(完整版)流动相的调节

1、流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手，问题就容易解决。液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也

2、就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐。以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好。现在分析生物碱是比较难做的。如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH值，酸性物质将pH值调低，碱性物质将pH值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）一 反相HPLC中的溶剂优化：1首先应调整k'值：强溶剂一20%递减一选择合适的溶液强度，使得k'在120（tR：335min）。一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k'。当所有谱峰符合1

3、Vk'<20的范围时,从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。（观察待分离组分的分离度）。（反相色谱一一溶剂极性弱洗脱能力强，组分k'减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k'值符合1<k'<20范围的大概溶剂成分。2改变选择性（d）：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。二 离子对HPLC中的溶剂优化:离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互

4、作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+,B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相（即有机相）提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可

5、离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。反相离子对色谱中流动相的影响小结：改变选择性:a.改变溶剂种类：改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH:组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐（高氯酸盐或烷基磺酸盐）和强碱盐（季铵盐

6、）才满足此要求。c.系统选择:使用一种有机溶剂（甲醇）；流动相的其它三种成分为pH=2.5,pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度（例如：200mM）的离子对试剂的缓冲液（D）。以组合不一的缓冲液（BD）进行七次实验，并变化甲醇（A）量以保持每次实验的k'值范围大致恒定。三 正相HPLC中的溶剂优化溶剂非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷）极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位按正相HPLC中谱峰间距效应分类的溶剂取代和定位是正相HPLC流动相选择性的主要来源 溶剂强度调节 选择性影响四、梯度洗脱梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使

7、，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC中的甲醇)的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作B。梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k'范围宽，不能用等度方法简单地处置。1. 梯度洗脱期间的平均k'值tR=tm(1+k')VR=Vm(1+k'

8、)=Vm+kVs针对做生物碱的朋友：1. 用常规的ODS柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重原因：ODS柱有很多未键合的硅羟基，与N缔合造成。解决方案：使用BDS柱，它是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！2. 用常规的SCX离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH值大小，Rt变化大！原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！解决方案：流动相用Buffer缓冲液!实际上用冰醋酸、三氟乙酸、柠檬酸的也不少酸的作用就是根据pKa调节pH值，一定程度上抑制样品组分的解离反相色谱法分离弱酸（3WpKaW7）或弱碱（

9、7WpKaW8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用磷酸（或乙酸、三氯乙酸、1%的甲酸、硫酸、50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液）作用可以抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和或30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作

10、用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。3建立方法时，应考虑下列事项：流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为78；如为酸性药物，流动相的pH值应为34。你是可以通过多种办法测定流动相和样品溶液的pH值。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.575（28），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.51

11、0范围操作。分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照下图：高的缓冲盐浓度有较高的缓冲容量，但是在有机相多的情况下容易析出，高溶解度的钾盐要比钠盐有优势。一般的钾盐溶解度要比钠盐大的，但是钾盐要贵一点。磷酸二氢铵嘛就是2个缓冲盐放一起了。缓冲能力、范围更好了，不过铵不稳定。这种体系的流动相不易长时间放置。最好一天一换。加缓冲盐的目的究竟是什么，在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在27之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在27之

12、外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在111之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要。PH值一般在2-7的范围，还是要固定的调到某个值？PH值是一个固定值！1、变化PH值可以影响出峰保留时间2、影响方法的重现性3、在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰.因此最好是固定PH值新买的柱子要老化一下才能用的色谱柱老化：在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。A. 在反相条件下老化要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗。如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用