第四代基因组测序技术

1、纳米孔基因测序技术巴德年医学1501 王世瑀2基因测序第一代基因测序：Sanger Sanger 测序采用的是直接测序法，测序采用的是直接测序法，Sanger Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定的基测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。但是对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，而且其只能在因突变。但是对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，而且其只能在PCRPCR扩增后测序。而且只能逐段测序，分析单个扩增后测序。而且只能逐段测序，分析单个DNADNA片段。测序成本高，数据分析量大，自动化程度不高。片段。测序成本高，数据分析

2、量大，自动化程度不高。另外，此法，速度慢，时间长。另外，此法，速度慢，时间长。 第二代基因测序第二代测序技术测序平台和测序成本仍然十分高昂，仪器普遍高达第二代测序技术测序平台和测序成本仍然十分高昂，仪器普遍高达40-7040-70万美元，而一个全基因组测序至少需要万美元，而一个全基因组测序至少需要2000-50002000-5000美元，同时花费几周的时间；第二代测序美元，同时花费几周的时间；第二代测序技术依赖于基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程即增加了成本和样品制备的时间，也容技术依赖于基因样品的扩增过程，大量的洗脱过程即增加了成本和样品制备的时间，也容易出现错误累积；第二代测序技术普遍读长

3、为易出现错误累积；第二代测序技术普遍读长为150-400bp150-400bp，无法满足更高的科研需要；大量，无法满足更高的科研需要；大量的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。的数据拼接工作和光学读取导致的大体量数据，让分析变成了耗时耗力的工作。3英国牛津纳米孔公司最新研发出第三代基因测序技术，这项新英国牛津纳米孔公司最新研发出第三代基因测序技术，这项新的基因测序技术采用纳米孔单分子读取技术的基因测序技术采用纳米孔单分子读取技术4工作原理对DNA进行生物或化学处理,而采用物理办法直接读出DNA序列.其原理可以简单的描述为: 电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过

4、纳米孔。单个碱基通过纳米尺度的通道时, 会引起通道电学性质的变化.理论上, A, C, G, T 4 种不同的碱基化学性质的差异会导致它们穿越纳米孔时引起的电学参数的变化量也不同, 对这些变化进行检测可以得到相应碱基5MinION的尺寸之小，只有一支笔的长度，重大约100克，MinION完全颠覆了测序仪的形象，MinION直接通过USB链接到笔记本上，原始的电流信号通过网络传到英国的服务器上，进行读取。一个MinION有500个纳米孔在并行测序，每个孔每秒测30bp，因此，要测到1G的数据，需要3天时间。6 纳米孔生物纳米孔固体纳米孔前言：DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2 nm, 单

5、链DNA直径约为1 nm), 所以对所采用的纳米孔的尺寸有着近乎苛刻 的要求. 纳米通道(nanopore)是1999年由美国加州大学的Deamer和哈佛大学的Brant组共同提出的，是指由7聚体的a溶血素(aHL)在双层脂膜上形成的直径在(1526)nm通道。左膜通道最窄处直径尺寸约为1.5 nm, 恰好允许单链DNA分子通过, 并且大小严格一致，从本质上说是一种离子通道核酸外切酶附着在碱基表面将落入的孔的一侧的外表面，而让一种合成的环糊精作为传感器共价结合到纳米孔的内表面，将这个系统镶嵌在一个脂质双分子层内。为了提供既符合不同碱基检测又满足外切酶活性的物理条件，须事先将脂质双分子层，调为不

6、同的盐浓度。在合适的电压下，核酸外切酶消化单链DNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用，从而影响流过纳米孔的电流。 固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用离子束或电子束在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞, 再进一步对孔的形状和大小进行修饰而成. 相比于生物纳米孔, 固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势, 但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平, 固态纳米孔的制造还较为复杂与昂贵.7前提条件：（) ) 每个核苷酸都有其特有的电流阻塞信号每个核苷酸都有其特有的电流阻塞信号; () ; () 纳米孔具有合适的几何尺寸纳米孔具有合适的几何尺寸, , 一

7、次只容纳一个碱基通过一次只容纳一个碱基通过; () ; () 电流分辨率足以检测核苷酸的移动电流分辨率足以检测核苷酸的移动; () ; () 核苷酸分子的运动核苷酸分子的运动必须是单向的必须是单向的; () ; () 纳米孔与薄膜之间的组合应当足够牢固以适应实验所需的温度和化学环境纳米孔与薄膜之间的组合应当足够牢固以适应实验所需的温度和化学环境. .薄膜将溶液分为薄膜将溶液分为2 2个区域个区域, , 薄膜上的纳米孔作为连接薄膜上的纳米孔作为连接2 2个区域的导电通道个区域的导电通道. . 在薄膜的两侧加上偏置电压在薄膜的两侧加上偏置电压, , 溶液中的离子在电压作用下经过纳米孔产生离子电流溶

8、液中的离子在电压作用下经过纳米孔产生离子电流, , 在外部条件不变且无在外部条件不变且无DNADNA分子通过纳米孔的情况分子通过纳米孔的情况下下, , 该电流是稳定的该电流是稳定的. DNA. DNA分子在驱动电压作用下单向通过纳米孔通道时分子在驱动电压作用下单向通过纳米孔通道时, , 在合适的电压下，核酸外切在合适的电压下，核酸外切酶消化单链酶消化单链DNADNA，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用。，单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂作用。 由于碱基阻塞了通道导致流经纳米由于碱基阻塞了通道导致流经纳米孔通道的离子流量减小孔通道的离子流量减小, , 因此可以观察到离子电流的减小因

9、此可以观察到离子电流的减小. . 离子电流可以通过偏置电压乘以总电导的离子电流可以通过偏置电压乘以总电导的方式求得方式求得. .腺嘌呤腺嘌呤A A与胸腺嘧啶与胸腺嘧啶T T的电信号大小很接近，但的电信号大小很接近，但T T在环糊精停留的时间是其他核苷酸的在环糊精停留的时间是其他核苷酸的2 2到到3 3倍，倍，鸟嘌呤鸟嘌呤G G和胞嘧啶和胞嘧啶C C各自停留的时间也不同，所以每个碱基都有特有的电流干扰振幅而区分开来。另外甲各自停留的时间也不同，所以每个碱基都有特有的电流干扰振幅而区分开来。另外甲基化的基化的c c在环糊精的停留时间为正常在环糊精的停留时间为正常c c在环糊精的停留时间的两倍，所以

10、通过纳米孔检测还可以直接读取在环糊精的停留时间的两倍，所以通过纳米孔检测还可以直接读取甲基化的甲基化的c c8 隧道电流对隧道电流对DNADNA分子经过电极时的位置、方向十分敏分子经过电极时的位置、方向十分敏感感, ,所以即使非常微小的差异也会引起隧道电流的变化所以即使非常微小的差异也会引起隧道电流的变化, , 如何控制如何控制DNADNA分子准确、单一方向地通过纳米孔也很难。分子准确、单一方向地通过纳米孔也很难。 电容检测法作为一种可能的电学解决方案电容检测法作为一种可能的电学解决方案, ,也有研究也有研究者对此进行了研究者对此进行了研究, ,当单个碱基通过纳米孔时当单个碱基通过纳米孔时,

11、,其自身所带其自身所带电荷会引起纳米电容上的电荷量发生变化电荷会引起纳米电容上的电荷量发生变化, ,从而可以检测从而可以检测到电压的变化到电压的变化, ,理论上理论上4 4种不同的碱基所带电荷不同种不同的碱基所带电荷不同, ,引起引起的电压变压也会有所差异的电压变压也会有所差异, ,因此可以用于因此可以用于DNADNA的测序的测序. .在绝在绝缘体上硅衬底上制作出缘体上硅衬底上制作出poly-SiO2-Sipoly-SiO2-Si结构的纳米电容结构的纳米电容, ,来来检测碱基通过纳米孔时引起的电压波动检测碱基通过纳米孔时引起的电压波动, , 通过仿真验证通过仿真验证了采用电容的电压波动分辨单个

12、碱基信息的可能性了采用电容的电压波动分辨单个碱基信息的可能性, ,通过通过仿真给出了仿真给出了C, A, T, G 4C, A, T, G 4种碱基单独穿越纳米孔时引起的种碱基单独穿越纳米孔时引起的电压波动的变化。可以看出电压波动的变化。可以看出, C, A, G 3, C, A, G 3种碱基的电压曲种碱基的电压曲线较为相近线较为相近, ,有一个峰值和一个谷值有一个峰值和一个谷值, ,与单个偶极子穿越纳与单个偶极子穿越纳米孔引起的电压波动类似米孔引起的电压波动类似, ,而而T T的电压曲线可区分度较高的电压曲线可区分度较高, ,有有1 1个峰值和个峰值和2 2个谷值个谷值. .图中得到的结果

13、是脱离图中得到的结果是脱离DNADNA骨架的单骨架的单个碱基得到的结果个碱基得到的结果, , 实际在测量单个碱基过程中得到的实际在测量单个碱基过程中得到的电压值会受到电压值会受到DNADNA骨架、附近碱基和溶液离子的影响骨架、附近碱基和溶液离子的影响, , 因因此在碱基识别的准确度上还有很多需要研究的问题此在碱基识别的准确度上还有很多需要研究的问题. . 电容检测法电容检测法9 荧光测序DNA序列信息转换成两种颜色的图形信息，然后再通过光学读出技术进行检测、分析。然而，要将荧光探 针标记到DNA链中的每一个碱基上是非常困难的工作。于是人们开发出了一种新的方法，使用合成DNA和光读取技术测序。待

14、测DNA链中的每一个核苷酸都被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交。杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始 DNA链的序列。用两种不同的12 碱基寡聚体（12-mer oligos）A和B，按照四种不同的组合方式（AB、BA、AA、BB）将A、B组合起来，这样就可以对DNA链中的每一个核苷酸进行替换了。因为单个核苷酸通过纳米孔的速度实在是太快了，完全无法进行检测，所以将单核苷酸替换成这种长一点的寡聚体，可以减缓通过速度，方便检测。同时，通过这种信号转化还将DNA链中原本

15、的四种信号A、T、G、C简化成了A、B两种信号。挪威Lingvitae公司已经成功开发出了一种自动化的、大规模并行处理方法。该方法可以在24小时内将一个人类基因组序列转化成由24bp寡聚体序列组成的“新”序列。10 缺陷 1，DNADNA高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的弱点。高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的弱点。因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小 的信号根本就检测不到。在的信号根本就检测不到。在120mV120mV的条件下，的条件下，

16、DNADNA会以每个会以每个碱基碱基/1s20s/1s20s的速度通过的速度通过溶血素纳米孔。溶血素纳米孔。 这就需要探测器的检测带宽达到这就需要探测器的检测带宽达到MHzMHz级，才能检测到皮安级的电级，才能检测到皮安级的电流强度。流强度。 当当DNADNA在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。由于在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。由于DNADNA分子的随机分子的随机 运动使得运动使得它通过纳米孔的时间，即通过时间的跨度非常大，因此，人们无法判断有多少碱基通过了纳米孔。而且，由于跨它通过纳米孔的时间，即通过时间的跨度非常大，因此，人们无

17、法判断有多少碱基通过了纳米孔。而且，由于跨孔孔DNADNA分子与纳米孔表面间存在的分子与纳米孔表面间存在的 非特异性的相互作用还会受到非连续性的粘滑现象影响，所以相互作用会发生非特异性的相互作用还会受到非连续性的粘滑现象影响，所以相互作用会发生改变。同一种碱基分子通过纳米孔时的通过时间也会不同。而且如果碱基分子通过纳米孔的时间小于平均通过时改变。同一种碱基分子通过纳米孔时的通过时间也会不同。而且如果碱基分子通过纳米孔的时间小于平均通过时间，那么它极有可能被漏检。间，那么它极有可能被漏检。 鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的一点就是如何控制并减慢鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的

18、一点就是如何控制并减慢DNADNA分子通过纳米孔的速度，分子通过纳米孔的速度， 同同时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给DNADNA分子跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度分子跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度 可以在可以在一定程度上减慢一定程度上减慢DNADNA分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成的跨孔动力学分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成的跨孔动力学波动现象。波动现象。2，溶血素七聚体是最常用于在脂质双分子层中制造生物纳米孔的材料，它性质非溶血素七聚体是最常用于在脂质双分子层中制造生物纳米孔的材料，它性质非 常稳定。但脂质双常稳定。但脂质双分子层的性质却不那么稳定，尤其是液态脂质双分子层，制造起来极难且费时。分子层的性质却不那么稳定，尤其是液态脂质双分子层，制造起来极难且费时。使用离子束雕刻、电子束钻孔和原子层沉积等方法可以在氮化硅、氧化硅或其它