病原性病菌的分离鉴定及提高检出率

1、 进行病原性细菌的分离鉴定进行病原性细菌的分离鉴定 如何提高检出率？如何提高检出率？ 四川大学华西公共卫生学院四川大学华西公共卫生学院 医学检验教研室医学检验教研室 刘衡川刘衡川 电话：电话：028-85502097028-8550209713982287006 标本标本处理处理增菌培养增菌培养或修复培养或修复培养标本标本分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落鉴定鉴定报告报告标本标本分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落鉴定鉴定报告报告采集：采集：正确采集正确采集方法方法, ,时间、时间、 种类种类运送：运送：温度、时间、培养基温度、时间、培养基处理：处理：集菌、减少杂菌集菌、减

2、少杂菌 、 生物过滤、修复培养生物过滤、修复培养v样品的种类和来源样品的种类和来源 卫生指标微生物卫生指标微生物 病原微生物病原微生物v采集：正确采集采集：正确采集方法方法, ,时间、种类时间、种类v运送：温度、时间、培养基运送：温度、时间、培养基v处理：集菌、减少杂菌处理：集菌、减少杂菌 、生物过滤、生物过滤、修复培养修复培养一、样品采集、运送、处理一、样品采集、运送、处理肉肉类类生肉：生肉：取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌 100g/只只熟肉：熟肉：酱卤制品，熏肉及灌肠取样不少酱卤制品，熏肉及灌肠取样不少 于于200g，烧烤制品应取样，烧烤制品应取样50cm2熟禽：

3、熟禽：每份样品每份样品1只只香肚：香肚：每份样品每份样品1个个肉松：肉松：每份样品每份样品200g要要不不同同部部位位采采取取GB 4789.1GB 4789.1影响样品代表性的因素影响样品代表性的因素采样量采样量采样部位采样部位采样时间采样时间采样的随机采样的随机性和均匀性性和均匀性批号批号 ( (一一) )样样品品处处理理混匀样品混匀样品液体样品：电动、手摇或敲打震荡液体样品：电动、手摇或敲打震荡乳钵乳钵研磨均匀研磨均匀高速组织捣碎机高速组织捣碎机匀浆器匀浆器商品化的均质器商品化的均质器固体样品固体样品卫生微生物样品特点卫生微生物样品特点数量低数量低浓缩浓缩细菌受损细菌受损复苏复苏杂菌多杂

4、菌多选择性增菌和分离选择性增菌和分离标本标本分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落鉴定鉴定报告报告处理处理酸处理酸处理碱处理碱处理酶处理酶处理消毒剂处理消毒剂处理加热处理加热处理中和消毒剂中和消毒剂沉淀沉淀过滤过滤富集富集生物过滤生物过滤v酸处理酸处理：军团菌：军团菌：1 1份样品份样品+1+1份份1.2mol/L1.2mol/L酸缓冲剂，酸缓冲剂，pH2.2pH2.2，5min5min，中和后接种，中和后接种结核分支杆菌：结核分支杆菌：1 1份痰样品份痰样品+2+24 4倍的倍的4%4%硫酸，硫酸，室温室温30min30min，作用？，作用？v碱处理：碱处理：结核分支杆菌：结核分支杆菌：1 1份痰

5、标本份痰标本+2+24 4倍量倍量2%NaOH2%NaOH，室温室温5 510min10min，作用？，作用？( (一一) )样品处理样品处理v酶处理：酶处理： 结核分支杆菌：结核分支杆菌：1 1份痰标本份痰标本+1+12倍量的倍量的0.1%0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶，室温，室温5min5min，作用？，作用？v消毒剂处理：消毒剂处理： 结核分支杆菌：结核分支杆菌：1 1份痰标本份痰标本+1/2+1/2倍量倍量0.3%0.3%苯扎苯扎溴胺溴胺，室温，室温5min5min，作用？，作用？v加热处理：加热处理： 军团菌：军团菌：5050水浴水浴30min30min 炭疽杆菌：炭疽杆菌：6565水浴水

6、浴30min30min或或855min855min( (一一) )样品处理样品处理v中和消毒剂处理：中和消毒剂处理：硫代硫酸钠中和含氯消毒剂，如检测硫代硫酸钠中和含氯消毒剂，如检测自来水的细菌，检测水标本的军团菌自来水的细菌，检测水标本的军团菌等等v生物过滤：生物过滤： 钩端螺旋体钩端螺旋体小白鼠小白鼠肺肺 军团菌军团菌豚鼠豚鼠肺肺( (一一) )样品处理样品处理35 2.5% %CO2 37天天标本标本快速诊断快速诊断直直接接涂涂片片染染色色DFAELISAGimene 染色染色酸、热处理酸、热处理豚豚鼠鼠腹腹腔腔鸡胚鸡胚卵黄卵黄囊囊卵黄卵黄PBS液液腹腔液腹腔液脾悬液脾悬液45天天分离培养

7、分离培养可疑菌落可疑菌落纯培养纯培养初步报告初步报告鉴定试验鉴定试验染染色色镜镜检检生生化化反反应应血血清清学学试试验验气气相相色色谱谱DNA相关度测定相关度测定报告报告出现出现 症状症状酸、热处理酸、热处理标本标本分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落鉴定鉴定报告报告浓缩浓缩沉淀法沉淀法过滤法过滤法吸附法吸附法免疫磁珠法免疫磁珠法 损伤菌的复苏损伤菌的复苏2022-5-413( (二二) )样品浓缩样品浓缩常用方法常用方法沉淀法沉淀法过滤法过滤法细菌：离心沉淀，细菌：离心沉淀，3000r/min,30min 差速离心：差速离心：去除杂质，收集菌体去除杂质，收集菌体 絮凝剂沉淀：絮凝剂沉淀：FeCl

8、3+ NaOHFe(OH)3病毒：高速或超速离心机病毒：高速或超速离心机细菌：在负压或正压作用下，通过细菌：在负压或正压作用下，通过 0.45m孔径的滤膜孔径的滤膜病毒：通过膜的静电吸附浓缩过滤法病毒：通过膜的静电吸附浓缩过滤法 还可消除样品中的抑制剂还可消除样品中的抑制剂过滤法过滤法滤膜：硝酸纤维素、醋酸纤维滤膜：硝酸纤维素、醋酸纤维2022-5-414过滤法过滤法2022-5-415吸附法吸附法非特异性吸附：非特异性吸附：化学制剂形成化学制剂形成沉淀，共沉淀细菌沉淀，共沉淀细菌特异性吸附：特异性吸附：利用配体与受体利用配体与受体的亲和力，吸附待检微生物。的亲和力，吸附待检微生物。 如流感病

9、毒血凝素可与红细如流感病毒血凝素可与红细胞结合，低速离心收集红细胞，胞结合，低速离心收集红细胞，即达到浓缩病毒的目的即达到浓缩病毒的目的( (二二) )样品浓缩样品浓缩捕捕获获清洗清洗释释放放固相包被的抗体固相包被的抗体捕捕获目获目标细菌标细菌洗涤洗涤程序程序减少减少杂菌杂菌用用特异性酶特异性酶切割抗体切割抗体以释放活菌細胞以释放活菌細胞免疫磁珠法免疫磁珠法 磁珠磁珠- -( (二二) )样品浓缩样品浓缩v修复培养修复培养微生物受到严重损伤后，一般培微生物受到严重损伤后，一般培养方法不生长养方法不生长亚致死性损伤的致病菌，普通培亚致死性损伤的致病菌，普通培养方法无法培养而造成假阴性养方法无法培

10、养而造成假阴性人类食用后有患病的潜在威胁，人类食用后有患病的潜在威胁，当受损细菌进入人体，得到修复当受损细菌进入人体，得到修复产生致病性产生致病性( (三三) )损损伤伤菌菌的的复复苏苏v加工食品日益增多加工食品日益增多, ,细菌受损因素：细菌受损因素：热热冷冻冷冻冷藏冷藏干燥干燥高渗透压高渗透压消毒剂消毒剂防腐剂防腐剂添加剂添加剂( (三三) )损损伤伤菌菌的的复复苏苏v修复培养方法：修复培养方法： 增加营养成分：增加营养成分：如肉浸汁、胰胨、蛋白胨、如肉浸汁、胰胨、蛋白胨、各种氨基酸、活性酶蛋白、各种氨基酸、活性酶蛋白、ATPATP、丙酮酸等、丙酮酸等 简单的低级培养基：简单的低级培养基：

11、缓冲蛋白胨水，蛋白缓冲蛋白胨水，蛋白胨、胨、NaclNacl、磷酸缓冲液缓冲液等、磷酸缓冲液缓冲液等 高渗培养基、含有血清培养基高渗培养基、含有血清培养基 无抑制剂的培养基无抑制剂的培养基 改变改变pHpH 降低培养温度降低培养温度( (三三) )损损伤伤菌菌的的复复苏苏（3）弯曲杆菌：）弯曲杆菌： 样品先于样品先于0.3琥珀酸钠、琥珀酸钠、 0.010.01胱氨酸胱氨酸-HClHCl和抗生素的布氏肉汤，和抗生素的布氏肉汤，37培养培养6h 再加多黏菌素再加多黏菌素B，42，微需氧培养，微需氧培养损伤菌的恢复损伤菌的恢复国际上较公认的一些方法：国际上较公认的一些方法：（1）副溶血弧菌：）副溶血

12、弧菌：用用3NaCl蛋白胨水，蛋白胨水， 35培养培养2h前增菌前增菌（2）耶尔森氏菌属：）耶尔森氏菌属：4培养前，先培养前，先25 培养培养4h，前增菌，前增菌（4 4）大肠菌群、粪大肠菌群、副溶血弧菌、）大肠菌群、粪大肠菌群、副溶血弧菌、粪链球菌和金黄色葡萄球菌的粪链球菌和金黄色葡萄球菌的MPNMPN测定法：测定法：样品接种样品接种STBSTB培养基培养基，35353737，4 416h16h前增菌前增菌每管再加双料选择性肉汤培养基。再按原法进行每管再加双料选择性肉汤培养基。再按原法进行 （5）表面覆盖平板法：）表面覆盖平板法：样品倾注无选择性营养丰富的琼脂的平板，样品倾注无选择性营养丰富

13、的琼脂的平板，2537，14h，恢复受伤菌，恢复受伤菌再依据欲计数的细菌类别，覆盖一层约再依据欲计数的细菌类别，覆盖一层约1012ml的选择性培养基，继续培养。按原法进行的选择性培养基，继续培养。按原法进行（6 6）滤膜平板法：）滤膜平板法：混匀的样品混匀的样品1ml1ml，涂布于孔径，涂布于孔径450450m m的滤膜的滤膜上上置无选择性的琼脂平板培养基上，置无选择性的琼脂平板培养基上，3737，4h4h，恢复受伤细菌，恢复受伤细菌然后将滤膜置于选择性琼脂平板培养基上，然后将滤膜置于选择性琼脂平板培养基上，4018h4018h，计数粪大肠菌群，计数粪大肠菌群标本标本分离培养分离培养可疑菌落可

14、疑菌落鉴定鉴定报告报告选择合适的分离培养方法选择合适的分离培养方法增加样品接种量增加样品接种量挑选多个可疑菌落进行鉴定挑选多个可疑菌落进行鉴定增加分离平板的种类增加分离平板的种类培养基的质量控制培养基的质量控制增菌培养、弱选择性和强选择增菌培养、弱选择性和强选择性培养基各一种性培养基各一种培养条件：温度、湿度、气体培养条件：温度、湿度、气体等。如等。如幽门螺杆菌幽门螺杆菌二、选择合适的分离培养方法二、选择合适的分离培养方法四、挑选多个可疑菌落进行鉴定四、挑选多个可疑菌落进行鉴定三、增加样品接种量三、增加样品接种量阪歧肠杆菌检验方法 FDAFDA方法方法 100100、1010、1g1g样品各三

15、份（样品各三份（分别溶于分别溶于9 9份份4545无菌蒸馏水无菌蒸馏水） 3636过夜过夜 10ml10ml培养液培养液 + 90ml+ 90ml的的EEEE肉汤，混匀肉汤，混匀 3636过夜过夜 涂布涂布法或法或划线划线法接种法接种VRBGVRBG琼脂琼脂 3636过夜过夜 选择可疑菌落划线接种于选择可疑菌落划线接种于TSATSA琼脂上琼脂上 2548-72h2548-72h 选择黄色菌落用选择黄色菌落用 API 20EAPI 20E和氧化酶试验确证和氧化酶试验确证333g333g样品样品阪歧肠杆菌检验方法l每一增菌培养物接种每一增菌培养物接种2 2个个VRBGVRBG平板平板( (结晶紫结

16、晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂），中性红胆盐葡萄糖琼脂），0.1ml/0.1ml/平板，平板，用无菌玻璃棒涂布用无菌玻璃棒涂布l3636过夜过夜l挑取挑取5 5个个可疑菌落，划线接种可疑菌落，划线接种5 5个个TSATSA平板平板，25 4825 4872h72hl典型菌落形态：菌落周围紫色沉淀环典型菌落形态：菌落周围紫色沉淀环l选用敏感的、特异的选择性平选用敏感的、特异的选择性平板或鉴别平板进行分离培养板或鉴别平板进行分离培养l免疫荧光菌球法免疫荧光菌球法 五、增加分离平板的种类五、增加分离平板的种类非军团菌非军团菌L e g i o n e l l a pneumophila(灰兰色可疑菌落灰兰

17、色可疑菌落) GVPC 平板平板李斯特氏菌显色培养基李斯特氏菌显色培养基Listeria Chromagenic mediuml用于李斯特菌的选择性分离鉴别，用于李斯特菌的选择性分离鉴别，24h24h可初步判定结果可初步判定结果单增李斯特菌单增李斯特菌: 绿色，周围有晕圈绿色，周围有晕圈绵羊李斯特菌绵羊李斯特菌: 绿色，周围有晕圈绿色，周围有晕圈英诺克李特菌英诺克李特菌: 绿色绿色科玛嘉显色培养基科玛嘉显色培养基O157:H7 IDO157:H7 ID 显色培养基典型菌落显色培养基典型菌落单增李斯特菌大肠杆菌大肠杆菌O157:H7显色培养基显色培养基l用于大肠杆菌用于大肠杆菌O157:H7O1

18、57:H7的选择性分离鉴别，的选择性分离鉴别，24h24h可初步判定结果可初步判定结果O157:H7 : 紫红色紫红色其他大肠杆菌其他大肠杆菌: 蓝色蓝色其他其他: 无色或被抑制无色或被抑制沙门菌显色培养基沙门菌显色培养基 ( (陆桥陆桥) )l沙门菌的选择性分离鉴别，沙门菌的选择性分离鉴别，181824h24h可初可初步判定结果步判定结果沙门菌沙门菌 红色红色大肠杆菌大肠杆菌 黄色黄色沙门氏菌菌落沙门氏菌菌落( (紫紫) )( (CHROMagar显色培养基显色培养基) )沙门菌显色培养基沙门菌显色培养基沙门氏菌菌落特征（红）沙门氏菌菌落特征（红）( (海博公司显色培养基海博公司显色培养基)

19、 )Baird Parker 培养基培养基 + RPF凝固酶阳性葡萄球菌凝固酶阳性葡萄球菌 : 菌落周围形成沉淀圈菌落周围形成沉淀圈弧菌显色培养基弧菌显色培养基Vibrio Chromagenic medium 用于副溶血性弧菌的分离鉴别，用于副溶血性弧菌的分离鉴别，24h可可初步判定结果初步判定结果副溶血性弧菌副溶血性弧菌: 紫红色紫红色创伤弧菌创伤弧菌: 蓝绿色蓝绿色霍乱弧菌霍乱弧菌: 蓝绿色蓝绿色拟态弧菌拟态弧菌: 蓝绿色蓝绿色溶藻弧菌溶藻弧菌: 无色无色分子生物学方法：分子生物学方法：荧光定量荧光定量PCRPCR单克隆抗体单克隆抗体免疫荧光免疫荧光免疫磁珠技术免疫磁珠技术全自动微生物分

20、析仪器全自动微生物分析仪器 标本标本分离培养分离培养可疑菌落可疑菌落鉴定鉴定报告报告选用敏感的、特异的鉴定方法选用敏感的、特异的鉴定方法仪器检测法仪器检测法vVIDASVIDAS应用酶联免疫原理制造的全自动免疫分析应用酶联免疫原理制造的全自动免疫分析仪，用荧光分析技术通过固相吸附器，仪，用荧光分析技术通过固相吸附器，用用已知抗体捕捉目标生物体，然后用带已知抗体捕捉目标生物体，然后用带荧光的酶联抗体结合，荧光的酶联抗体结合，充分冲洗，激发充分冲洗，激发光源检测，自动读结果光源检测，自动读结果优点：灵敏度高，快速，优点：灵敏度高，快速，48h48h内鉴定沙门内鉴定沙门菌、大肠杆菌菌、大肠杆菌O15

21、7:H7O157:H7、单核李斯特菌，单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等VIDAS VIDAS 免疫免疫检测检测原理原理免疫捕获：免疫捕获：免疫夾心：免疫夾心：酶抗酶抗体与抗原結合体与抗原結合检測：检測：仪器测仪器测量量荧光荧光強度強度370 nm450 nm免疫免疫浓缩浓缩原理原理捕捕获获清洗清洗释放释放固相包被的抗体固相包被的抗体捕捕获目获目标细菌标细菌洗涤洗涤程序程序减少减少杂菌杂菌用用特异性酶特异性酶切割抗体切割抗体以释放活菌細胞以释放活菌細胞VIDASVIDAS 将将3030个细菌鉴定必需的生化反应培养个细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上

22、基固定到卡片上培养后，仪器判断显色反应培养后，仪器判断显色反应利用数值法进行判定利用数值法进行判定根据鉴定的微生物种类的不同，设计根据鉴定的微生物种类的不同，设计不同的鉴定卡片，如革兰阴性菌卡、不同的鉴定卡片，如革兰阴性菌卡、革兰阳性菌卡、酵母菌卡等革兰阳性菌卡、酵母菌卡等生物梅里埃自动微生物检测仪生物梅里埃自动微生物检测仪1.1.鉴定范围广：鉴定范围广：肠道肠道G G- -杆菌、非发酵杆菌、非发酵G G- -杆菌、杆菌、 葡萄球菌、链球菌、葡萄球菌、链球菌、G G+ +和和G G- -厌氧菌、淋球菌等厌氧菌、淋球菌等2.2.有有2020多种药敏试卡多种药敏试卡3.3.功能广泛：功能广泛：可同

23、时连接自动免疫诊断系统，可同时连接自动免疫诊断系统，食品质量鉴定食品质量鉴定LactometerLactometer系统等系统等4.4.设有多种程序设有多种程序，可根据不同需要加以调整，可根据不同需要加以调整5.5.自动化程度高，自动化程度高，一次性消耗品少一次性消耗品少6.6.快速、动态分析快速、动态分析7.7.封闭式操作封闭式操作自动微生物检测仪自动微生物检测仪检测时间检测时间80% 80% 临床分离株临床分离株鉴定鉴定: :平均检测时间平均检测时间5h5h鉴定鉴定+ +药敏药敏: :平均检测时间平均检测时间6 6h h自动化金标准自动化金标准 商品化生化鉴定系统商品化生化鉴定系统VITE

24、K GEN+VITEK GEN+一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液将菌悬液接种到各种细菌的卡片中将菌悬液接种到各种细菌的卡片中放入具有读数功能的孵箱内放入具有读数功能的孵箱内每隔一定时间，仪器自动检测发酵情况每隔一定时间，仪器自动检测发酵情况换算成能被计算机所接受的生物编码换算成能被计算机所接受的生物编码最后由计算机判定，打印出鉴定结果最后由计算机判定，打印出鉴定结果第第1位数位数第第2位数位数第第3位数位数第第4位数位数第第5位数位数第第6位数

25、位数第第7位数位数结结果果判判定定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4反应反应结果结果- + + + +- - - - + + + - +- + -沙沙门门菌菌应得应得数值数值0 2 40 2 41 2 41 2 40 0 0 0 0 0 0 0 40 0 41 2 41 2 41 0 41 0 40 2 00 2 0组合组合编码编码 6 6 7 70 04 47 75

26、 52 2lAPI 20EAPI 20E是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定方法一种细菌编码鉴定方法广泛应用于临床、食品中革兰阴性杆菌的快速鉴定广泛应用于临床、食品中革兰阴性杆菌的快速鉴定自动核酸纯化系统自动核酸纯化系统l应用面广：病毒、细菌的核酸提取，富集增菌应用面广：病毒、细菌的核酸提取，富集增菌l试剂开放：可使用各家公司的核酸磁珠提取试剂盒试剂开放：可使用各家公司的核酸磁珠提取试剂盒l速度快：速度快：20min20min内完成咽拭子内完成咽拭子H1N1H1N1核酸提取核酸提取l使用方便：仅需一步加入试剂使用方便：仅需一步

27、加入试剂cKingFisher mL- 50-1000l- 15个样品个样品/批批KingFisher - 20-200l- 24个样品个样品/批批- 50-1000 l-96 样品样品/批批KingFisher 96多病原体复合检测系统多病原体复合检测系统液相悬浮芯片系统液相悬浮芯片系统 多指标同步分析多指标同步分析（flexible multi-analyte profiling, xMAP）未来的一个主要检测技术！未来的一个主要检测技术！DATA!DATA!DATA!DATA!Ex1Ex2Em1Em3Em2DD Read 100 each color bead in assay 1 -

28、100 bead sets avail.ReadedBead-Based Technology多指标同步分析多指标同步分析(flexible multi-analyte profiling, xMAP)l上世纪上世纪9090年代，美国年代，美国LuminexLuminex公司公司l将将流式细胞仪、数字信号处理器流式细胞仪、数字信号处理器和和激光检激光检测装置测装置相结合相结合l具有多指标同步分析功能具有多指标同步分析功能悬浮芯片技术悬浮芯片技术(suspension array)(suspension array)液态芯片技术液态芯片技术(liquid chip)(liquid chip)l广

29、泛应用于细菌、病毒、单核苷酸多态性广泛应用于细菌、病毒、单核苷酸多态性( (SNPSNP) )检测等领域检测等领域l技术核心是特制直径技术核心是特制直径5.65.6m的聚苯乙烯微球的聚苯乙烯微球l每种微球按严格比例掺入每种微球按严格比例掺入2 2种不同荧光染料种不同荧光染料l每种染料有每种染料有1010种浓度梯度，两种染料搭配比例种浓度梯度，两种染料搭配比例的不同，可将微球分为的不同，可将微球分为100100种种l每种微球都有独特的光谱地址每种微球都有独特的光谱地址l根据试验目的，微球表面标记可以捕获相应目根据试验目的，微球表面标记可以捕获相应目标分子的配体，在杂交过程中加入荧光标记，标分子的

30、配体，在杂交过程中加入荧光标记，反应后检测反应后检测多指标同步分析多指标同步分析( (xMAP) )l在同一反应体系加入不同的微球，即可实现高通量在同一反应体系加入不同的微球，即可实现高通量l标记的微球与样品中待检目标分子作用，在液流带标记的微球与样品中待检目标分子作用，在液流带 动下通过流式细胞仪，两束不同波长的激光检测每动下通过流式细胞仪，两束不同波长的激光检测每个微球：个微球：635nm635nm的红色激光的红色激光区分微球种类区分微球种类532nm532nm的绿色激光的绿色激光荧光强度荧光强度l当标记的待测样本与特定微球上的探针结合，仪器当标记的待测样本与特定微球上的探针结合，仪器检测

31、两束激光所发的光检测两束激光所发的光l计算机自动分析特定微球上的平均荧光强度计算机自动分析特定微球上的平均荧光强度多指标同步分析多指标同步分析( (xMAP) )脉冲场电泳系统脉冲场电泳系统菌株鉴定系统菌株鉴定系统全球脉冲网的标准平台全球脉冲网的标准平台菌株鉴定菌株鉴定?追踪溯源追踪溯源多功能荧光酶标仪多功能荧光酶标仪荧光检测荧光检测（包括时间分辨荧光）（包括时间分辨荧光）化学发光检测化学发光检测Elisa 酶联免疫检测酶联免疫检测检测灵敏度大大提高检测灵敏度大大提高七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制l购买有质量认证的成品培养基购买有质量认证的成品培养基l新购买的成品培养基鉴定后使用新购

32、买的成品培养基鉴定后使用理化指标理化指标微生物学方法微生物学方法营养培养基营养培养基选择性增菌培养基选择性增菌培养基七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制理化指标理化指标lpHpH值值：2525时的测定值，时的测定值，0.2 0.2 比色法：比色法：用指示剂在不同用指示剂在不同pHpH溶液中的颜溶液中的颜色变化，与标准比色管或比色板相比色变化，与标准比色管或比色板相比电极式电极式pHpH计：计：用可测定固体的特殊电极用可测定固体的特殊电极pHpH值值、凝胶强度、色泽、澄清度、水分含量、凝胶强度、色泽、澄清度、水分含量七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制 微生物学方法微生物学方法l灵敏度测

33、定法灵敏度测定法l混合增菌培养法混合增菌培养法l测定增菌倍数法测定增菌倍数法l特异性测定方法特异性测定方法七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制 营养培养基营养培养基七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制 选择性增菌培养基选择性增菌培养基混合增菌培养法混合增菌培养法( (SCSC肉汤肉汤) )质控菌株质控菌株：鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌实验方法实验方法 将沙门氏菌和大肠杆菌肉汤新鲜培养物将沙门氏菌和大肠杆菌肉汤新鲜培养物按按1:99 1:99 混合，接种混合，接种SCSC肉汤，肉汤，3518351824h24h，适当稀释，涂布麦康凯琼脂，平板上应适当稀释，涂布麦康凯琼

34、脂，平板上应90%90%以上为沙门氏菌以上为沙门氏菌, ,大肠杆菌菌落应大肠杆菌菌落应10%10%。七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制 选择性增菌培养基选择性增菌培养基l测定增菌倍数法测定增菌倍数法(TTB)(TTB)l质控菌株：鼠伤寒沙菌和粪链球菌质控菌株：鼠伤寒沙菌和粪链球菌l实验方法实验方法七、培养基的质量控制七、培养基的质量控制选择性分离培养基选择性分离培养基含菌量约含菌量约1001001000CFU 1000CFU 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板按按ISO/TS11133-1ISO/TS11133-1要求，接种目标阳性菌、要求，接种目标阳性菌、弱生长阳性菌株、呈现不同生化特性的菌

35、弱生长阳性菌株、呈现不同生化特性的菌株和非目标菌（被抑制菌株）株和非目标菌（被抑制菌株）观察菌种的典型生长情况，并通过灵敏度、观察菌种的典型生长情况，并通过灵敏度、特异性对培养基的质量进行控制特异性对培养基的质量进行控制l灵敏度：灵敏度：目标菌目标菌1001000 cfu/板板l特异性：特异性：目标菌生长良好，特性典型，非目标菌目标菌生长良好，特性典型，非目标菌 不生长不生长干粉培养基使用注意事项干粉培养基使用注意事项摇匀后准确称量摇匀后准确称量蒸馏水或去离子水蒸馏水或去离子水配配制制用中性玻璃质容器用中性玻璃质容器加热溶解时适当搅拌，加热溶解时适当搅拌，不能过度加热不能过度加热含琼脂的培养基灭菌含琼脂的培养基灭菌后，不能长时间处于后，不能长时间处于高温状态高温状态干粉培养基保存干粉培养基保存阴凉、干燥、避光保阴凉、干燥、避光保存，不能放置冰箱保存，不能放置冰箱保存，防止受潮结块存，防止受潮结块保质期：开封后保质期：开封后6 6个月个月称量后迅速拧紧瓶盖，称量后迅速拧紧瓶盖，潮湿结块不能再使用潮湿结块不能再使用物质储备物质储备知识储备知识储备 责任心、事业心、荣