化学微生物学第7章 微生物转化

1、微生物转化 UM-BBD 第一节 微生物转化历史 一、转化历史 二、酶促转化历史 三、与传统化学的比较二 微生物转化方法 从20世纪50年代开始，微生物学家通过有机化学、物理学、生物化学和遗传基因学等学科的帮助，来研究了微生物代谢产物中的化学组成以及生命活动中酶和酶的化学反应使生物学科向分子水平发展；同时也提供了微生物学向化学学科的渗透。微生物学研究者应用现代的生物技术来帮助生物化学和有机化学工作者解决一些复杂和疑难的微生物代谢产物和化学合成的反应创造出不少人工合成的新化合物，推动了生物化学和有机化学的发展。 微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物

2、进行结构修饰，也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。 微生物作为一个生命体，其体积虽小，但有一套自身特异性的酶体系。在它的生长过程中有无数酶的参与，合成酶、水解酶、异构酶、氧化酶、还原酶等都可能对加入其中的底物发生作用，使其结构发生变化。 正因为微生物有着这独特的优点，微生物转化微生物转化就具备了生物量积累快、转化时间短、转化酶表达效率高、便于工业化生产的特点。特点。 微生物转化历史悠久，早在2500年前的春秋战国时期，人们就已经知道制酱和醋。在宋代，采用老的曲子进行接种，还根据酸大米和明矾水在较高温下培养制造红曲。不过当时人们并没有认识到可以利

3、用微生物来合成化学物质。 因此一般认为微生物转化微生物转化研究始于研究始于1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸，但工业化微生物转化的重要里程碑重要里程碑应该是20世纪50年代美国普强药厂的Murray和Peterson利用微生物黑根霉(Rhizonpus nigricans)的羟化酶将黄体酮转化为11-羟基黄体酮，即对甾体化合物的结构改造。 利用微生物的作用来进行某种化学反应称为微生物转化反应(microbial transformation or microbial bioconversion)。 准确地说应该是利用微生物代谢过程中某一个酶或者一组酶系对底物进行催化反应称为微生物转化

4、反应。 随着生物学科进一步发展，特别是固定化细胞、诱变和基因重组等重要的生物技术的发展，不仅使得生物转化成倍地提高转化率，并且能将几种不同合成基因构建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。第一节微生物转化的反应 随着现代生物技术的不断进步，特别是固定化细胞、诱变和基因重组等的发展，使微生物转化的转化率成倍提高，也为天然药物结构修饰带来了广大的发展空间。 不同类的微生物都含有不同的酶系。现在将目前应用和研究上用得比较多的微生物按化学反应分类。1应用于氧化反应 (1)脱氢反应脱氢反应 应用于脱氢反应的主要是细菌(2)羟基化反应应用于羟基化反

5、应的主要是放线菌2、应用于水解反应 应用于水解反应的主要是细菌、酵母菌和霉菌3、应用于还原反应 应用于还原反应的主要是酵母菌和霉菌。4、应用于酰基化反应 应用于酰基化反应的主要是细菌5、应用于降解反应 应用于降解反应的主要是细菌6、应用于脱水反应 应用于脱水反应的主要是细菌和霉菌第二节微生物转化的一般过程 微生物转化实验概要过程如下： 选择需要的菌株 培养成熟菌丝或孢子 选择合适的转化方式 转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化 转化液的分离提取 产品纯化1选择菌种选择菌种 选择好的菌种是做好微生物转化反应的关键；根据微生物转化反应的类型，选择哪类微生物含这类反应的酶。一般可以向国家或地方保管菌种

6、机构去函索取。2. 制备培养基制备培养基 按微生物转化菌种的培养特征和转化反应需要配制培养基；一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满和富含需要的酶。3 加转他底物加转他底物 加底物时有两个同等重要的影响因素：选择合适的菌种生长期加底物；选择加底物的方法和方式。4 添加刺激剂或抑制剂添加刺激剂或抑制剂 添加抑制剂是抑制酶副反应或抑制其他反应不良酶的生长；添加刺激剂是提高酶活力和增加酶生长量。5 控制好转化反应培养时间控制好转化反应培养时间 按有关微生物转化反应各种因素，控制好转化反应培养终点电，使底物转化达到最大反应完全值。6 调控好影响因素调控好影响因素 调控好整个转化过程中各项影响因素。7 控

7、制好转化反应终点控制好转化反应终点 当取样分析反映转化培养液中转化产物积累不再增加时，立刻采用物理方法将菌丝体及培养物除去来停止转化反应。8 分离纯化转化产物分离纯化转化产物 此时转化产物已与生物转化系统分开，可按化学方法将产物分离提纯三几种常用的微生物转化方法 随着固定化细胞、诱变和基因重组等重要的生物技术的发展，不仅使得微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用，使生物转化成倍地提高转化率，并且使得微生物转化方法更加丰富。现在将几种微生物转化方法简介如下。1、分批培养转化法 分批培养(batch culture)转化法是在摇瓶和发酵罐中待菌体生长到一定阶段加入底物进行转化的方法。 底物加入

8、时间因菌种和底物不同而各异，一般在对数生长期，但也有在延迟期和稳定期加入的。2、利用酶进行生物转化 直接从微生物体内或发酵液中将酶提出在体外对底物进行生物催化。 可以经过多步处理得到纯度较高的酶。也可以是粗酶。 现在微生物来源的酶已广泛应用于食品、医药、化工及环保等行业3、应用渗透细胞进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化主要主要是促进底物渗入胞内，与酶充分接触，同时便于转化产物透出胞外，这种方法更适合于胞内酶作用的生物转化。 增大细胞渗透性或改变细胞膜孔，一般采用表面活性剂或有机溶剂，有时也可利用抗生素来增加细胞膜的渗透性，但用量应适当控制，以免杀死微生物。4、应用孢子进行生物转化 细菌的孢

9、子一般无活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有较高的酶活力，与菌丝体比较具有杂质相对少的优点。 孢子转化需要注意的是不能让孢子萌芽需要注意的是不能让孢子萌芽，否则不能保持稳定的生物转化活力。 应用于生物转化的孢子悬浮液和培养基成分与静止细胞转化法相似也是采用不完采用不完全培养基，全培养基，仅含有缓冲液及葡萄糖等产生能量的碳源。5、应用固定化细胞进行生物转化 固定化细胞在适宜的转化条件下进行生物转化能保持细胞相对活的状态，它的最大最大优点是优点是可以长期反复使用，有的能维持有效催化达数月之久。 另外使用固定化细胞还使得产物提取简单，便于自动化和大规模的工业化生产。 目前常用的固定化方法有聚丙烯酰

10、胺聚合法和卡拉胶包埋法。6、应用干燥细胞进行生物转化 干燥细胞转化法实际上是另一种静息细胞转化法，便于贮备随时使用。干燥细胞的制备有以下两种常用方法。 冰冻干燥法冰冻干燥法：将培养好的菌丝液，通过离心或过滤，洗涤后获得干净的菌丝体并重新悬浮于稀的缓冲液或纯水中，冰冻后抽真空，直接升华除去水分得到蓬松的粉末。这种干燥菌丝体在冰冻保存的条件下可以保持活力达数年之久，适合于大规模的工业化生产。 丙酮干粉制备法丙酮干粉制备法： 将菌丝体悬浮于一20的丙酮中处理3次，每次获得泥浆状的丙酮液，用抽气过滤进行收集，最后用冷乙醚洗涤，以帮助洗去残余的丙酮。 丙酮干粉剂必须冰冻贮藏，以供随时使用。7 静息细胞转

11、化法 静息细胞转化法静息细胞转化法是指将微生物培养至定阶段后分离出菌丝体，将其重新悬浮于不完全培养基(缺少某种营养物质，如氮源等)中，使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态，再加入底物，在适当的温度、pH和振荡条件下进行转化的方法。 它是一种将生长影响减至最小的生物转化它是一种将生长影响减至最小的生物转化方法。方法。四 微生物转化反应的特点 微生物转化反应，可以用静止地按洗涤细胞进行研究也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细胞进行生产等。 它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点 1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快快 在微生物转化的反

12、应中一般无需高压、强热等比较苛刻的条件，只需在常温和pH为7左右的环境下进行反应即可； 原料除了普通的培养基和底物外没有其他化学品，一般普遍认为公害比较少； 设备简单，反应条件比较温和，生产安全。 微生物转化反应是酶催化的反应。在最合适条件下，一秒内酶能催化底物转化成产物的分子个数数量级是102lO62、可以减少反应步骤 随着现代生物技术的迅速发展，酶合成基因构建的基因工程菌可以把需要几步催化合成的中间体在一次发酵中转化完成。 将几步中间体合成的酶通过基因构建到同一工程菌中，使在发酵法转化时需要几步催化台成的中间体只要一步就可以转化成功。 如维生素c生物合成中基因重组葡萄糖酸氧化杆菌的代谢工程

13、菌，将L-山梨醇脱氢酶基因和L-山梨酮脱氢酶基因，通过基因重组构建出一个工程菌株，发酵过程可以在同一次转化发酵中将D一山梨醇转化成一酮一L古洛糖酸。3、对立体结构合成上具有高度的专一选择性、对立体结构合成上具有高度的专一选择性 微生物转化反应其实也是一种酶反应对底物作用时，具有高度的立体结构选择性。 微生物转化反应不仅对结构有化学选择性，还有区域选择性、面选择性和对映异构选择性。 严格的立体结构选择性对天然药物微生物转化来说是非常重要的。 因为药物的异构不仅无用或者低效，并且会带来副作用，有时会有相反的药效和强力的毒性。 特别是生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效对对

14、映体结构的要求很高，往往具有严格对映体结构要求，这是有机化学合成等方法根难达到的。4、回收率高、成本低、回收率高、成本低 微生物转化反应是在细胞内进行，保持原来整体酶系比较符合生物催化所需环境和条件。 在氧化一还原等催化反应时不需要添加辅酶；辅酶往往很不稳定，难以分离提取，从这点来说微生物转化比酶法转化要好多了。 微生物 反应可以持续进行、反应量大、回收率高并可以大规模工业化生产。从设备和原料方面来说生产成本低于酶法和化学合成法第三节 微生物转化的影响因素 利用微生物代谢过程中某一个酶或一组酶系对底物进行催化反应，称为微生物转化反应。 微生物转化反应本质上是本质上是一个酶反应，因此，同酶反应一

15、样，在这个催化反应过程中涉及一系列的影响因素，其中最为重要的是转化的时间、温度、底物添加方法、酶的抑制剂、酶的诱导剂以及生长调节剂等。 上述因素的变化皆会对转化率有一定的影响。下面分别针对上述因素对微生物转化的影响加以具体叙述一、转化的时间和温度 微生物转化反应本质上是酶反应，是单酶或多酶的催化反应。 既然是酶反应，就存在一个最佳的反应时间，时间太短则转化不完全；时间太长，会造成微生物衰亡及酶失活。 最佳反应时间的确定可以最佳反应时间的确定可以采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层扫描(TLCS)、分光光度法等定量分析手段来完成。 不同的反应类型、不同的微生物、不同的酶，最佳反应

16、时间不同，有的只需几小时，有的则持续数天 温度也是影响转化率的一个重要因素。 温度升高，转化率会提高，但超过一定的限度，会使得酶失活速率也加快，所以只有在一个适当的温度下转化，才能达到最佳转化率。 最佳温度的选择也可通过上述分析检测手段来确定二、底物添加方法 在微生物转化中，根据能否溶于水来分，可以把底物分为两大类，即可溶于水和不可溶于水底物。 能溶于水的底物添加方法中有许多是与培养基中添加碳源的方法相类似，但是其转化率与其添加方法有很大的影响。 对于能溶于水的底物对于能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中进行微生物转化是比较容易的，不过要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否对微生物有毒

17、性。 添加底物的量一般与微生物转化反应的类型，细胞内含酶的多、少、强、弱和底物的化学性质有关； 含酶活力强和含酶量多的微生物进行转化时，添加底物的速度可以快点，底物的量也可以多点。 加底物速度和量要与微生物的耐受能力相挂钩，底物舔加的速度和总量不能超过微生物的耐受范围， 同时产物的积累也会对酶产生抑制，所以必须有一个合适的底物添加量，一般来说，非离子化合物的底物最大投料质量浓度约为10 ，而离子型的底物为5；不同 的微生物对有毒性的底物的耐受性不一致，一般来说在微生物生长期其耐受有毒底物的能力比较低；还得注意的一点是即使对没有毒性的底物，当转化积累到大量的非毒性底物时，也会产生产物抑制现象，所

18、以最好用连续培养发酵随时分离转化得到的产物。 而对于不能溶于水的底物对于不能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中要比添加能溶于水的底物难得多，但是随着现代化生物技术的广泛应用，目前已经有许多种解决方法了。 采用将底物制成细粉末状的固体直接投采用将底物制成细粉末状的固体直接投料。料。 这种投料方式使得转化细胞和粉末底物之间有最好的接触表面积，转化率也会提高。 在甾体转化中常用此法。 将不溶于永的底物溶于能溶于水的有机将不溶于永的底物溶于能溶于水的有机溶剂中来进行添加。溶剂中来进行添加。 这类有机溶剂包括有低级醇(甲醇、乙醇)、丙酮和二甲基亚砜等； 但是这类水能 溶的有机溶剂超过一定量对细胞和

19、酶都会有一定的伤害作用每次添加的量要 尽量少 采用非毒性表面活性物质来分散不溶性底物采用非毒性表面活性物质来分散不溶性底物。 通常应用聚山梨 酯80(吐温一80)等非毒性表面活性物质来分散不溶性底物使得底物和转化液的接触面增大，来提高转化率。 一般操作方法是先配制好表面活性荆质量浓度为3的转化液，然后将不溶水的粉末状底物滴加分散到转化液中进行转化，必要时可用超声波促进分散程度。三、酶的抑制剂 在微生物转化过程中添加酶的抑制剂是为了抑制转化过程中的副反应，保证获得转化的目的产物。 如在采用微生物转化降解胆固醇的侧链的方法制备甾体激素类药物重要中间体雄甾二酮的过程中通过添加含二价铁的螯合剂来抑制开

20、裂甾体母核的副反应。四、酶的诱导剂 在微生物转化过程中，酶活力的总强度是细胞内含酶量乘以细胞总数。 要增加酶活力不仅要增加细胞的投入量，还要诱导细胞内酶量的增加。 酶的合成在整个细胞生命中是根据其生理上的需求来进行调控的。酶可以分为组成酶和诱导酶 组成酶是指在微生物的生长代谢过程中会自然产生的一些酶. 而诱导酶是指在加入一定的诱导物后才会产生或明显地增加产量的一类酶。 对于组成酶来说，微生物转化的酶量主要与微生物的菌体量有关。 在微生物转化反应中许多重要的酶在没有诱导的情况下是检测不到其酶活的，这类酶称为诱导酶。 在微生物对数生长期容易被诱导物诱导产生，因此在对数生长期加入诱导剂是一个最好的时

21、机。 还有一个重要的规律是通常能被转化的底物都具有该转化酶的诱导作用五、生长调节剂 生长调节剂(生物激素)对生物体代谢调节有显著影响。因此，在微生物转化过程中选择合适剂量的生长调节剂可以有效地提高底物的转化。第四节 微生物转化的应用 随着科技的迅速发展，微生物转化得到了不断发展，从近年来的研究可以看出，一一种微生物种微生物可以转化多种多种在分子结构上完全子结构上完全不同不同的物质；不同种微生物不同种微生物对结构相似的结构相似的物质物质可以发生类似的反应。所以微生物转化已成为现代生物工程技术的重要组成部分，广泛应用于有机化合物的合成有机化合物的合成、药物药物前体化合物的转化前体化合物的转化、活性

22、成分筛选活性成分筛选及新药新药开发、药物代谢模型预测等开发、药物代谢模型预测等诸多领域。一在有机合成领域的应用 微生物转化技术由于其高度立体及区域选择性在有机合成领域的应用已经取得了显著的效果,成为有机合成中的一个重要工具。 根据Davis等的统研究，认为应用于微生物转化的酶主要是乙酰转移酶、糖苷酶、糖基转酶、环氧酶、羟基化酶、醛缩酶等。 按照1961年国际生化会议的规定，根据酶催化的反应类型不同，酶可以分为六大类：氧化还原酶类；转移酶类； 水解酶类；裂合酶类；异构酶类；合成酶(连接酶)类。 在有机合成域主要是利用氧化还原酶类和氧化还原酶类和水解酶类水解酶类，大约有23的生物转化是蛋白酶、酯酶

23、和脂肪酶起酯基和氨基的水解反应。 微生物转化应用于有机化合物的合成存在着许多优点，同时也有一些不足之处。 最显著的优点就是高度选择性，包括化学选择性、区域选择性，非对映选择性、对映体选择性，还有反应条件温和，酶种类多样酶量充足、转化效率高、产品质量稳定、对环境污染少等。 缺点是在一些极端的反应条件极端的反应条件下，如过高或过低的pH、温度和高盐的浓度下，酶均易失活微生物转化反应就明显暴露出其不足之处。另外还存在产物和底物的抑制产物和底物的抑制现象，有的底物或产物在一定的浓度下会抑制酶活，从而影响了转化效率。 尽管如此，微生物转化已经成为有机合成的一个重要工具（一）手性化合物合成与拆分 手性是生

24、物体的基本特征，构成生命有机体的分子大都是不对称的手性分子。 人体内在的手性环境可以识别手性药物对映体，使对映体在活性、代谢过程和毒性等方面存在显著差异。 如用于消除孕妇早期妊娠反应的镇静剂“反应反应停停”(thalidomide，沙利度胺)被应用不久，就被发现可以致使婴儿出现畸形，经研究发现具有镇静作用的是其R一对映体而致畸变是由s一对映体引起的。因此必须对不同对映体看成不同的化合物进行研究。 利用微生物转化对手性化合物的合成与拆分与化学拆分相比，有选择性高、步骤简单、成本低、产物回收率高等优点。典型的例子就是典型的例子就是采用生物法半合成头孢菌素采用生物法半合成头孢菌素，通过利用酶的对映体

25、催化专一性，只需两步就可以替代传统的化学生产法。 当前，国际上常认为手性化技术主要有三类：色谱法、化学不对称合成与拆分法、生物合成与拆分法。 前两种方法是前两种方法是手性转移方法，需要手性试剂、手性配基等手性源，而且还经常用到过渡金属配合物作为手性模板，诱导反应中手性中心的建立，所以在制药工业中的应用受到了限制，而且这些方法存在着操作复杂、试剂昂贵、得到产物光学纯度不高等缺点。 生物合成与拆分方法生物合成与拆分方法不仅不需要手性源，还能将非手性化合物转化为手性化合物，并且克服了以上两种方法存在的不足。 这三种手性化技术的优缺点如表1 2所示。表1-2三种手性化技术方法的比较 微生物转化在合成手

26、性化合物领域已经广泛运用。 生物合成手性化合物主要是两类主要是两类：一类是外消旋体拆分拆分为两个光活性对映体；另一类是以外消旋或手性前体由底物，通过酶底物，通过酶催化催化得到不对称的光活性产物。 Snell等利用细菌Rhodococcus AJ270中的腈水合酶对消旋布洛芬酰胺进行拆分拆分，该酶对s-布洛芬酰胺的选择性强，水解速度快，可得到s-布洛芬。 甾体激素的微生物转化是在手性合成研究中应用较早和较成功的例子，通过常规的化学方法很难氧化非活泼的碳氢键，而微生物氧化却很容易做到这一点。 例如黑根霉(Rhizonpus nigricans)的羟化酶能使黄体酮(1一1)转化为11-羟基黄体酮(1

27、-2)图图 手性甾体化合物的微生物转化手性甾体化合物的微生物转化 左旋多巴是L-酪氨酸的衍生物3，4二羟基-L-苯丙氨酸，用于治疗帕金森病。 日本学者A Yamamoto等通过静态细胞生物转化方法，将草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)悬浮于缓冲液，就可以将邻苯二酚(儿茶酚)、丙酮酸和氨缩合成左旋多巴，该生产工艺已经获得专利(图1- 8) 图1-8 微生物转化法制备左旋多巴（二）食品添加剂的合成 食品添加剂常是指在加工食品过程中为了保存或改善食品品质而添加的物质。它们常具有保健、保鲜或改善风味等功能。 这类化合物对人体发挥了重要的生物学作用。因此它们的合成研究备受人们关注，除了传

28、统的化学合成方法外，现在越来越多人也重视其微生物转化合成法。 现就对常见的食品添加剂维生素C和香兰醛微生物转化合成作个简要介绍。1、维生素C的合成 维生素C(Vc)是一种抗氧化剂，可作为食品添加剂，广泛存在于柠檬、柑橘等水果和新鲜蔬菜中，它能用于坏血病的防治和增强机体对感染的抵抗能力，是一种辅助性治疗药物。 众所周知，Vc生产中的某些合成步骤是由微生物转化完成的。 最早在l 935年，Reichstein就选用弱氧化乙酸杆菌(A . Suboxydans)将D一山梨醇转化为L-山梨糖，再经多步化学反应就合成得到Vc。 但到了20世纪70年代。我国学者发明了“二步发酵法”生产Vc ，即在上述的乙

29、酸杆菌转化后，再用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobadter oxydans)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的混合菌使得L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，见图19。 图“二步发酵法”合成维生素c 这一步微生物转化反应较化学合成反应污染减少，合成步骤缩短，合成效率提高了。随着现代生物技术的发展和应用，人们运用基因工程法构建一种新的工程菌它能直接将葡萄糖转化为2-酮基-L-古龙酸。然后只需一步内酯化和烯醇化就制得Vc （代谢工程菌，将L-山梨醇脱氢酶基因和L-山梨醣脱氢酶基因，通过基因重组构建出一个工程菌株，发酵过程可以在同一次转化发酵中将D一山梨醇转化成一酮一L古

30、洛糖酸。）2、 香草醛合成 香草醛(vanillin)又称香兰素是天然香料中最重要的一种。 香料是食品、化妆品和制药工业的重要原料，香料占食品添加剂市场总量的25左右。 长期以来，人们热衷于从天然植物中提取香料，但是由于植物资源有限，含量低，提取困难，因而价格很昂贵。 虽然现在存在有机合成的香料，但是人们更钟情于天然的产物，因此微生物转化也成为了香料合成的一个重要途径。 通过微生物转化方法合成香草醛就是一个典型的成功例子。 它常以阿魏酸为反应起始物利用芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等多种微生物进行一氧化产生香草酸，再通过诺卡氏菌(Nocardia sp. NRRL 5646)中的羧基还原酶系选择性

31、地将香草酸还原成香草醛(图-10) 图1-10 微生物转化法合成香草醛二在新药开发中的应用 新药合成主要是依靠化学合成和生物转化依靠化学合成和生物转化两种途径。两种途径。 化学合成途往主要是化学家们依据理论、自身经验及文献报道，主观地设计合成路线，因此在仿生性和立体结构选择性方面存在一定的难度，甚至很难实现； 相反生物体经长期的演化进化，具有一套自身特异性的酶体系，使得生物转化合成物质的途径处于最佳状态。 生物转化方法通常以天然活性成分为先导化合物利用多种不同催化功能的酶系对其结构进行修饰，从而得到更多结构新颖的化合物，再通过活性筛选，可以寻找新的高效低毒的先导化合物或通过对活性组分中不同成分

32、结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。 而我国天然药物资源比较丰富用天然活性成分作为先导化合物寻找创新药物是一个非常可取的途轻 余伯阳等利用26种工业微生物对阿片类生物碱dihydrothevinone进行微生物转化，经制备性实验分离纯化得到两种主要产物，并鉴定为3-O-Demethyldihydrothevinone和nordihydrothebinone。 通过转化反应动力学分析表明去氧甲基化和去氮甲基化几乎是同时进行的 最后将P450酶抑制剂octylamin入反应体系，结果去氮甲基化反应被选择性抑制，因此说明这两个反应被不同酶催化从而可选择性地制备单一产物nordihydr

33、othebione，其nordihydrothebinone为阿片受体抑制剂的前体。 微生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，并获得高效长效的新一代药物，例如从硝苯地平转化为氨氯地平， prontosil(偶氯磺胺)发展成为磺胺药，这些可以说明微生物转化对新药开发的重要性。三三 作为体外模型预测代谢作为体外模型预测代谢 药物代谢(drug metabolish)是研究药物分子在体内以不同的规模发生的生物化学转化。 药物经代谢后通常发生结构变化，从而引起相应的药理活性及毒性改变，例如代谢失活、代谢活化，它是直接影响药物发挥疗效的关键因素之一。 大部分药物都是有机体的外源性物质，为了保证用药安全，

34、必须充分了解药物在体内的吸收、分布、排泄以及生物转化等过程 药物代谢反应从化学本质上可以分相(phase )代谢反应和相(phase)代谢反应两种类型。 相代谢反应主要是官能团化(functionalization)，包括氧化、还原、水解等反应。药物经过相代谢反应后，极性基团引人药物分子，即在药物分子上形成羧基、羟基、氨基等基团从而使药物分子水溶性增强，便于排泄，同时也改变了原有的官能团，使得药物解毒或活化。 相代谢反应主要是结合反(conjugation)，包括葡萄糖醛酸结合、硫酸结合、谷胱甘肽结合等，药物极性进一步加大，有利于排出体外。 传统的药物代谢研究方法往往是通过收集给药动物的体液(

35、血浆、尿、胆汁)或采用体外离体器官灌流，组织或细胞体外培养、肝微粒体体外温孵等。 这些方法一方面由于生物样品常受到内源性物质的干扰，不易得到纯代谢产物，就算得到其产物量也是极其少的，难以满足结构鉴定和药理活性筛选的需要；另一方面技术要求较高，操作复杂井且消耗大量的实验动物。 体内代谢主要是在酶的参与下进行的，其代谢产物在体外很难通过化学方法合成，而微生物转化就是利用生物体内的酶系对外源性物质进行催化，形成其代谢产物，因此微生物转化已成为研究体内代谢的一种重要的辅助工具。 Simth和Rosazza在研究芳香化合物的微生物羟基化时，注意到微生物代谢物和哺乳动物代谢物有相似性，并于1974年最先提

36、出了“哺乳动物代哺乳动物代谢的微生物模型谢的微生物模型”(microbial models of mammalian metabolism)的概念。 其核心理论核心理论是：真菌和哺乳动物都是真核细胞生物，因此在主要的生理功能中含有类似的酶作用机制，所以两者在外源性化合物的代谢过程中就有相似的代谢系统和过程因此，微生物转化在模拟哺乳动物药物代谢途径具有一定的预见性。 基于这一理论Foster等研究发现Cunninghamella bainieri对普罗帕酮以及甲氧那明的生物转化，与人体内的代谢过程十分类似，提示该菌具有与人体类似的药物代谢酶，并且可以用于药物间相互作用的研究。 近几年，随着人们研

37、究的深入，发现许多微生物体系具有和哺乳动物药物代谢功能非常相似的细胞色素P450同功酶和葡萄糖苷羧酶等，可以进行某些与哺乳动物相同的羟基化、酰化、N一脱烷基化、O-脱烷基化以及葡萄糖醛酸结合等代谢反应。 利用微生物作为体外代谢模型研究哺乳动物代谢有以下优点： 微生物来源广泛种类繁多，可提供大量的筛选模型； 建立微生物转化系统，成本较低，操作简单，易于控制； 可以通过调节优化条件，显著提高代谢产物的收率，经过分离纯化后，可以作为代谢产物的对照品进行药理和毒理研究； 可以减少实验动物用量例1 (一一)-eburnamonine是一种重要的-咔啉生物碱，临床用于改善大脑循环和代谢。该化合物在人体内一

38、个活性代谢物为(6R)-6-hydroxyeburnamonine(1-3)，但却一直没有结构鉴定方面的数据。 Adachi等利用卷枝毛霉(Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO 4563)和呈紫色链霉菌(Striptomyces violens IFO 13486)对底物进行微生物转化。 卷枝毛霉经过72h反应得到三个羟基化产物1-3、1-4和1-5；而呈紫色链霉菌经48h反应, 底物转化为产物1-3和1-4并测出了三种产物的结构式(图1-11)。图1-11 (一)-eburnamonine及其微生物代谢产物例例2 药物维拉帕米维拉帕米在人体内代谢

39、广泛，主要产生C- N键和C一0键断裂的多种氧化代谢产物代谢过程主要涉及CYP3A4、CYPlA2和CYP2C8等酶系。 刘磊等利用短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)对维拉帕米进行微生物转化研究。在转化液中检测到维拉帕米主要形成主要形成C- N键和键和C- O键断裂的键断裂的10种氧种氧化代谢产物，其中化代谢产物，其中N-去短链烷基维拉帕米为主要产物去短链烷基维拉帕米为主要产物，产率大于65，其他代谢产物的产率均小于15%。 对健康受试者口服维拉帕米后的尿液分析，结果表明N-去短链烷基维拉帕米比例为42%是最主要的产物，其他比例均小于10%

40、，而且代谢反应类型也是C-N键和C-N键断裂。 由此可见，无论从药物代谢的氧化反应类型还是从主要代谢产物的种类和比例等方面对比，短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)与人体药 物代谢的结果都比较一致，是研究药物C-N键和C-O键断裂较理想的体外 模型，还可以进行相关的代谢产物的药理活性实验。例3 磷酸苯丙哌林磷酸苯丙哌林(benproperine phosphate)为兼具外周和中枢作用的非成瘾性镇咳药，该药毒性小、不抑制呼吸、不良反应少而轻。 黄海华等利用短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)

41、对苯丙哌林微生物转化进行研究。根据液相色谱和质谱数据推测，转化产物分别为苯丙哌林单羟基化物(约65)、苯丙哌啉双羟基化物和苯丙哌林单羟基化物的硫酸酯结合物。这些转化产物与其在人体内代谢产物基本相同，其区别在于微生物转化不能生成苯丙哌林单羟基葡萄糖苷酸结合物(图1-12)。 因此，通过对苯丙哌林的转化研究，优化转化条件有可能获得人体内苯丙哌林羟基化代谢产物的对照品, 确定其化学结构，辅助推测苯丙哌林在生物体(包括人体)中的部分代谢途径。 从以上的实例可以进一步看出微生物转化可以作为研究药物体内代谢的一个重要工具。 通过筛选出能产生动物体内药物代谢产物的生物体系，调节优化条件，不仅可以预测药物在人

42、体的代谢过程，还可以为体内代谢提供充足的对照品或产物以供结构鉴定和活性筛选。第五节第五节 新技术在微生物转化的中新技术在微生物转化的中应用应用 随着现代生物科学和生物技术的迅速发展，以及一些分析测试技术的应用，微生物转化也得到了进一步的发展。 基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系，不仅可使转化的效率成倍增长，而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。 同时，一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化的在线检测。一、基因工程技术在微生物转化中的应用 随着近年来分子生物学的发展，人们对基因工程的认识也

43、逐步加深，这为微生物转化提供了新的思路。 基因工程技术的发展和实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应的酶，即使其量微不足道，应用基因重组技术，通过基因扩增与增强表达，人们就可能建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，从而进一步构建成新一代的催化剂固定化工程菌或固定化工程细胞。 如，应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，反应液含丝氨酸超过400gL，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度达到200gL。 此外利用基因工程还可以将能进行生物转化的相关酶从微生物、植物甚至动物细胞

44、中克隆出来再导入一个微生物中进行表达，从而产生能对底物进行转化的一系列酶，将原来复杂的几种转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面的研究也是微生物转化的一个趋势，并且具有广阔前景。二、固定化细胞转化技术在微生物转化中的应用 固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以来已经广泛应用于工业、农业、医学、环境保护、能源开发以及理论研究等方面，并取得了丰硕成果。 利用固定化细胞转化技术，省去了破碎细胞提取胞内酶的过程，完整细胞得到固定后，酶活损失较少，活性回收率高，并且保持了细胞内原有的多酶体系，对于一些需要多步催化的反应过程，一步即可完成。 被固定的微生物细胞可以是处于生长状态或体眠状态的活细胞也可

45、以是死亡的细胞(但胞内酶的活力仍 存在) 在微生物转化过程研究最多的是固定化活细胞包埋技术。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PVA)等。 以海藻酸钙凝胶为例，其制备过程如下：在室温条件下，将一定浓度的海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀后，滴加到氧化钙溶液中，形成球珠。 Kaul等采用了海藻酸盐固定化生物催化剂(简单节杆菌)和底物(氧化可的松)进行碳一位和二位脱氢反应研究。 每个凝胶珠都可以看成是一个小的生物反应器，由于缩短了扩散距离，转化率明显提高，反应结束后细胞还可以回收并重复使用三、双水相转化技术在微生物转化中的

46、应用 双水相转化技术早期主要用于生物分子和细胞的分离与纯化。 这是由于生物产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需要经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固一液分离带来了困难，另外这些产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境特别敏感为了克服这些缺点出现了双水相技为了克服这些缺点出现了双水相技术。术。近年来，该技术开始应用于微生物转化过程为生物催化过程引入了一种全新的反应体系 双水相技术的核心是成相介质的选择以及双水相技术的核心是成相介质的选择以及介质浓度的控制介质浓度的控制，它直接影响到底物和产物在两相中的分配。 双水相体系基本上可以分为两大娄：高聚物-高聚物体系和高聚物-低分子物质

47、体系。 高聚物一高聚物体系是较常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，当它们浓度达到一定时溶液变浑浊，静止后形成两个液层，上层富集了PEG，下层则是葡聚糖。 Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35组成的双水相体系，利用分支杆菌(Mycobacterium sp.)进行胆固醇侧链降解制备雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上层聚乙二醇富集了菌体，使得菌体具有较高的转化活力，转化速率可达到1.0mg(gh)。四、超声波技术在微生物转化中的应用 超声波是指频率高于2104Hz的机械波。 与其他声波一样，超声波可以在弹性

48、介质中传播。因为超声波的波长很短，所以具有很强的定向传播能力。同时由于超声波在液体和固体中传播时吸收衰减很小，因此具有很强的穿透力。 根据超声波的使用范围，常可以将其分为两类：一类是高频超声，频率范围为I10MHz，这一类主要用于医学成像和化合物结构的分析；另一类是功率超声，频率范围为1560kHz，主要用于过程强化反应。 应用超声波技术，首先受到机械力的作用，而机械能又可以转化为热能。此外，当声强足够大时，又能产生空化效应。 超声波的机械效应机械效应包括振动效应和声流效应，指超声在媒介中传播时引起质点振动以及声流对质点的剪切力； 超声波的热效应热效应指超声波在媒介中传播的过程中被传播介质吸收

49、转变为热能； 超声波的空化效应空化效应指超声波激活气泡各种动力学的表现形式。 超声波技术应用于微生物转化过程，主要是涉及固液传质的生物体系。超声波可以产生上述的效应，较常规方法更有效地细化颗粒、增大传质表面。 这一过程主要发生于固液两相界面及细胞壁、细胞膜附近的区域。在超声场中，进行微生物转化的环境和菌体均处于不断的振动中。 对于环境而言，可加强分子的扩散效应，加速体系的混匀过程，减少各种代谢在液相中的梯度；对于菌体而言，可降低其细胞内胞液的黏度，提高膜的通透性。 阳葵等等报道了采用超声强度，超声方式和时间对绿僵菌(Metarhizium sp)氧化16,17-环氧黄体酮的影响，并对微生物转化

50、体系中的超声效应进行分析， 认为超声使得反应物颗粒细化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的传递；空化效应产生的冲击力对细胞膜通透性发生变化，促进胞内酶的释放及反应物向胞内的扩散。五、有机介质中的微生物转化 自从Buckland第一次利用有机溶剂四氯化碳(CCl4)为介质，采用诺卡菌(Nocardia sp.)将胆甾醇转化为胆甾烯酮以来，在有机介质中进行微生物转化成为了近几年在该领域的研究热点。 因为在有机体系中可以有效地将产物及时分离出来，底物相应得到补充，从而消除底物和产物的抑制作用，提高转化率。 此外，由于一些底物或前体在水相中的溶解度很小，通过用有机相作为介质可以大大提供其溶解度

51、，即增加了底物或前体的加入浓度，在一定程度上也提高了转化率。 一般来说，在有机介质中进行微生物转化的过程中，有机溶剂与水形成两相体系。包括有机介质(水不溶性)-发酵液和有机介质(水不溶性)-缓冲液两种类型。 Boren等在辛烷发酵液(1：1)组成的两相体系中，将醋酸雄烯通过脱氢黄杆菌(Flavobacterium dehydrogenans)转化为4-雄烯-3,17-二酮， 结果发现利用发酵液作为第二相有利于微生物转化进行，转化率可高达98，产物形成速率约是纯水介质的6倍这是因为在发酵液中辅酶容易再生。 孙小梅等应用聚山梨酯一80(吐温80)磷酸钾体系进行微生物转化，利用棒状杆菌将丙烯腈转化为

52、丙烯酰胺，也实现了较高的转化率。 但是由于有机介质自身的特点，对菌体和酶的活力影响很大，甚至对微生物转化过程有一定的毒害作用，其作用机理还有待进一步研究。因此，在选择有机介质参与微生物转化时，必须慎重考虑选择有机溶剂的种类和浓度 除此以外有机溶剂跟水混合在一起还可以形成一种特殊的体系微乳液。 微乳液是一种热力学比较稳定、光学透明、宏观均句但微观不均匀的混合液，它可以提供一些微生物转化过程所需要的大量的油水界面，同时也促进了水难溶性底物的溶解。 例：Smolders等利用简单节杆菌在磷脂、苯和少量水组成的微乳液中进行16-甲基-莱氏化合物S-21醋酸酯C1，2位脱氢研究，经过反应15h左右，转化

53、率可以达到98(图1 13)。六、生物反应器的应用 对于任何一十非常有应用前景，小试阶段取得成功的微生物转化反应来说，要实现其工业化规模生产进行其生物反应器研究是非常必要的。 例如丙烯腈通过棒状杆菌转化为丙烯酰胺的过程中，先后对搅拌式反应器、填充式反应器、密集多相流反应器以及膜反应器的应用进行研究。 发现，应用膜生物反应器进行 丙烯酰胺的微生物转化可以使得连续化生产成为可能，减少了杂质和丙烯酰胺的聚合体，提高了转化液的纯度，减轻了下游精制工序的压力，从而提高了产 品质量和转化率。 此外，随着两相生物转化技术的发展人们对两相生物反应器的开发也逐 步加强。 两相生物反应器对于一些水溶性较差或水不溶

54、性的底物的微生物转化，如酯的合成及水解、甾类化台物的微生物转化具有很大的吸引力。 因为大多两相反应器都结合了产物的萃取，有利于克服产物的抑制作用，提高转化率。另外，一些有机介质(如四氟化碳)可以作为氧的载体，因此对于那些需 氧较大的微生物转化反应来说，就可以满足对氧的需求。七、核磁共振、质谱技术在微生物转化中的应用 随着分析测试技术的迅速发展，核磁共振、质谱等在微生物转化过程中也得到了广泛的运用。自从20世纪70年代首次应用于生物催化过程，经过几十年的研究，核磁共振技术现已成为微生物转化反应中一个稳定的在线检测工具，尤其是尤其是1H-NMR检测可以给出较多的动力学数据和底物特检测可以给出较多的

55、动力学数据和底物特异性的信息异性的信息 Reisig等对质谱技术在微生物转化过程中的应用进行了系统的研究，认为质谱技术可用于下列几种情况质谱技术可用于下列几种情况：背景环境较为复杂的微生物转化；产物缺乏适当的发色团或助色团；可能出现几个异构体产物；产率较低；反应需定量等。 总之，微生物转化是微生物学、生物学、化学、遗传工程、过程工程科学等学科的交叉领域，交叉领域，其目标就是其目标就是通过采用微生物生产人类所需要的化学品、医药、能源等。因此任何在这些学科上的发展都会对微生物转化产生重大影响。 除了上述新技术的应用外，在增加底物溶解度、强化传质过程、提高过程转化率方面也取得了一定的效果，还有原生质

56、体转化技术、超临界流体原生质体转化技术、超临界流体技术、磁场效应等技术、磁场效应等也成功地用于微生物转化过程，并取得了很好的效果。相信随着各学科的迅速发展和研究的深入，可以为微生物转化提供更为广阔的发展空间。几种天然药物的微生物转化第六节一 雷公藤内酯 中药雷公藤来源于卫矛科植物雷公藤Triptelygium witfordii Hook,f.的根、叶及花。产于福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州等地，主要分布在长江中下游地区。 雷公藤是我国近年来开发的一种新的药物资源，临床上已被应用于治疗类风湿关节炎、肾小球肾炎，系统性红斑狼疮、麻风病、自身免疫性疾病和皮肤病。近年来研究还发现雷公藤有抗炎、免

57、疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌等活性。 至今，国内外学者已从雷公藤属植物中分离出几十种化学成分，主要为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、糖和木质素类。雷公藤中主要活性成分为生物碱类和二萜类化合物 雷公藤二萜属松香烷型二萜，多数具有,-不饱和内酯结构。雷公藤二萜具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗肿瘤等多种显著的生理活性，但由于肾毒性大，其临床应用一直受到限制。 宁黎丽等试图采用微生物转化技术对雷公藤的主要成分雷公藤甲素(又称雷公藤内酯或雷公藤内酯醇，triptolide,1-6)和雷公藤内酯酮(triptonide,1-7)进行结构修饰，以期得到高效低毒的衍生物。（一）雷公藤甲素的微生物转化 从31

58、株微生物中筛进出短刺小克银汉霉Cunninghamella blakesleana AS 3.90对雷公藤甲素(1-6)进行生物转化(图1 16)，得到7个产物，分别是5-羟基雷公藤甲素(1-8)、19-羟基雷公藤甲素(1-9)、19 -羟基雷公藤甲素(1-10)、雷公藤乙素(-羟基雷公藤甲素，1-11)、16-羟基雷公藤甲素(1-12)、和雷醇内酯(15-羟基雷公藤甲素，1-13) 等其中1-8、1-9、1-10为新化合物。（二）雷公藤内酯酮的生物转化 Ning等利用黑曲霉Aspergillus niger AS 3.739对雷公藤内酯酮(1-7)进行了转化研究，分离并鉴定了4个产物(图1-

59、17)，分别是17-羟基雷公藤内酯酮(1-15)、16-羟基雷公藤内酯酮(1-16)、5 -羟基雷公藤内酯酮(1-17)雷公藤甲素(1-6)；其中1-15、l-16和1-17为新化合物。 以上对两种雷公藤内酯的生物转化共得到1 7个产物，其中11个为新化合物。除19-位羟基化产物外，大多数转化产物表现出较强的体外细胞毒活性，对BGC823、Hela 、 HL- 60、KB等人癌细胞株的半数抑制率IC50为10-810-7molL，但比底物均有所下降。二 鬼臼毒素（一）概述 鬼臼毒素(podophyllotoxin)是从小檗科植物喜马拉雅鬼臼(Podophyllum emodi)和美洲鬼臼(Po

60、dophyllum peltatum)的根茎中分离得到的木脂素类化合物。 1946年King和Sullivan证实了鬼臼树脂和鬼臼毒素对动物实验癌细胞的破坏作用，引起了人们对此进行广泛的医学、生物学和化学的研究，后来发现鬼臼毒索副作用太大，影响了其临床应用. 从20世纪50年代开始，国外开始对鬼臼毒素进行了不少结构改造工作，从而在70年代出现了2个半合成抗肿瘤药物；依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷(teniposide，VM-26)，分别于1984和1 992年被FDA批准上市。目前全球包括NORVATIS等十多家公司在生产这两种药物，市场份额可达(40100)亿美金。 这两种抗癌