结构生物学：吸收光谱

1、二、谱学表征技术二、谱学表征技术生物大分子糖类脂类核酸蛋白质缀合蛋白质（有辅基）单纯蛋白质（无辅基）血红素蛋白（卟啉化合物）血红素蛋白（卟啉化合物）（如（如Mb Hb 细胞色素细胞色素c 过氧化氢酶）过氧化氢酶）黄素蛋白（含黄素辅基为 FMN和FAD）（如琥珀酸脱氢酶NADH脱氢酶)糖蛋白脂蛋白核蛋白磷蛋白金属蛋白生物大分子分类生物大分子分类光谱: 是指测量样品对光的吸收或散射的方法X-光紫外红外可见微波500,000 nm什么是分子光谱？什么是分子光谱？ 吸收光谱吸收光谱 红外光谱红外光谱 紫外可见吸收紫外可见吸收 散射光谱散射光谱 荧光光谱荧光光谱 拉曼光谱拉曼光谱 振动光谱振动光谱红外光

2、谱红外光谱拉曼光谱拉曼光谱振动园二振动园二紫外、可见吸收紫外、可见吸收荧光光谱荧光光谱园二光谱园二光谱电子光谱电子光谱光谱与能级分子光谱分子光谱 1.蛋白质结构及其吸收光谱方法蛋白质结构及其吸收光谱方法 CNHCCOA CNHCCOA abcCNCNdeCNNCfNCNCNC极少见到酰酰 胺胺 平平 面面酰酰 胺胺 平平 面面侧 链碳碳 原原 子子HNCHROCNHOCCC=180180在蛋白质分子中，紫外生色基团的吸收光谱主要受下列两种因素的影响：1)pH的影响溶剂的pH决定可解离的生色基团的解离状态。例如，酪氨酸在pH6和pH13两种溶液中具有不同的吸收光谱，在pH13时,由于酪氨酸的酚基

3、OH发生解离而带负电荷,因而其最大吸收峰的波长(max)和摩尔消光系数(E)都增大。 2）溶剂或邻近基团极性的影响 紫外生色基团的吸收光谱与其所处的环境具有很大的关系。以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸为例,若将它们从极性环境移入非极性环境,则最大吸收峰的波长(max)和摩尔消光系数(E)都增大。由此可见，溶剂或周围环境对紫外生色基团吸收峰的影响表现在两个方面：一是影响吸收峰强度，二是改变吸收峰的波长位置。若吸收峰向波长长的方向移动则称为红移或红向移动，反之，若吸收峰向短波长的方向移动，则称为蓝移或蓝向移动。 紫外差吸收法的基本原理 蛋白质的生色基团周围有各种其它的基团或溶剂。当生色基团暴露在蛋白质分

4、子表面时，有相当一部分是与溶剂(例如水)分子接触的。若生色基团藏于蛋白质分子的内部，它的周围是疏水的环境，相当于处于混合的非极性溶剂之中。蛋白质分子的生色基团具有各种微环境，这种微环境的性质由蛋白质分子的整个构象所决定。构象改变，微环境改变，生色基团的紫外吸收光谱也必然发生变化。只要测出生色基团紫外吸收光谱的变化，就可以了解微环境的性质，从而能推知蛋白质分子在溶剂中的大致构象。 为了能准确地反映生色基团紫外吸收光谱的变化，人们引用了分析化学中常用的差示计量的原则，设计了紫外差吸收(或称紫外差光谱)的方法。 假若一个生色基团在溶剂甲中的吸收峰是()，当溶剂改变成乙后，峰的曲线形状完全不变，只是峰

5、的曲线形状完全不变，只是红移红移()，吸收峰变成，吸收峰变成 (+)。这两个峰的差值。这两个峰的差值就是差吸光率就是差吸光率( )。 差光谱的峰顶是光谱峰变化最大的位置。 在实际工作中，(+)与()相比，可能的变化有：(1)峰的波长发生移动；(2)峰形发生变化；(3)光吸收强度发生变化。利用紫外差光谱可以研究蛋白质分子中生色基团紫外吸收光谱的变化。选择一个参比条件，然后比较其它条件与这一条件的差别。通常选用肽链完全伸展的状态或完全天然的状态作为参比条件。首先要测得简单生色基团的紫外差光谱。蛋白质在240nm以上的近紫外区内主要的生色基团是色氨酸与酪氨酸的侧链，有时还可包括苯丙氨酸的侧链。目前，

6、这些氨基酸在各种不同折射率的溶剂中的差光谱以及这些氨基酸生色基团的邻近的电荷变化所引起的差光谱都已测出。根据简单生色基团紫外差光谱所提供的信息，研究和分析蛋白质的紫外差光谱，我们就可以大致了解溶液中蛋白质分子的构象。通过测定蛋白质中芳香族残基(色氨酸、酪氨酸残基)的紫外差光谱，我们可以探讨这些芳香族氨基酸残基是位于蛋白质分子的内部还是表面，是处于极性环境还是非极性环境，其数量是多少，并可以检测和追踪蛋白质分子中-螺旋、-折叠和无规卷曲相互之间的构象转化过程。1) 溶剂微扰差光谱 溶剂微扰差光谱是通过测量改变溶剂组成(加微扰剂)所引起的光谱变化来计算蛋白质生色团的暴露分数。 微扰剂的加入常常降低

7、溶剂的极性，使生色团的基态和激发态之间的能级差变小，从而使蛋白质芳香氨基酸的最大吸收峰红移(重水相反) 。 为了正确的测定，微扰剂的加入必须不改变欲测大分子链的构象。 如果微扰作用的大小()和微扰剂浓度之间成直线关系，通常可以认为没有构象变化发生。 但是辅助性的测量，如圆二色性、沉降系数、比粘度等的测量则可作为更可靠的证明。 根据扰动差光谱可以区分外露与内藏深度不同的生色基团的数目。例如，溶菌酶分子中4个色氨酸残基原先与溶剂接触，当加入底物(乙二醇几丁质)后，底物与蛋白质结合，其中一个色氨基酸残基(62位)埋藏到底物内，由于微环境发生变化产生扰动差光谱。为了推算蛋白质中暴露生色团残基的分数，需

8、要选择相应的、生色团暴露为100%的样品作为参比。一般有以下两种方法：(1)用相应于蛋白质生色团组成的模型化合物(例如N-乙酰-L-酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)酯来代替。(2)展开蛋白链本身，使生色团充分暴露，自由地与溶剂接触。溶菌酶扰动差光谱pH5.6,18;扰动剂是乙二醇几丁质，它是溶菌酶的底物 2) pH差光谱及滴定 引起溶剂微扰差光谱的原因能归结于比较单一的现象，如蛋白质中芳香族侧链的暴露情况。 但酸或碱引起的差光谱(250-300nm范围)却归结于下列相关的物理现象： (1)在生色团附近正电荷和负电荷分配的变化； (2)酪氨酸残基侧链氢键的破坏或形成； (3)生色团环境的极性变化； (

9、4)在强碱性pH时，酪氨酸残基的解离。 由于引起pH差光谱的原因复杂，为了合理的解释结果，常配有多种手段的测量。如粘度、超离心分析和其它几种差光谱等。葡萄糖淀粉蛋白质E3和E4酪氨酸光谱滴定曲线 图为葡萄糖淀粉酶iE3和E4酪氨酸光谱滴定曲线，二者滴定行为没有明显差别。游离酪氨酸的pK值是9.7，但E和E的pK值超过11，表明E3和E4中的酪氨酸可能有氢键，或被遮盖，或埋藏较深不易解离。3) 温度微扰差光谱吸收变化是由于温度引起生色团环境的改变产生的。当样品和参比溶液之间温度的不同没有导致样品产生分子链构象变化，但是产生了吸收变化的时候，实际上类似于溶液微扰。不同的是，溶液微扰在理想状态下，仅

10、仅只有某些生色团被微扰，而介质温度的变化是使所有的生色团被微扰。当温度升高到一定程度时，蛋白质二级和三级结构的破坏总是伴随着光谱的改变。如果用辅助的方法证明它确是单一变性过程，温度微扰就是获得这个过程的热力学参数最合适方法。从这个过程的平衡常数K就能测定各种变性的热力学参数。K=(-N)/(D-)这里，N和D分别是蛋白质在天然和变性状态下的差吸光度。是蛋白质在转变范围的差吸光度。求得K后就可以得到标准自由能F-、焓H-和熵S-了。葡萄糖淀粉蛋白质E3和E4温差曲线pH3.1，E3和E4均为斜率很小的直线，而在pH3.6,E3和E4均为一曲线，E3的转变温度为56,E4为56.5，这表明在pH3

11、.1时,在30-70内，基本没有见到E3和E4构象变化，可能在pH3.1时，构象已发生了变化。在pH3.6时，温度升高后，E3和E4构象发生明显变化，两者转变温度虽然接近，但也可能在pH3.6时，E4构象已部分发生了变化，因而在pH3.6时，所观察到E4的构象变化比E3小。这里测得的E4转变温度为56.5，与此蛋白质在超过55时蛋白质活力迅速下降的现象是一致的。4) 浓度差光谱浓度差光谱是用于测定浓度对蛋白质生色团环境的影响而引起的构象变化。在蛋白质本身的浓度是唯一可变参数的条件下，蛋白质的缔合和解离就可以通过这个手段反映出来。虽然蛋白质分子的构象变化经常是二级结构和三级结构的变化，但除此以外

12、，在一些条件下，也常有四级结构的变化。如由于蛋白质分子的缔合或亚基的聚合，生色团可以变成埋藏的，或由于解离，使先前埋藏的生色团变成暴露的等等。浓度差光谱是将等量的吸收物质分别放在参比和样品光路中，使稀溶液的光径等于浓溶液的光径和浓度比的乘积。即：Csbs=Crbr 这里，C为蛋白质浓度，b为光径长度，最后使这两个系统仅仅反映由于蛋白质浓度不同致使生色团环境变化而引起的差光谱A=As-Ar (1)=s-r (2这里，A是吸光度，是摩尔吸光系数，s和r分别代表样品溶液和参比溶液。A=sCsbs-rCrbr (3)=A/Csbs (4)这就是浓度差光谱的基本公式。测定浓度差光谱的方法可参看图2.23

13、。先不管虚线部分，较短的池用作参比池，参比池中的样品浓度根据如下公式计算：cr=csbs/br (2.10)灌注蛋白质样品前，先在两个池中装溶剂，并平衡基线。池洗净干燥后，再装蛋白质溶液，扫描浓度差光谱，最好是使用一对串联双池。此时，在虚线部分装溶剂。5)变性差光谱肽链伴随蛋白质变性而伸展，原先埋藏在蛋白质分子内部疏水区中的生色基团将暴露到水中，吸收光谱蓝移，给出负的差吸收峰。变性蓝移，这是一般规律。但是，如果蛋白质的生色基团在天然状态时全部暴露在分子表面，则上述变性蓝移现象不会出现。许多变性剂，如胍、溴化锂、表面活性剂等，是电离的。尿素与肽键能形成氢键。变性剂的浓溶液折射率都比较高，而有些变性剂必须是高浓度才能引起蛋白