关于慢病毒感染的相关知识总结..

1、慢病毒使用操作手册、慢病毒的储存与稀释1.病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4C保存；如需长期保存请放置于-80C（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）病毒可以存放于-80C6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融，建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。2.病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）。混匀分装后4c保存（请尽

2、量在三天内用完）分装后使用。二、慢病毒用于体外（InVitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及在体（InVivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。慢病毒感染目的细胞预实验1 .慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：1测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞（HEK293T,Hela）作为平行实验的对照细胞。2在进行慢病毒感染实验时，可以

3、用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。一般慢病毒单位为TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。 如： 病毒滴度为1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。2.以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种35X104个目的细胞,铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔

4、培养基体积为100冏进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。第二天，准备病毒：取出4c保存的病毒，使用台式离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80C的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验。a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。一b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）。c在

5、目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。d混匀后放于二氧化碳培养箱（37C、5%CO2）孵育过夜。注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中。慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议在培养基中加入ploybrene（8（ig/ml左右）来提高病毒的感染效率。第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短

6、在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带MarkerGene的，可以通过Real-timeRT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。注意：有些慢病毒载体上带有GFP绿色荧光蛋白，使用者可以在病毒感染96小时后用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光， 以观察病毒对目的细胞的感染情况。 如果慢病毒载体携带其他MarkerGene如RFPBFP可以用荧光显微镜在对应的激发光

7、波长下观察荧光表达的情况。慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后96小时后观测荧光表达。:感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。三、慢病毒使用安全使用规范慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，不建议使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。使用时请参照如下所示进行实验：n1 .病毒操作时

8、最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。2.病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。3 .操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。5 .如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。6.脱掉手套后

9、，用肥皂和水清洗双手。四、悬浮细胞感染方法概要1 .根据细胞的量将细胞在1.5ml管中离心收集然后用100-200U1的无血清培养液稀释细胞沉淀， 以细胞完全浸没在培养基中为准。2 .按照MOI换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml管放在37c度培养箱中孵育30分钟。3.将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。4.加入足够量的新鲜培养液。5.12小时后换液。6.96小时后观察细胞阳性率。五、相关专业术语：MOI:病毒感染复数传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是

10、一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本手册中提到的MOI都是沿用这个概念。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。六、细胞培养器皿的相关参数Flask/DishSurface(mm)CellnumberMediaVolume96wellplate501.5-5.010100口48wellplate1003.0X104-1.00200口24wellpl

11、ate2008.0X104-2.00500口12wellplate4011.6-4.0101.0ml6wellplate9623.0-8.0102.0ml35mm9623.0-8.0102.0ml60mm28271.0-2.5106.0ml100mm78542.5-6.41010.0ml慢病毒重组慢病毒简介在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中，重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具。慢病毒能作用于细胞周期的 G0/G1期，同时具有嗜核性，所以可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞匚厘病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分

12、裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好、免疫反应小等优点。所以获得了较广的应用范围。慢病毒载体也是 RNAi 表达的主要手段，同化学合成和酶切形成的 siRNA 相比具有几个优点：其一，可以携带 GFP 或萤光素酶等报告基因共表达，便于跟踪、选择和富集转染的细胞；其二，可以根据需要表达不同类型的小 RNA 分子（siRNA、shRNA 或 miRNA）;其三，具有较高的转染效率,使基因沉默维持较长时间。目前 Pubmed 中收录有关慢病毒载体用作实验的文章超过 7 万多篇，仅 Nature,Science,Cell 上便超过 600 篇。已成为国际上最通用的转染系统，广泛用于

13、各类实验室。慢病毒的安全操作规范深圳百恩维提供的慢病毒均采用第三代系统的慢病毒载体。水泡性炎病毒来源的 VSV-G 基因代替HIV-1 的 env 基因，这既提高了慢病毒的安全性，又使其能够感染的细胞种类大大增加。本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）”，整合入靶细胞后，不会产生完整长度的 RNA,仅仅具有携带目的基因的功能，感染目的细胞后不再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险性，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假性病毒；并强烈建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，而且严格遵守 BSL-2 或BSL-2+操作手册

14、并进行相应的废弃物消毒。基本操作规范如下：1、在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服；应戴上合适的手套和口罩。2、病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通的超净工作台操作病毒，请不要打开风机。3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。如果出现病毒污染，请立即用 70%的酒精加 1%SDS 溶液擦拭干净4、如需离心，应使用密封性好的离心管，可用 Parafilm 膜封口后离心，而且最好使用组织或细胞培养室内的离心机。5、用显微镜观察细胞感染情况时遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，并在使用 70%乙醇清理所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利

15、用之前，必须清除污染。废弃的含病毒的培养基加入 84 消毒液（1:20 左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用 84 消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121C,30min）。6、手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。详细操作规范请参阅卫生部发布的微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS233-2002）、美国疾病控制中心出版的微生物和生物医学实验生物安全（第五版）和世界卫生组织出版WHO 生物安全手册。操作慢病毒时请依照现有的使用指南。包装细胞 293T 细胞（下述流程来自深圳百恩维，如果使用不同公司系统请参考各公司提供的方案，本

16、流程仅供参考）293T 细胞的冻存1、随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等，所以要在细胞购进时就进行备份。2、在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。3、倒去细胞上清液，加入 D-Hanks 液洗去残留的培养基。4、加入 0.25%的胰酶，消化 10-20S 后倒去。5、镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。6、细胞计数。7、将细胞离心，1000rpm,2min。8、根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为 3X106个/ml。10、第二天将细胞放入液氮灌，并记录。293T 细胞的传代1

17、、当细胞生长至汇合率达到 8090%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。2、消化细胞，方法同上。3、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3X105个/ml。4、分到 10cm 培养皿中，10ml/皿。293T 细胞的复苏1、当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。2、打开水浴锅，设置温度为 37C3、查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 12min 内使细胞溶液完全溶解。4、将 1ml 细胞溶液加入 9ml 完全培养基

18、中并混匀后转入 10cm 培养皿。5、放回 37C、5%CO2和 95%相对湿度的培养箱中培养。6、第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基。慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1、所用病毒检测引物为 WPRE 特异引物，序列如下5-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3(forwardprimer),5-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3(reverseprimer)and5-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3(probe)2、TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems3、Ta

19、qManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems4、TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems用于包装的 293T 细胞（ATCCNo.CRL-11268）必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率 90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到 100%。慢病毒的包装1、预先准备 3 个 T150 瓶的 293T 细胞，培养基为 DMEM+10%FBS,1%Glutamax,1%青霉素-链霉素。2、将细胞分到 12 个 T150 瓶中，每瓶的细胞密度是 8X106个。3、第二天，镜下检

20、查细胞。细胞融合度应大致为 30-40%,分布均匀。4、转染前 1 小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的 Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。5、取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252ggpNLEGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168ggpCD/NL-BH*DDD 包装质粒和 84ggpLTRG 质粒，用 Opti-MEM 培养基补齐到 18ml。另一支中加入 500glTransEZ 溶液和 17.5mlOpti-MEM 培养基，用电动移液器轻轻混匀。将 Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。关键步骤：推荐使用 Qiag

21、en 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。6、室温孵育 20 分钟，使 DNA 和 Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。7、取 1 支 5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板 3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过 6 盘。8、6 小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的 DMEM 完全培养基。9、转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80%o 如果所转染质粒带有GFP 荧光，那么这时候可以看到大于 95%的细胞都是带有荧光的。10、将细胞送回培养箱继续培养

22、2 天（36-48 小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁11、收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。12、4C,500g 离心 10 分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。13、总的上清约为 204ml,用 250-ml0.45gmPVD 过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。,cat.no.4304437),cat.no.401970)cat.no.4316844)慢病毒的浓缩与纯化方法一：超速离心沉淀法1、取 6 个 Ultra-clearSW28 离心管，用 70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒 30分钟。

23、2、每个 Ultra-clearSW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。3、取一支 10ml 的移液管，吸取 12ml20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml。同样地，将剩下 8ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。4、用 PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过 0.1go5、按次序将所有 6 个离心管放入 BeckmanSW28 超速离心转头中。6、小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可

24、见的沉淀。7、每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀。8、将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中，盖上盖子。9、在 4c 溶解 2 小时，每隔 20 分钟轻轻震荡。10、4C,500g 离心 1 分钟，使溶液集中于管底。11、用 200移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个 SW28 离心管中。12、集中后的病毒悬液分装成 50Ml 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80C。方法二 PEG-8000 浓缩法5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中； 1

25、21摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在 4C。1、使用 0.45 滤头过滤慢病毒上清液；2、每 2030min 混合一次，共进行 3-5 次；3、4 度放置过夜；4、4 度，4000g,离心 20min;5、吸弃上清，静置管子 12 分钟，吸走残余液体；6、加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；7、集中后的病毒悬液分装成 50v 每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。TU 为transducingunits 的缩写，中文为转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天细胞

26、准备将生长状态良好的 293T 细胞消化计数后稀释至 1xi05/ml,加入 96 孔板，1006 孔，为每个病毒准备 10 个孔。放入37C,5%CO2 培养箱中培养。第二天加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀木 I,连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10 个 1.5mlEP 管，每管加入 90 口培养液，往第一个管中加入 10 口病毒原液，混匀后，吸取 10加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（1010-8）。吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天追加培养液在每个孔再加入 100完全培养液，利于细胞的生长。第五天观察结果并计算滴度在荧

27、光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为 X 和 Y,则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（口。定量 PCR 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接种 HOS 细胞，每孔细胞为 5X104个。接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为 No弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5Vg/mlpolybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取 1代病毒加入到 199代1 的培养基中。在 3 个培养孔中分别加入 0.5“J5V1 和 50代的勺稀释病毒。感染开始后 20

28、小时，除去培养上清，换为 500含 DNasel（TakaraMirusBio，终浓度为 10U/ml）的新鲜培养基。在 37c 消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒 DNA。然后换为 2ml 正常的培养基，继续培养 48 小时。用 0.5ml0.25%胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在 37c 放置 1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。 每个样品管中加入 200Ml洗脱液洗下DNA。 用 DNA定量试剂盒定量 （Bio-Rad） 。基因组 DNA 可以稳定保存在-20C 至少 2 个月。准备 PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配

29、总管 I:19.7plxn2XTaqManMasterMixForwardprimer(100pmolml-1)25口n0.1屋nReverseprimer(100pmolml-1)Probe(100pmolml-1)0.1屋n0.1屋nxxXXH2On=numberofreactions.例如：总反应数为 40,将1ml2XTaqManUniversalPCRMasterMix,4glforwardprimer,4glreverseprimer,4glprobe 和 788glH2O 混和。震荡后放在冰上。为人基因组序列检测引物配总管口：2XTaqManMasterMix25xnlp10XR

30、NaseP2.511lprimer/probemixxnH2O17.5lM1n=numberofreactions.例如：总反应数为 40,将1ml2XTaqManUniversalPCRMasterMix,100gl10XRNasePprimer/probemix 和 700glH2O 混和。震荡后放在冰上。在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立。从总管 I 中各取 45V1 加入到 A-D 各行的孔中，从总管口中各取 45V1加入到 E-G 各行的孔中。分别取 5质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A-D 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 51 的水做

31、为无模板对照(no-templatecontrol)。分别取 5基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 5Vl 的水做为无模板对照(no-templatecontrol)。所使用定量 PCR 仪为 ABIPRISM7000 定量系统。循环条件设定为：50C2 分钟，95C10 分钟，然后是 95C15 秒，60C1 分钟的 40 个循环。数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integrationunitsperml,IUml-1)的计算公式如下：IUml-1=

32、(CNXDX1000)/V其中：C=平均每基因组整合的病毒拷贝数5、N=感染时细胞的数目(约为 1X10)D=病毒载体的稀释倍数V=加入的稀释病毒的体积数慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存1、病毒的运输采用干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于 4c 保存(于一周内用完)。2、若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80C 冰箱。一般病毒可以放于-80C约 12 个月以上，但若超过 6 个月后使用，请重新检测病毒滴度。3、避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度 10%o慢病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用 D-Hanks、PBS

33、 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后 4c 保存，并尽快用于实验(于一周内用完)。慢病毒在细胞水平的使用什么是 MOI?MO 的multiplicityofinfection 的缩写，中文为感染复数或复感染指数，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TUnumber/cell）。在实验中将某种细胞感染达到80%时的 MOI 定义为这不细胞的 MOIoMOI 与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和 MOI 呈正相关。MOI 取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性

34、、MOI 以及在体（invivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的 MOIo 实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的 MOI 和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需 MOI 以及病毒对细胞生长的影响。目的细胞感染预实验及实验体系的放大实验目的：确定细胞感染所需的 MOI,以及是否需要添加感染增强剂 Polybrene。实验材料：96 孔板，1.5mlEP 管，长势良好的目的细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml）,目的细胞培养基等。第一天：细胞准备将长势良好的目的细胞接种到 96 板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为 3X1045x104个/ml,按 90Vl 项加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于 3050%之间。第二天：病毒感染感染实