遗传学实验：小鼠骨髓染色体制备与观察

1、实验目的v 掌握动物骨髓细胞染色体制备技术v 观察小鼠染色体的形态特征和染色体数目 前中期 晚中期实验材料及流程v 小鼠 2n=40v 每四人一只小鼠v 秋水仙素处理-处死-解剖-收集骨髓细胞-低渗处理-固定-重悬-滴片-染色-水洗-镜检秋水仙素处理（已完成）v 目的：抑制纺锤丝形成，提高有丝分裂指数，增加细胞中期分裂相的比例v 方法：腹腔注射0.01%秋水仙素溶液 0.5ml 等待2-4h处死v 每四人领取一只小鼠 (手套)v抓住小鼠尾巴将其转移到实验台上v颈椎脱臼法：一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾靠近根部用力向后拉。将脊髓与脑髓拉断。v 注意小鼠咬手，力道解剖 v 剪去腿部附近皮毛，取出股骨

2、胫骨，剃净肉。腓骨不用收集骨髓细胞v 剪去骨两端，注射器吸生理盐水（0.85% NaCl溶液） ，针头插入骨腔反复冲洗几次，用1.5ml离心管收集骨髓细胞。v 总体积不要超过1.5ml低渗处理v 目的：使细胞内张力增大，细胞更容易破裂，染色体更分散。v 低渗液配方：0.075M KCl溶液v 1000rpm 离心 5min 使细胞聚集于管底，注意配平v 用注射器小心吸取上清，弃去。离心管内可以留少许液体v 加入1.5ml 37低渗液，振荡使细胞分散，在37 培养箱中保温低渗30min，做好标记。固定v 目的：固定染色体形态v 固定液配方： 甲醇：乙酸=3:1v 离心收集细胞，去上清。v 加入1

3、.5ml 固定液，振荡使细胞分散，室温固定15minv 离心收集细胞，去上清，按上述方法重复进行第二次固定重悬v 离心收集细胞，去上清。v 加入适量固定液（根据细胞多少而定，0.3-0.5 ml）v 振荡使细胞充分分散滴片v 目的：使细胞膜破裂，细胞核或核内染色体分散在载玻片上v 方法：从40cm以上的高度将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，滴两滴（载玻片1/3 和 2/3处）。滴加悬液时载玻片可适当倾斜（30度角），滴完后立即用嘴吹散细胞v 酒精灯过火3-4次干燥v 原理：滴片时产生的剪切力破坏细胞膜。预冷的玻片使得液体的表面张力增加，液层更薄，有利于细胞的分散和破裂染色-水洗-镜检v 染料：石碳

4、酸品红v 染液覆盖所有细胞v 染色5-8minv 水洗：用较小的水流冲洗载玻片背面，流水将从载玻片边缘带走染液v 滤纸擦干载玻片背面水分，室温自然干燥，无需盖玻片，镜检v 10倍镜下锁定目标细胞，40倍镜下观察染色体中期分裂相特点v 染色体浓缩成棒状，着丝点在染色体末端v 前中期姐妹染色单体紧挨在一起，镜下无法分辨，只能看到直线棒状的染色体（即姐妹染色单体的联合体）v 晚中期姐妹染色单体分离，只有着丝粒还连在一起，此时能看到V型的染色体（由已经分离的两个姐妹染色单体组成）结果展示注意事项v 安全：老鼠咬手、染液和固定液不要接触皮肤v 离心前注意配平v 低渗前标记自己的样品管v 水洗过程中要时刻记住载玻片的样品面和背面，别搞混v 酒精灯加热时间不要过长，用镊子操作v 待玻片完全干燥后再镜检课堂及实验报告要求v 课堂完成实验记录，要求有实验目的，步骤，以及实验过程中你认为需要记录的任何现象。结果部分要求有晚中期的手绘图，不可用照片替代。下课前找老师签字v 课