很长的时间内保留吸附能力。并能用1%sodiumdeoxycholate再生。（7）粘合剂提取法有很多化学物的特性可用以实验，优其是热原的检查，最近ProfosAG使用相技术提取热原。但大多数的这些粘合系统不适合于大规模的应用而只能用于实验。（8）用反渗透法通过三醋酸纤维膜除去热原这是近几年发展起来有实用价值的新方法。反渗透膜是很薄的纤维或聚酰胺膜，通过分子筛的形式阻

9、碍原热聚合物通过滤膜，因为这样某些产品的使用有所限制。良好的反渗透膜可以去除99.5%-99.9%的热原，即使负荷达10,000EU/ml。常见的问题是膜穿孔。（9）漂洗法严格来说漂洗不是除热原的方法，但是在很多情况下能成功的除去小量的热原。注射用水清洗系统经常用于处理大容器，管道。热和超声可以提高效率。由于其内在的变化性，漂洗程序要仔细的验证。钝化法（10）离子交换法国内有用#301弱碱性阴离子交换树脂10%与#122弱酸性阳离子交换树脂8%成功地除去丙种胎盘球蛋白注射液中的热原；（11）凝胶滤过去国内有用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶（分子筛）制备无热原去离子水；钝化包括热、湿和干，化学钝化和部分

10、破坏，氧化（H202）。（12）干热除热原对于注射用的针筒或其他玻璃器皿，在洗涤干燥后，于250°C加热30分钟以上，可以破坏热原；需要验证说明热原的3个对数下降。要求进行热原挑战性试验，例如用热原挑战瓶子和ECVs来建立干热除热原过程导致的热原的对数下降。（13）酸碱化学钝化玻璃容器、用具还可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，可将热原破坏；酸水解作用于酸不稳定的ketosidic链，使Lipid-A从热原分子中分离。KD0和核心polysaccharides是整个分子中脂部分的绝以载体。一旦出现分离，脂多糖A不溶于水，热原活性下降或消失。碱水解靠脂肪酸的皂化，使热原分子发生化学

11、和生化变化。一般来说碱水解的效力低于酸水解，0.25NNa0H，56oC，1hour仅能中度破坏热原。加入95%乙醇或80%dimethylsulfoxide可以提高效果，但工艺难于处理不能广泛应用。（14）过氧化氢早在1912Hort&Penfolc证实用双氧水清洗后SalmonellaTyphosa细菌失去致热能力。双氧水对热原的作用机理未明。可能是脂多糖A过氧化所致。热可以增加过氧化氢的作用。本法优于酸碱法，但可能使产品变质。（四）原水处理原水处理方法有离子交换法与电渗析法及反渗透法，离子交换法制得的离子交换水主要供蒸馏法制备注射用水使用，也可用于洗瓶，但不得用来配制注射液，因其

12、在除热原方面还不如蒸馏法那样可靠，有时还带有乳光。电渗析法与反渗透法广泛用于原水预处理，供离子交换法使用，以减轻离子交换树脂的负担。前面已提到，热原是微生物污染产生的致热物质，是病人注射后发热反应的根源。这些致热物质是菌菌外壁的脂多糖或内毒素。由于它的耐热性，灭菌后或过滤后仍可以水中存在。注射用水应采用合适的方法式去除热原。由于热原是有机物，可以将它们氧化为易从水中去除的气体或非挥发固体。高锰酸钾是常用的氧化剂，小量氢氧化钡可以增加其效率，氢氧化钡可以碱化溶液，使酸生成非挥发性钡盐。这两种试剂加入多次蒸馏的水中，再多次蒸馏，在无菌条件下收。如果很好的生产，用这种方法可以得到高纯，无菌，无热原的

13、水。不管采用哪种方法均要进行热原检查以保证无热原。除热原工艺举例：烘箱、管道灭菌器、洗瓶、胶塞清洗，例如用氢氧化钠清洗，过滤。5. 验证：工艺过程中只要存在除热原步骤，不论采用何种除热原的方法均应进行验证。验证的目标是获得热原的3个对数单位下降。对数下降的计算：对数下降=未处理样品热原的对数值-处理后样品热原对数值以干热除热原为例:未处理的样品的热原值=3,200EU/ml处理后样品的热原值=0.7EU/ml对数下降=Log(3,200)-Log(0.7)=3.505-(-0.155)=3.7热原挑战试验大多数情况下热原挑战试验是验证的必须部分。这需要丞载一定浓度的热原的载体。载体必须能代表工

14、艺要处理的实际的产品。所用的瓶子：制备50,000EU/ml浓度的热原溶液。每瓶加入100l热原溶液，空气干燥或冻干。烘试验瓶子，保留未烘的瓶子作对照用。用1mlLAL水溶液复溶，彻底涡旋，将对照样品稀释至1/10,000，测定每个瓶子。用动力学方法所得的结果如下:ControlVialsDilutionEU/inlTotalEU/vial110,0000.363600210,0000313100310,0000.333300average=3200410,0000.292900510,0000313100TestVialsLogReduction1Undilute<0.005<0.005>5.8考虑点：采用干热除热原时要研究工艺的冷点。这些信息可以用以样正瓶了在烘箱或管道灭菌器中的位置。技术人员要知道可以热处理的物品与只能清洗的产品的明显区别。热处理与时间和温度有关。清洗与