(2013-11-13)酶化学B 3

1、第10章 酶的作用机制和酶的调节一 酶的活性中心（一）、活性中心(active site)的概念 活性中心：活性中心：酶分子中直接与底物结合并催 化底物发生化学反应的部位。 活性中心分为结合部位和催化部位 结合部位：结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性（与km有关）。 催化部位：催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力效率（kcat)和催化性质。 结合部位和催化部位也可以合二为一，活性部位可以提供调节部位，也可以为活性部位提供物质基础 酶的活性中心（二）、活性中心的结构特点：1活性部位在酶分子中只占一小部分（12）2酶活性部位是一个三维的特定空间结构3酶的活性部位和底物有

2、时不互补-诱导契合4. 酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝 内往往是个疏水的微环境。5底物通过次级键结合到酶上， 形成ES复合物。6酶活性部位是柔性或可运动性， 即酶与底物结合 时构象发生一定的变化才互补。频率最高的活性中心的氨基酸残基： Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。-底物可以稳定酶！ 酶的活性中心（三）、 研究活性中心的方法 化学修饰法通常是比较在底物或竞争性抑制试剂是否存在的情况下的化学修饰1、酶的共价修饰（化学修饰）法酶的化学修饰法分类（1）、非特异性共价修饰非特异性共价修饰

3、某些酶活性中心含有的活性基团在活性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂进行修饰（2）、特异性共价修饰特异性共价修饰如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应。如，DFP与胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的丝氨酸残基的羟基结合）2. 亲和标记 亲和标记亲和标记（Affinity labeling）：也属于共价修饰，主要是利用酶与底物特异性结合的原理而发展起来的一种特异性化学修饰法, 是使用一个能与酶的活性中心特异结合的正常底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。（TPCK）修饰a胰凝乳蛋白酶His57 何谓亲和层析何谓亲和层析 ？研究活性中心的方法(续)4、动力学分析法 通过研

4、究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相 关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用5、定点诱变 通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。6、切除法3、X射线衍射分析法 通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X射线衍射分析。如溶菌酶和胰凝乳蛋白酶 pKa value* PH = 7 -COOH Asp 3.9; COO- Glu 4.1 COO- -NH3+ Lys 10.5; NH3+ Arg 12.5 NH3+ 组氨酸-6.0动力学参数分析法动力学参数分析法核糖核酸酶最适 PH = 7.8 参照最适PH值：谷氨酸、组氨酸或赖氨酸哪一个可能在活性中心 ？ 胃蛋白酶

5、的最适PH值为2，哪一类氨基酸可能在活性中心？定点诱变天冬酰胺后Kcat小了5000倍结论：？结论：？苯丙氨酸后 Kcat不变 Km提高了6倍 结论：？结论：？ 为验证羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，对其基因进行定点突变Tyr 248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据： A. Kcat 突变后降低 B. Km 变大 C. Kcat/Km 升高 D. Kcat 不变 E. Kcat/Km 降低上海交通大学2007生物化学 定点诱变突变为苯丙氨酸后突变为苯丙氨酸后：Kcat不变， Km提高了6倍

6、（2）如何确定某氨基酸残基为酶的活性所必须 华中科技大学华中科技大学2011年年如何确定活性部位？（习题）例：碘乙酸可使核糖核酸酶的侧链His119和His12烷基化而抑制酶活性。其中His119的修饰对酶影响最大, 但是研究中发现这两个His永远不能同时被碘乙酸修饰, 而且, 碘乙酸的类似物碘乙酰胺不能作为酶的修饰剂。此外在pH 5.5时碘乙酸一般不作用His, 但在核糖核酸酶中, pH =5.5时, 碘乙酸可作用His, 由上述现象可对核酸酶的活性部位得出什么结论? 分析分析：这是一个说明通过侧链修饰如何确定活性中心的例题。（1）His119和His12可能都处于活性部位，His119可能

7、性更大或者His119是催化过程中第一启动者，（2）His119和His12不在同一个环境（3）由于酶环境的影响，His以质子供体的形式存在。有可能在his119和His12之间形成质子供体与质子受体的关系（四）、酶的必需基团（自学） 必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。 （1）、活性中心内的必需基团： 结合基团：与底物结合，形成酶底物复合物的部位； 催化基团：影响底物中化学键的稳定性，与底物发生 化学反应，将底物变成产物。 （2）、活性中心外的必需基团（调控基团或维持酶活性） 构成酶活性中心的基团：His的咪唑基、 Ser的-OH、Cys的-SH、Glu的-羧基1. 酶

8、的必需基团是（ ） （1）必需基团构成具有一定空间结构的构象（2）和底物结合幷将之转化成产物的部位（3）抑制剂都作用于酶的活性中心（4）所有酶的活性中心都有金属离子2.酶的活性中心是（）（1）所有的酶都有活性中心（2）所有活性中心都有辅基（3）酶的必需基团都位于活性中心（4）变构抑制剂直接结合的部位（5）重金属沉淀酶的结合区域 思考题 思考题3. 用定位点突变方法得到缺失某一个氨基酸残基突变体， 这个突变的酶蛋白不再具有催化活性，因此可以认为该缺失残基一定是酶结合底物的必需基团。（ 判断 ） 华南理工大学20094. 某同源蛋白中的Ala残基被替换为Val，此类替换属 于 保守性替换 。中山大

9、学20095在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物相互作用，它是( )a. 谷氨酸 b. 胱氨酸 c. 组氨酸 d. 酪氨酸 e. 丝氨酸江南大学2007 思考题6. 什么是酶活性中心？有一种酶，含一个半胱氨酸残基，设计一个技术线路，验证该Aa是否参与酶的催化作用或专一性。 中国农业大学2010生物化学碘乙酸（碘乙酰胺）7. 讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中心 的方法(8分)（大连理工大学、中国农业大学2011生物化学）酶高效性的机理1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合3、酸碱催化4、共价催化5、活性中心金属离子6、活性部位微环境的影响二、影响酶

10、催化效率的有关因素（二）、 酶具有高催化能力的原因1. 邻近效应与定向效应Proximity/Orientation变分子间反应为变分子间反应为分子内反应分子内反应底物与酶的邻近效应与定向效应邻近效应与定向效应变分子间反应为邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应分子内反应。邻近效应邻近效应：酶与底物形成中间复合物中间复合物后，变分子间反应变分子间反应为为分子内反应，分子内反应，使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应。酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附

11、近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。邻近与定向（轨道定向）效应A. 反应物的反应基团和催化基团既不靠近，也不彼此定向B. 两个基团靠近，但不定向，也不利于反应C. 两个基团既靠近，又定向，大大有利于底物形成过渡态，加速反应邻近与定向（轨道定向）效应酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生密度变化，产生电子张力电子张力，降低了底物的活化能，降低了底物的活化能 、酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。 、底物形变，利于形成ES复合物。 、底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能

12、 （二）、底物形变和诱导契合的催化效应溶菌酶 底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象椅式构象变为能量较高的半椅式构象半椅式构象。1、定义：酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用，以稳定过渡态，降低了活化能加速了反应，这种机制称为.。 Specific acid-base catalysis （H+ 或OH-) General acid-base catalysis 2、分类（三）、酸碱催化酶酶酶酶 Many protein enzymes use general acid-base catalysis as a way to increase r

13、eaction rates（催化有机反应的最普催化有机反应的最普遍有效的催化剂遍有效的催化剂） Acid-Base CatalysisSpecific acidbase catalysisGeneral acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid functional group, such as those shown here, can participate in acid-base catalysis pKa value* PH = 7 -COOH Asp 3.9; Glu 4.1 COO

14、- -NH3+ Lys 10.5; Arg 12.5 NH3+ 组氨酸-6.0Side chains used in general acid-base catalysis 3、影响酸碱催化反应速度的两个因素 酸碱强度酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6， 在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼 的催化基团。 给出质子或结合质子的速度给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期 小于10-10 秒 酸碱催化所以，所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。思考题 1. 在酶的广义酸碱催化机制中，特别重要的一个氨基酸残基是_，其侧链

15、pK 值接近生物体的pH 值。 中山大学中山大学2007年年2. 蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。（是非题） 中山大学中山大学2009年年3. 名词解释：酸碱催化 2007 年中国海洋大学生物化学、华东师范大学华东师范大学2003年年NucleotidesH2O2或3-核苷酸核苷核苷2,3环磷酸酯环磷酸酯 Basic hydrolysis of RNA Due to the 2-hydroxyl思考题 例如：某酶的化学修饰实验表明，Glu和Lys残基是这个酶活性所必需的两个残基。根据pH对酶活性影响研究揭示，该酶的最大催化活性的pH近中性。请你说明这个酶的活性

16、部位的Glu和Lys残基在酶促反应中的作用，并予以解释 答 谷氨酸的-羧基的pKa值约为4.0，在近中性条件下，该基团去质子化，在酶促反应中起着碱催化剂的作用。赖氨酸的?-氨基的pKa值约为10.0，在近中性条件下，它被质子化，在酶促反应中起着酸催化剂的作用。 (1). 共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。（四） 共价催化Covalent catalysis酶酶底物底物共价键共价键（2）.共价催化分类 亲核基团：（亲核催化）亲核基团：（亲核催化） Ser 的羟基，His 的咪唑基，Cys 的硫基，A

17、sp 的羧基等；这些富含电子的基团(有孤对电子)，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。 亲电子基团：（亲电催化）亲电子基团：（亲电催化） H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。 共价催化往往是亲核攻击的结果共价催化往往是亲核攻击的结果nucleophilic catalysis （亲核催化） Examples of covalent bond formation between enzyme and substrate. In each case,

18、 a nucleophilic center (X:) on an enzyme attacks an electrophilic center on a substrate. 共价催化举例-胰凝乳蛋白酶1. 亲核催化中酶蛋白上最常见的提供亲核基团的残基是（ ）A，His，Ser，Cys； B，His，Lys，Arg； C，Asp，Glu，Phe D，Asn，Gln，Trp 中国科学院中国科学院2005年年（五）、活性中心金属离子的催化作用金属酶和金属-激活酶（1）通过结合底物位反应定向；（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。 金属离子的催化往往和

19、酸的催化相似，作用比质子强，不少金属离子有络合作用，并且在中性 pH 溶液中，H+ 浓度很低，但金属离子却容易维持一定浓度。 金属离子通过电荷的屏蔽促进反应。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。Hexokinase激酶真正的底物是 Mg2+ - ATP Carbonic Anhydrase: Zinc Activation of Water, The activated water (hydroxide ion) acts as a nucleophile亲和基团 , attacking the carbon dioxide, forming bicarbonateCarbonic Anhyd

20、rase The bound zinc activates its water ligand - makes it more reactive 基元催化基元催化：由某些集团或小分子催化的反应，如 1、酸碱催化 2、共价催化；3、活性中心金属离子 基元催化的分子机制基元催化的分子机制 思考题：思考题： 1. 酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和（ ）中山大学中山大学2010年年2. 下列哪一项不是酶具有高催化效率的因素？ （ ） A、加热 B、酸碱催化 C、“张力”和“形变” D、共价催化 E、邻近定位效应南京林业大学南京林业大学2003年年 多元催化和协同催化：多元催化多元催化和协同

21、催化：多元催化常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网电荷中继网”，催化肽键水解。电荷极化电荷极化为基元催化提供了催化基团，如广义的酸碱、亲核基团和亲电基团及金属离子。（六）、多元催化与协同效应电荷极化和多元催化(新版生化）Ser195、His57、Asp102 疏水环境疏水环境：酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应。如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，削弱带电离子之

22、间的静电作用，不利于酶促反应的进行。 在酶活性中心附近,往往有一电荷离子,可稳定过渡态的离子,增加酶促反应速度。 （七）活性中心的微环境三、 酶催化作用的实例（一）、溶菌酶（一）、溶菌酶（lysozyme) 溶菌酶存在于鸡蛋清鸡蛋清和动物的眼泪动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁。溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶。是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的。为什么眼睛和口腔不易被细菌感染？为什么眼睛和口腔不易被细菌感染？2011年四川大学生物化学年四川大学生物化学 溶菌酶的底物溶菌酶的底物肽聚糖Lysozyme1. 底

23、物：底物：细菌细胞壁的肽聚糖， NAG和NAM交替排列形成多聚物，它们之间通过-1,4糖苷键相连。Penicillin2、溶菌酶结构 溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键。活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52 。从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部。整个酶分子中有一狭长的裂缝一狭长的裂缝。最适底物正好与酶分子的凹穴相结合.溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键糖苷键。溶菌酶的最适小分子底物 酶的活性部位有一条沟，正好能容纳6个多糖残基形成的链。当用含不同残基数的寡聚NAG作实验，发现当残基数

24、达到6个时就可以作为有效的底物。 溶菌酶的最适小分子底物 O18水证明溶菌酶催化底物C1-O键裂解3. 溶菌酶催化特点小结（1）靠近与定向靠近与定向（2）底物形变底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。（3）广义的酸碱催化广义的酸碱催化（4）共价催化共价催化 ? 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。该酶最适pH（pH5.2），1. 这两个残基分别呈现什么样的解离状态（质子化或否）？2. 这样的解离状态将使它们分别发挥什么样的作用？（谁起酸催化作用？谁起稳定正电荷作用？），

25、3. 根据该酶的pH-活性峰，请对这两个残基的解离与该酶的活性之间的关系给出恰当的解释。 武汉大学生命科学学院2007-2008年度第1学期期末考试武汉大学生命科学学院2007-2008年度第一学期期末考试 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。该酶最适pH（pH5.2），溶菌酶两种催化机理假说广广义义的的酸酸碱碱催催化化广广义义的的酸酸碱碱催催化化正正碳碳离离子子共共价价催催化化?D糖溶菌酶两种催化机理假说(续)广义的酸碱催化广广义义的的酸酸碱碱催催化化溶菌酶催化机理假说(旧) Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环

26、之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1 带上正电荷成为正碳离子。Asp52上的-COO-起协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用。 如溶菌酶主要活性基团是Clu35的COOH和Asp62的COOH，在游离状态下，Glu和Asp这两个羧基的解离常数差异不显著，但在酶分子内， Clu35残基处在非极性环境中，因此其-羧基不解离，为COOH形式，而Asp52残基则处于极性微环境中，其COOH可解离，为COO-。由于微环境差异导致羧基解离状态不同，从而使此酸可以利用相应基团进行酸碱催化反应。牛胰核糖核酸酶A酶的活性中心：His12 His119 Lys41 Gen

27、eral BaseAGeneral Base General Acid2, 3-环磷酸酯中间产物（二）（二）、核糖核酸酶、核糖核酸酶AGeneral Acid General Base 核糖核酸酶核糖核酸酶A 核糖核酸酶是由核糖核酸酶是由124个氨基酸组成的一条多个氨基酸组成的一条多 肽链，肽链，含有四对二硫键，空间构象为球状分子。含有四对二硫键，空间构象为球状分子。 核糖核酸酶核糖核酸酶A 羧肽酶A（carboxypeptidaseA）是一个具有307氨基酸的单链蛋白质，其中紧密地结合着一个锌离子锌离子，它对酶活性很重要。羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基。（羧肽酶B：仅Arg

28、、Lys，如果C-末端第二个残基是Pro,则酶A和酶B都不起作用.羧肽酶C能水解C-末端的Pro.）锌离子在羧肽酶A的活性部位上与两个组氨酸侧链和一个谷氨酸侧链和一个水分子相配位（三）、羧肽酶A（carboxypeptidaseA）催化中心催化中心结合中心结合中心羧肽酶羧肽酶A催化机理催化机理带负电荷四面体带负电荷四面体过渡态中间物过渡态中间物羧肽酶羧肽酶A催化机理催化机理(四）、丝氨酸蛋白酶 一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，可把它们归为一族。蛋白水解酶：蛋白水解酶：（1）丝氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）（2）锌蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）

29、巯基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等）（4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）没有底物时没有底物时结合底物时结合底物时电荷中继网胰凝乳蛋白酶的催化三联体 活性中心由Ser195、His57、Asp102 组成； 胰凝乳蛋白酶的催化三联体 丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化三联体 电荷中继网： 通过电荷中继网进行 没有底物时： Ser195His57Asp102形成一个氢键体系， His57是去质子化状态， Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。 结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性， Asp102的COO-稳定过

30、度态中His57的正电荷形式。胰凝乳蛋白酶的活性中心结合部位结合部位：决定专一性催化部位丝氨酸蛋白酶的专一性 丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性趋异进化 丝氨酸蛋白酶的趋异进化P409P408丝氨酸蛋白酶的专一性 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 ：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 胰蛋白酶：胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸

31、残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键结合结合中心中心 4. 胰凝乳蛋白酶的催化机制P409 胰凝乳蛋白酶的催化机制P4092. 蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。（是非题） 中山大学中山大学2009年年 胰凝乳蛋白酶的催化机制 胰凝乳蛋白酶的催化机制Activation Of Ser residuecovalent linkage with carbonyl group of polypeptide chain andFormation of tetrahe

32、dral inter-mediate transition state Cleavage of peptide bond,释放C端肽链第第1次四面体过渡态中间物次四面体过渡态中间物第1阶段：酰化 胰凝乳蛋白酶的催化机制Activation of water molecule by pairing with its hydrogen atom (through a basic residue)Formation of second tetrahedral intermediate transition stateRegeneration of Ser residue by a protonate

33、d basic residue第2次四面体过渡态中间物第2 阶段：脱酰胰凝乳蛋白酶反应的详细机制第1阶段： 酰化 Ser195-OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+ ），肽键断裂氨基产物释放，底物的羧基部分共价酯化到Ser195的羟基上。第2阶段： 脱酰 电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。枯草杆

34、菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 趋同进化趋同进化The overall folds of two members of different superfamilies of serine protease. The enzymes are chymotrypsin (top) and subtilisin (bottom). The residues in the catalytic triad are indicated for each)来源不同，功能特征相同，称异源的趋同进化。 胰凝乳蛋白酶中是：胰凝乳蛋白酶中是： Asp102-His57-Ser195 枯草杆菌蛋白酶是：枯草杆菌蛋白酶是： A

35、sp32-His64-Ser221Chymotrypsin 丝氨酸蛋白酶的趋同进化 In summary of Serine Proteases胰凝乳蛋白酶典型的催化机制： 广义酸碱催化 共价催化。活性中心由Ser195-His57-Asp102组成；1. Asp102的确定:identified by X-ray crystallography2. Ser195的确定:用DIFP（二异丙基氟磷酸）-化学修饰。3. His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK-亲核标记。水解过程分酰化（Acylation）和脱酰（Deacylation）两个阶段。课后题课后题 9. 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶

36、和弹性蛋白酶作为催化剂有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？素引起这些差异？ 答：相似之处：执行相同的反应裂解肽键；其结构和作用机制很相似；相对分子质量范围在 2.5103 ， 并且具有相似的顺序和三级结构； 3 个极性残基His57、Asp102 和 Ser195 在活性部位形成催化三联体。 不同之处：专一性不同 它们的活性中心是由两个天冬氨酸残基所组成，如由胃膜分泌的胃蛋白酶、肾脏中的血管紧张素释放酶及细胞溶酶体中的某些组织蛋白酶等。 胃蛋白酶是典型的天门冬

37、氨酰蛋白酶。一条肽链，相对分子质量为35103；胃蛋白酶的活性中心含有一水分子，水分子的两翼是Asp 215和Asp32（当一个天冬氨酸为离子化形式，另一个为非离子化形式时酶才表 现其活性；天冬氨酸在酶的催化过程中起两个作用：激活它们之间的水分子，充当质子 的受体和质子的供体，形成催化二联体催化二联体，进行广义的酸碱催化）。 （五）、天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸天冬氨酸-活化水活化水思考题1. 胃蛋白酶偏酸性，这说明其有哪些官能团？有哪些氨基酸提供这些官能团？ 大连理工大学2012年 2. 苏州大学2004 年生物化学考研试题 1) 举例说明竞争性抑制原理及应用 2) 以溶菌酶或糜蛋白酶为例说明酶作

38、用机理 思考题3. 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的三维结构相似，活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列也完全相同， 但作用的底物各不相同。 试根据底物的结构特点推测三种酶作用部位的结构特点。 厦门大学2004年4. 胰凝乳蛋白酶的活性中心中构成一个电荷中继网的三个氨基酸残基是: ( ) A, HIS,Arg,Glu B ,Ser,Lys,Asp C, Ser,His,Asp D, Ser,Arg,Glu江苏大学2005年思考题5. 利用DIFP对胰凝乳蛋白酶进行化学修饰,DIFP在温和条件下只与酶上的一个Serl95结合,化学修饰后,酶失去活性,且此酶也不能再与最适底物类似物TPCK结合,说明

39、Serl95是（）: A. 别构部位 B. 催化部位C. 底物结合部位 D. 与酶的催化活性无关。 天津工业大学2007年四 、 酶活性的调节控制调节酶：活性可被调节的酶，主要是2. 酶在生物体内的调节主要有别构调节和（ ）? 中山大学2009生物化学别构酶别构酶共价修饰酶共价修饰酶（1）别构效应别构效应（又称为变构效应）：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价键结合，导致酶的构象变化和活性改变。（某些物质能以非共价键形式与酶活性中心以外特定部位结合,使酶蛋白分子构象发生改变,从而改变酶的活性.）（2）别构酶别构酶：各种配体与酶的结合后，发生的构象变化，导致后继配体的亲和力改变的酶,结构上

40、已知的别构酶都是寡聚酶，功能上别构酶多是代谢调节的关键酶关键酶 别构调节不引起酶的构型变化，不涉及共价键变化。P413 （一）别构调节（3）. 别构效应物别构调节物别构调节物（别构效应物：Allosteric effectors）：与别构酶分子中的别构中心（调节中心）非共价结合后，诱导生或稳定了酶分子的某种构象，从而调节酶活性中心对底物的结合。 A positive effector activates the enzyme (an activator). A negative effector inhibits the enzyme (an inhibitor). (1) 根据配体性质分：

41、同促效应同促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一相同的效应物与酶的结合。 异促效应异促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一不同效应物与酶另一部分结合。(2) 协同效应：一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，为协同效应 正协同效应正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，有利于后续底物分子或调节物分子的结合 负协同效应协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，不利于后续底物分子或调节物分子的结合2、别构效应的种类：P248别构效应的种类别构效应的种类3. 别构酶的性质(1) 已知的别构酶一般都是寡聚酶，通过次级键结合。(2) 具有活

42、性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别 构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。(3) 多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应， 底物就是调节物：有的别构酶 不止一个别构中心，可以接受不 同的代谢物（非底物）的调节。P418判断：别构酶都是寡聚酶南开大学南开大学2006年年 不遵循米式方程，动力学曲线是S型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）VS的动力学曲线米氏酶：rectangular hyperbolic curve(直角的双曲线直角的双曲线) 别构酶同促效应的： 同促同促正正协同效应协同效应:-S-形曲线 同促同促负负协同效应协同效应：表观双曲线 不加激活剂或抑制

43、剂不加激活剂或抑制剂P418 4. 别构酶的VS的动力学曲线 别构酶同促效应的动力学 试用动力学曲线图区分非调节酶,正协同效应别构酶和负协同效应别构酶并加以解释(15分).S-形曲线直角的双曲线表观双曲线杭州师范大学2008 年 同促正协同效应的别构酶是同促正协同效应的别构酶是S型曲线型曲线当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。米氏酶： S0.9/S0.1=81别构酶（n=4）：S0.9/S0.1=3表明表明反应速度对底物浓度的变化敏感，当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。 同促负协同效应的别构酶是同促负协同

44、效应的别构酶是表观双曲线表观双曲线表明反应速度对底物浓度的变化不敏感同促效应加激活剂加激活剂加抑制剂加抑制剂 别构酶同促效应加调节物的动力学异促效应异促效应调节物的别构效应(异促效应）异促效应）当增加正调节物正调节物浓度时，Km减小，亲和力增大，协同性减小（对底物浓度的反应灵敏度降低）。当增加负调节物负调节物的浓度时，Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加异促效应异促效应Hill系数法 米氏酶：n = 1 别构酶-正协同： n1 ，越大，正协同性越大 别构酶-负协同： n1 ，越小，负协同性越大协同指数（CI），又称为饱和比值（Rs) 双倒数作图不是直线 脱敏作用（P41

45、9)： 理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。脱敏后的别构酶表现为米式酶的动力学曲线P4195、别构酶的区分Rs = 酶与底物结合达到90%饱和度时的底物浓度 酶与底物结合达到10%饱和度时的底物浓度 米氏酶：当反应速率为0.9Vmax时，S=9Km当反应速率为0.1Vmax时，S=1/9Km Rs=81正协同：Rs81，越小，正协同性越大负协同：Rs81，越大，负协同性越大 饱和比值（saturation ratio, Rs)nnmnmsKKYYR11181)9 . 01 . 0()1 . 09 . 0(1 . 09 . 0米氏酶：Rs = 81正协同：Rs 81负协同：Rs 81 Hil

46、l系数法 米氏酶：n=1 正协同： n1 ，越大，正协同性越大 负协同： n1 ，越小，负协同性越大Hill系数法6、别构酶调节活性的机理-别构模型别构模型(1)、齐变模型齐变模型 （WMC模型）模型）（协同模型）（协同模型）（对称模型）（对称模型） (2)、序变模型序变模型（KNF模型模型）不能解释负协同P419别构酶调节活性的机理齐变模型（WMC模型）亚基以对称方式排列，整个酶分子以两种构象存在，松弛型（R）和紧张型（T）。R型有利于与底物结合，T型不利于与底物结合。同一酶分子中不存在构象杂合体（RT态），它的亚基要么是R型，要么是T型。两种构象状态间的转变，对每个亚基来说都是同时的，齐步

47、发生的。 当底物不存在时，绝大多数酶分子均为T型，加入底物后，T型各亚基齐步向R型转变。不能解释负协同 (2)、序变模型Sequential Theory (ligand-induced theory)序变模型是近年来更为普遍运用的模型。其主要是依据这样一种设想，即一个配体可以诱导它要结合的亚基的三级结构的变化。这个亚基-配体复合体又能够改变相邻亚基的构象。这一模型特别强调对于配体只有一种形状是亲和力最高的，但与齐变模型不同的是在具有部分饱和的一个寡聚分子中允许存在着高亲和力和低亲和力的亚基（右图b）。 Mixture of T subunits and R subunits is possi

48、ble. Binding of S converts only that subunit from T to R 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）：是了解最清楚的一个别构酶。它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物N 氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代谢途径的终产物CTP 的别构抑制。 9、别构酶举例P413天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）（1）、结构： ATCase 由两个三聚体构成的催化亚基（C3）和三个二聚体构成的调节亚基（r2）组成。当催化亚基和调节亚基混合时能迅速结合。（2）、特点：同促效应：异促效应正协同：天冬氨酸抑制剂 CTP激活剂 ATP表现出齐变模型特征 ATCas

49、e reaction and its kineticsAllosteric effects in ATCase CTP is an inhibitor ATP is an activator Sigmoidal kinetics天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase） 天冬氨酸的结合具有正协同的效应（所以反应速度对天冬氨酸浓度作图得到的是S形曲线） CTP终产物反馈抑制：降低酶与底物的亲和力，不改变Vmax CTP使得原来的S曲线更为明显，表明天冬氨酸结合ATCase的过程中具有更大的协同性。 ATP激活：增加酶与底物的亲和力，不改变Vmax，别构激活剂ATP的存在使得S型曲线向双曲线漂移，降低了底

50、物对酶结合的协同性课后题课后题-11 对于 ATCase 来说，琥珀酸起着 Asp（两个底物中的一个）的竞争抑制作用。 对Asp的依赖关系见图A（假设这些实验中第二种底物是过量的并可忽略）。在图B种Asp维持在低水平（图A种箭头所指处）不变，并加入一系列含量递增的琥珀酸。琥珀酸不能作为底物参与反应。请解释这些结果。思考题思考题1、 有时别构酶的活性可以被低浓度的竞争性抑制剂激活， 请解释 江南大学2008年天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）（4）、N一磷乙酰基L一天门冬氨酸（PALA）是研究天门冬氨酸转氨甲酸酶（ATCase）性质的特异性试剂？（为ATCase强的抑制剂），P

51、ALA的结构与ATCase两个底物复合物的结构类似，即与氨甲酸一天门冬氨酸复合物的结构类似。PALA是结合在ATCase的活性部位。比较ATCase和ATCasePALA复合物的X一射线衍射分析结果发现，随着PALA的结合伴随着ATCase四级结构的重大变化。 为什么说PALA是研究ATCase性质的特异性试剂？ 南开大学生物化学精品课程南开大学生物化学精品课程思考题1、下列关于酶的别构调节，错误的是 A受别构调节的酶称为别构酶 B别构酶多是关键酶（如限速酶），催化的反应常是不可逆反应 C别构酶催化的反应，其反应动力学是符合米-曼氏方程的 D别构调节是快速调节 E别构调节不引起酶的构型变化2、

52、别构调节的特点是（ABCDE ）A.别构剂与酶分子的非催化部位结合B.使酶蛋白构象发生改变,从而改变酶的活性C. 酶分子多有调节亚基和催化亚基D. 是一种快速调节 E.别构酶常常是代谢途径的限速酶思考题思考题3、变构调节的特点是：（ ） A、变构剂与酶分子上的非催化部位结合。 B、使酶蛋白构象发生改变，从而改变酶活性。 C、酶分子多有调节亚基和催化亚基。 D、变构调节都产生正效应，即加快反应速度。 苏州大学2008生物化学思考题思考题4. 别构酶总是寡聚酶（判断）5抗体酶是水解抗体的酶的总称。（判断）江南大学2010年生物化学 6. 试从生物学进化的角度解释为什么生命体中存在大量的别构酶。（6

53、分） 复旦大学2007年生物化学7，对于一个正协同效应别构酶当有激活剂（正调节物）存在下，其协同性（ ）A，减小；B，增加；C，不变 中国科学院中国科学院20200505年年思考题思考题8. 华南理工大学2006年 1) 下列关于别构酶的叙述，哪一项时错误的？下列关于别构酶的叙述，哪一项时错误的？( (单选单选) ) A. 所有别构酶都是多聚体，而且亚基数目往往是偶数 B. 别构酶除了活性部位外，还含有调节部位 C. 亚基与底物结合的亲和力因亚基构象不同而变化 D. 亚基构象改变时，要发生肽键断裂的反应 E. 酶构象改变后，酶活力可以升高也可以降低 2) 根据调节物分子不同，别构效应分别为_和

54、_。根据调节物使别构酶反应速度对S敏感性不同分为_和_。（二） 可逆的共价修饰的调控P424 1、定义 （1）共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而导致酶活性的改变,称为共价修饰. （2）共价调节酶（covalent regulatory enzyme） 是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性。区分：共价催化Covalent catalysis 共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。2、可逆共价修饰的类型l（1）

55、磷酸化与脱磷酸化（最常见） 、Tyr、Ser、Thr、His；l（2）腺苷酰化和脱腺苷化接受修饰的氨基酸残基：Tyr；l（3）尿苷酰化和脱尿苷酰化 Tyr；l（4）ADP-核糖基化 Arg.Gln.Cys；l（5）甲基化和脱甲基化 Glul（6）乙酰化和脱乙酰化、例如例如（1）大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化与脱腺苷 酰化发生在Tyr而失活 （2）糖原磷酸化酶磷酸化（丝氨酸）有活性共价修饰调节糖原磷酸化酶的调节别构调节肌肉中caffeine 咖啡因（肝脏或肌肉中）级联放大效应糖原分解少少3、化学修饰与别构调节的异同点比较别构调节和化学修饰调节的异同及各自在代谢中的作用？2010年中科院生化与分

56、子真题年中科院生化与分子真题（三）、酶原及酶原的激活1、定义 （1）酶原（zymogen）：有些酶在细胞内合成或初分泌时， 无活性前体形式，叫做酶原。（2）酶原的激活 ：从无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。（3）酶原激活的本质：酶原的激活实质上是酶活性 部位形成 或暴露的过程2、酶原激活特点：常伴有一级结构（构型）的改变具有不可逆性。P4213、酶原与酶原激活的生理意义：酶原及酶原的激活 （1）、保护组织器官本身免受酶的水解破坏； （2）、保证酶在特定时空发挥催化作用； （3）、酶原可视作酶的储存形式。4、举例：消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 胃蛋白酶），血液凝固系统中的酶。（复习

57、一下蛋白 酶的专一性）急性胰腺炎自激活由胰蛋白酶激活课后课后12.试解释为什么胰凝乳蛋白不能像胰蛋白酶那样自我激活？胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）酶原及酶原的激活酶原及酶原的激活- -胰蛋白酶为什么可以自激活？自激活？自激活？举例胰蛋白酶原的激活4. 胃蛋白酶的激活过程胃蛋白酶的激活过程某些酶原的激活过程某些酶原的激活过程思考题思考题1. 南开大学南开大学2001生物化学 1） 在胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的催化过程中，活性中心Ser羟基的( ) 和His咪唑基的（ ） 作用起着重要作用。 2）酶的活性中心是酶分子中由（ ） 形成的功能区域，它的二个功能单位为（ ） 和（

58、 ）。2. 南开大学南开大学2002生物化学 欲较彻底的水解丝心蛋白，选用（ ）为宜。 A.弹性蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.胰凝乳蛋白酶 D.嗜热菌蛋白酶3. 华东师范大学华东师范大学2005生物化学 胰凝乳蛋白酶专一水解多肽链中 （A）碱性氨基酸残基N端 （B）酸性氨基酸残基N瑞 （C） 碱性氨基酸残基C端 （D）酸性氨基酸残基C端 （E）芳香族氨基酸残基C端4. 复旦大学复旦大学2004生物化学 胰凝乳蛋白酶能在、和的端切断肽键。思考题思考题5. 2003年中国科学院生物化学与分子生物学试题 下列哪种酶的巯基参与催化肽键断裂反应 A. 羧肽酶A B.胃蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.胰凝乳蛋白酶

59、6. 酶原激活的实质是 A. 激活剂与酶结合使酶激活 B. 酶蛋白的变构效应 C. 酶原分子一级结构发生改变从而形成或暴露出酶的活性中心 D. 酶原分子的空间构象发生了变化而一级结构不变 E. 以上都不对 华南理工大学华南理工大学2006年年7. 酶刚合成时都以酶原形式存在。（判断） 华东师范大学华东师范大学2006 六、同工酶 Isoenzyme or isozyme1、定义：能催化相同的化学反应，但存在多种四级缔合形式，并因而在物理、化学和免疫学方面都有差异的一组酶。存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中，同工酶一般为寡聚酶，有两种或两种以上的亚基组成。乳酸脱

60、氢酶乳酸脱氢酶（LDH）是1959年发现的第一个同工酶。 （1）结构：由4个亚基组成的寡聚酶，亚基分为M型和H型。因此可以装配成五五种四聚体：即LDH1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用电泳方法将其分离。脊椎动物心脏中主要是 LDH1，而骨骼肌的则是LDH5乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:2、同工酶物理性质：（1）Aa组成和顺序不同（2）催化特性不同，对同一底物的Km值不 同，但活性部位相似（3）电泳行为不同