实验1大肠杆菌的分离和培养

1、选修选修1 生物技术实践生物技术实践第一部分第一部分 微生物的利用微生物的利用 实验实验1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物第二部分第二部分 酶的应用酶的应用 实验实验4 果汁中的果胶和果胶酶果汁中的果胶和果胶酶 实验实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测第三部分第三部分 生物技术在食品加工中的应用生物技术在食品加工中的应用 实验实验8 果酒及果醋的制作果酒及果醋的制作 实验实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定第四部分第四部分 浅尝现代生物技术浅尝现代生物技术

2、 实验实验11 植物的组织培养植物的组织培养第一部分第一部分 微生物的利用微生物的利用 微生物微生物：是指：是指结构简单、形体微小结构简单、形体微小的的单细胞单细胞、多细胞多细胞或或没有细胞结构没有细胞结构的的低等生物低等生物，如酵母，如酵母菌、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。菌、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。绝大多数绝大多数微生物微生物与传染病无关与传染病无关，90%90%以上以上的的微生物是微生物是对人类有益对人类有益的。的。微生物有微生物有多种用途多种用途，许多，许多抗生素抗生素来源于来源于放线放线菌和霉菌菌和霉菌；有些食品由；有些食品由微生物发酵微生物发酵制成，如制成，如酒酒

3、由由酵母酵母发酵产生，发酵产生，腐乳腐乳由由红曲霉红曲霉和和毛霉毛霉发发酵制成。酵制成。实验实验1 1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 基本要求基本要求 1.1.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的扩增扩增，利用，利用液体培液体培养基养基进行细菌进行细菌培养培养的操作。的操作。 2.2.进行大肠杆菌的进行大肠杆菌的分离分离，用，用固体平面固体平面培养基培养基进行细菌的培养。进行细菌的培养。 革兰氏革兰氏阴阴性、性、兼性厌氧兼性厌氧的肠道杆菌的肠道杆菌 在肠道中一般对人无害在肠道中一般对人无害 但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭肠粘膜并产生毒素肠粘膜并产生

4、毒素 任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。会对人体产生危害。结晶紫结晶紫 碘液碘液 95%乙醇乙醇革兰氏染色法革兰氏染色法1min1min革兰阳性革兰阳性 革兰阴性革兰阴性1min1min脱色脱色复染复染菌落菌落（colonycolony）：）：一个一个细菌细菌细胞细胞在在固体培养基固体培养基上发展成一个上发展成一个肉眼可见肉眼可见，具一定形态结构的，具一定形态结构的子细胞群子细胞群。 光滑型菌落粗糙型菌落粗糙型菌落1 1、实验仪器设备：、实验仪器设备：移液枪移液枪接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀超净工作台超净工作台（保证（保证无菌无菌环境）环

5、境）高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱恒温培养箱摇摇 床床2 2、培养基：、培养基：平板平板斜面斜面固体培养基固体培养基LBLB培养基：培养基：蛋白胨：蛋白胨：0.5g0.5g酵母提取物：酵母提取物：0.25g0.25gNaCl:0.5gNaCl:0.5gH H2 2O:50mLO:50mL琼脂：琼脂：1g1g液液体体培培养养基基固固体体培培养养基基调调pHpH值值菌膜菌沉淀均匀浑浊对照液体培养基（培养液）液体培养基（培养液）3 3、实验步骤：、实验步骤：（1 1）培养基、培养皿灭菌）培养基、培养皿灭菌 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 将配制好的将配制好的50ml LB液体和固体培养基液体和

6、固体培养基分别装入分别装入250ml 三角瓶中，加上三角瓶中，加上封口膜封口膜； 将培养皿用将培养皿用牛皮纸牛皮纸包好；包好；置于灭菌锅内置于灭菌锅内1kg压力压力灭菌灭菌15min （121） 最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可以杀灭，它可以杀灭所有所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。不被破坏。 有些有些玻璃器皿玻璃器皿也可采用也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为防止。为防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用都需采用适

7、宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能棉花塞（不能用脱脂棉：易吸水引起后引起污染）用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各，也可采用各种金属、塑料、种金属、塑料、封口膜封口膜及硅胶帽，它们及硅胶帽，它们只可让空气只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过通过，而空气中的其他微生物不能通过。 （160 2h160 2h或或170 1h170 1h） 高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液玻璃器皿、金属、移液枪头等枪头等 （火焰）灼烧（火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧：接种环、试管口、三角烧瓶口瓶口 紫外灯紫外灯+ +过滤风过滤风：超净台灭菌：超净台灭菌 消毒：消毒：70%70%

8、酒精棉球酒精棉球（消毒：利用化学或物理方法，杀死大消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。）部份致病微生物的过程。）（2 2）倒平板）倒平板 灭菌后，待灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力灭菌锅压力与大气压力相相同同时打开锅盖时打开锅盖 将有培养基的三角瓶和培养皿放到将有培养基的三角瓶和培养皿放到超超净台净台上上 打开超净台的打开超净台的紫外灯和过滤风紫外灯和过滤风，待固，待固体培养基体培养基冷却冷却到到60时，关闭紫外灯时，关闭紫外灯用用酒精棉球酒精棉球消毒消毒桌面和手。桌面和手。倒平板：倒平板： 10-12ml10-12ml培养基培养基/ /培养皿培养皿每倒入一个后立即置于水平位置

9、上，每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动轻轻晃动，使培养基，使培养基铺满铺满平皿底部，平皿底部，待凝待凝，并形成平面。，并形成平面。酒精灯旁：酒精灯旁：左手？右手？左手？右手？制作制作试管斜面试管斜面： 将配制好的呈熔化状态的培养基将配制好的呈熔化状态的培养基转移转移到试管中时必须用到试管中时必须用三角漏斗三角漏斗 灭菌试管冷却到灭菌试管冷却到5050左右，左右， 把试管棉塞一端搁在玻棒上，把试管棉塞一端搁在玻棒上， 待冷凝后即成试管斜面待冷凝后即成试管斜面 将分装好的含培养基的试管将分装好的含培养基的试管灭菌灭菌P21P21小字部分小字部分1/31/3在试管外，在试管外，2/32/3在试

10、管内在试管内正确正确不正确不正确棉塞制作棉塞制作（3 3）接种培养）接种培养 左左手：将大肠杆菌手：将大肠杆菌斜面斜面和有和有液体液体培养基培养基的的三角烧瓶三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；，靠近酒精灯火焰； 右右手：拿手：拿接种环，接种环，并用并用无名指无名指和和小指小指 夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜； 接种环在接种环在火焰火焰上烧红，再深入到斜面，上烧红，再深入到斜面， 使环接触培养基使环接触培养基，再取菌体；，再取菌体； 将菌体放入三角瓶的将菌体放入三角瓶的液体液体培养基中，培养基中， 瓶口封口膜和管口棉塞复原；瓶口封口膜和管口棉塞复原； 将三角瓶置于将三角瓶

11、置于37摇床摇床振荡振荡培养培养12h。（4 4）划线分离）划线分离 在酒精灯火焰上在酒精灯火焰上灼烧灼烧接种环；接种环； 将摇床上培养了将摇床上培养了12h的菌液的菌液 打打 开，接种环开，接种环部分部分深入到菌液中；深入到菌液中； 在固体培养基的平板上在固体培养基的平板上连续连续划线，接种环只划线，接种环只 在菌液中蘸菌液在菌液中蘸菌液一次一次，划线后盖好培养皿；，划线后盖好培养皿； 将培养皿将培养皿倒置倒置（盖在下面），（盖在下面），放到恒温培养箱放到恒温培养箱中培养中培养12-24h后，可看到在划线的后，可看到在划线的末端末端出现出现不连续的不连续的单个菌落单个菌落，表明菌已被，表明菌

12、已被分离分离。划线分离法划线分离法 划线的起点要有菌，且每一次新的起点应划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）比前一次的起点菌含量（浓度）低低 划线的最终点划线的最终点不能不能与前面的划线点与前面的划线点重叠重叠除第除第1 1次外，其余几次划线前，都要将次外，其余几次划线前，都要将接种环火焰灼烧接种环火焰灼烧恒温培养箱恒温培养箱平板倒置平板倒置防止防止培养皿盖培养皿盖上的上的冷凝水滴冷凝水滴落入落入培养培养基表面基表面，使菌落中的菌随水扩散，造，使菌落中的菌随水扩散，造成污染。成污染。 划线分离法划线分离法（5 5）斜面接种保存）斜面接种保存 在无菌操作下将单菌落用在

13、无菌操作下将单菌落用接种环接种环取出，取出，再用划线法接种在再用划线法接种在斜面上斜面上。 3737培养培养24h24h后，后，4 4 冰箱冰箱保存保存。涂布分离法涂布分离法首先，涂布分离法的操作比划线分离法首先，涂布分离法的操作比划线分离法更复杂。因为涂布分离法包括先将菌更复杂。因为涂布分离法包括先将菌液稀释的步骤，而且通常要稀释多个液稀释的步骤，而且通常要稀释多个浓度，常稀释到浓度，常稀释到1010-5-5-10-10-7-7倍。（稀释实倍。（稀释实验过程见验过程见P26P26图）在涂布时，从不同稀图）在涂布时，从不同稀释度的稀释菌液中各取释度的稀释菌液中各取0.1ml0.1ml放在平板放在平板固体培养基上，再用玻璃刮刀涂布后固体培养基上，再用玻璃刮刀涂布后培养。培养。其次，涂布分离法更易分开单菌落。通其次，涂布分离法更易分开单菌落。通常培养皿中有常培养皿