单元六 微生物测定技术

1、内 容 回 顾内 容 回 顾1、土壤表层以下_厘米范围微生物数目最多。2、土壤中微生物数目最多的是_。A.细菌 B.放线菌 C. 真菌 D.原生动物3、自然界筛选微生物菌种一般分为_、_、_、_4个步骤。4、微生物纯种分离的方法有_、_、_。回 顾单元六单元六 微生物测定技术微生物测定技术学 习 目 标学 习 目 标知 识 目 标知 识 目 标掌握微生物生长的群体规律。掌握微生物生长的群体规律。掌握微生物生长的测定方法。掌握微生物生长的测定方法。技 能 目 标技 能 目 标能够测定样品中微生物总数和菌落数。能够测定样品中微生物总数和菌落数。能够测定不同环境中微生物数量。能够测定不同环境中微生物

2、数量。重点重点微生物数目的测定。微生物数目的测定。目目 录录 第一节第一节 测定微生物生长繁殖的方法测定微生物生长繁殖的方法 一、测定微生物生长繁殖的方法一、测定微生物生长繁殖的方法 二、测定微生物细胞的数量二、测定微生物细胞的数量 第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 一、无分支单细胞微生物生长规律一、无分支单细胞微生物生长规律 二、丝状微生物生长规律二、丝状微生物生长规律第一节第一节 测定微生物生长繁测定微生物生长繁殖的方法殖的方法概概 念念u微生物在适宜的环境条件下就会不断吸微生物在适宜的环境条件下就会不断吸收营养，按自身方式进行新陈代谢。收营养，按自身方式进行新陈代谢。生长生

3、长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用代谢，当同化作用 异化作用时，生命个体的重异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。量和体积不断增大的过程。繁殖繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。增加的生物学过程。u在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代经过培养繁殖而得到的后代, ,称纯培养。称纯培养。u在微生物学中培养和发酵两个概念是相同。在在微生物学中培养和

4、发酵两个概念是相同。在工业上大规模的进行微生物培养称为微生物发工业上大规模的进行微生物培养称为微生物发酵。酵。一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量（一）重量测定法（一）重量测定法一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量n 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来, ,然后然后烘干烘干( (干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。一、称重。一般干重为湿重的般干重为湿重的10%20%10%20%，而一个细菌细胞一般重约，而一个细菌细胞一般重约1010-12-121010-13-13g g。n 该法适合

5、菌浓较高的样品。该法适合菌浓较高的样品。如大肠杆菌一个细胞一般重约如大肠杆菌一个细胞一般重约1010121210101313g g，液体培养物中细胞浓度达到液体培养物中细胞浓度达到2 210109 9个个/ml/ml时，时，100ml100ml培养物可得培养物可得101090mg90mg干重的细胞。干重的细胞。（二）细胞组分含量测定法（二）细胞组分含量测定法一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量n 1.1.蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法蛋白质是微生物的细胞主要成分，含量较稳定。蛋白质是微生物的细胞主要成分，含量较稳定。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%，酵

6、母菌为，酵母菌为7.5%7.5%，霉菌为霉菌为6.0%6.0%。蛋白质含氮量为蛋白质含氮量为16%16%。蛋白质总量蛋白质总量= =含氮量含氮量6.256.25（二）细胞组分含量测定法（二）细胞组分含量测定法一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量n 2.DNA2.DNA含量测定法含量测定法DNADNA是重要的遗传物质，含量较恒定。是重要的遗传物质，含量较恒定。DNADNA与与3 3、5-5-二氨基苯甲酸二氨基苯甲酸- -盐酸结合能显示特殊盐酸结合能显示特殊荧光，测定荧光强度，可算出荧光，测定荧光强度，可算出DNADNA含量。含量。一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量（三）菌丝长度

7、测定法（三）菌丝长度测定法n 该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。n 方法：方法：将真菌接种在固体培养基的平皿中央，将真菌接种在固体培养基的平皿中央，定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个平皿。个平皿。n 缺点：缺点：不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌落的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响落的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响结果，不能反映菌丝的总量。结果，不能反映菌丝的总量。一、测定微生物的生长量一、测定微生物的生长量（四）生理指标测定法（四）生理指标测定法n 通过测定活细胞

8、的生理指标测定通过测定活细胞的生理指标测定微生物的生长量。微生物的生长量。耗氧量、呼吸耗氧量、呼吸强度、酶活性、生物热等。强度、酶活性、生物热等。微量量热计微量量热计瓦勃式呼吸仪瓦勃式呼吸仪二、测定微生物的细胞数量二、测定微生物的细胞数量（一）总菌数测定法（一）总菌数测定法n 1.1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法n原理：原理：将将1cm1cm2 20.1mm0.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400400小格，从中均匀分布地选取小格，从中均匀分布地选取8080或或100100小格，计小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。胞数。n 适

9、用范围：适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（小的细胞，因为（1 1）细菌细胞太小，不）细菌细胞太小，不易沉降；（易沉降；（2 2）在油镜下看不清网格线，）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。超出油镜工作距离。n 特点：特点：快速，准确，对酵母菌可同时测快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。可以区分死活细胞。n 2. 2.电子计数器法电子计数器法n 方法：方法：在计数器中放有电解质及两个电极，将在计数器中放有电解

10、质及两个电极，将电极一端放入带微孔的小管，通电抽真空，使电极一端放入带微孔的小管，通电抽真空，使含有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通含有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通过小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变过小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变化，则每个细胞通过时均被记录下来。因样品化，则每个细胞通过时均被记录下来。因样品的体积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌的体积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌体的大小与电阻的大小成正比。体的大小与电阻的大小成正比。n 该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液，对该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液，对链状和丝状菌无效。链状和丝状菌无

11、效。n 3 3、比浊法（比色发）、比浊法（比色发）n原理原理: :在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。可反应出菌液的浓度。n特点：特点：快速、简便；但易受干扰。快速、简便；但易受干扰。二、测定微生物的细胞数量二、测定微生物的细胞数量（二）活菌数测定法（二）活菌数测定法n 1.1.平板菌落计数法平板菌落计数法n 技术要求：技

12、术要求：样品充分混匀，操作熟练快速样品充分混匀，操作熟练快速（1520min1520min完成操作），严格无菌操作。完成操作），严格无菌操作。n 注意事项：注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度。混匀处理，倾注平板时的培养基温度。n 适用范围：适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物。；上生长的微生物。；n 误差：误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作

13、。n3.3.薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法n常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。生物数目。n将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。样品中所含菌数。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律u由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。术上的困难。u为了研究细胞数量和质量的增

14、加，一般采用群体生长为了研究细胞数量和质量的增加，一般采用群体生长情况来反映个体的生长。情况来反映个体的生长。u微生物群体生长是有一定规律。微生物群体生长是有一定规律。u群体的生长规律对生产实践有指导意义。群体的生长规律对生产实践有指导意义。一、无分支单细胞微生物生长规律一、无分支单细胞微生物生长规律u 单细胞微生物主要包括单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。示的。u由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时，称为世代，一个世代所需的时间

15、就是代时，代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。单位时间内繁殖的代有时也称为倍增时间。单位时间内繁殖的代数成为生长速率。数成为生长速率。 u图中表示的是一个细图中表示的是一个细胞经过若干代分裂后的胞经过若干代分裂后的情况。情况。u从图可见，每经过一从图可见，每经过一个代时，细胞数目就增个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长这就是单细胞群体生长的特征。的特征。 u 以以细菌细菌为例介绍单细胞微生物群体生长规律，为例介绍单细胞微生物群体生长规律，其结论也基

16、本适用于酵母菌。其结论也基本适用于酵母菌。u 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个分裂直至死亡的整个动态变化过程动态变化过程。u 每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着生长过程却有着共同的规律性共同的规律性。一般可以将生长。一般可以将生长曲线划分为四个时期。曲线划分为四个时期。u 生长曲线：生长曲线： 把少量的细菌接种到合适的液体培养基中，在把少量的细菌接种到合适的液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定单位体积的适宜的条件下培养，定时取样测定单位体积的细胞数，并绘制

17、所得的曲线：以细菌细胞数目细胞数，并绘制所得的曲线：以细菌细胞数目的对数作的对数作纵坐标纵坐标，以培养时间为，以培养时间为横坐标横坐标，得出，得出细菌在生长过程中的曲线图。细菌在生长过程中的曲线图。u根据生长曲线的变化规律，可分为根据生长曲线的变化规律，可分为延迟期、延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期对数生长期、稳定期、衰亡期四个阶段。四个阶段。 延滞期延滞期 对数生长期对数生长期 稳定期稳定期 衰亡期衰亡期 单细胞微生物的典型生长曲线单细胞微生物的典型生长曲线细细胞胞数数目目的的对对数数生长曲线的制作生长曲线的制作：接种接种适温培养适温培养定时取样测定时取样测定生长量定生长量将少量单细胞的纯

18、培养，接种到一恒定容积的新鲜液将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。 1. 1.延迟期延迟期u又称为调整期、又称为调整期、停滞期、调整期、适应停滞期、调整期、适应期。期。u微生物延迟期的长短以细菌、酵母较短，微生物延迟期的长短以细菌、酵母较短，霉菌次之，放线菌最长。霉菌次之，放线菌最长。u原因：原因：适应新的环境条件，合成新适应新的环

19、境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。的酶，积累必要的中间产物。n 影响延滞期长短的因素影响延滞期长短的因素菌种：菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短。繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短。接种物菌龄接种物菌龄 ：用对数生长期的菌种接种时，用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期。其延迟期较短，甚至检查不到延迟期。接种量：接种量：接种量增大可缩短甚至消除延迟期接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用（发酵工业上一般采用1/101/10的接种量）。的接种量）。培养基成分：培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基

20、上生长时短；接种生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长。后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长。n 对实践的指导意义：对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短延迟期的措施有：采取的缩短延迟期的措施有： 增加接种量；增加接种量； 采用对数生长期的健壮菌种；采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种选用繁殖快的菌种在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭

21、菌u现象：现象：细胞数目以几何级数增加，细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。其对数与时间呈直线关系。u特点：特点：（1 1）生长速率常数最大，）生长速率常数最大，即代时最短；（即代时最短；（2 2）细胞进行平衡）细胞进行平衡生长，生长，菌体大小、形态、生理特征菌体大小、形态、生理特征等比较一致；等比较一致；（3 3）代谢最旺盛；）代谢最旺盛；（4 4）细胞对理化因素较敏感）细胞对理化因素较敏感u影响因素：影响因素：（1 1）菌种）菌种 （2 2）营养）营养成分成分 （3 3）营养物浓度（）营养物浓度（4 4）培养）培养温度温度 2.2.对数生长期对数生长期u对实践的指导意义：对实践

22、的指导意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；体密度；食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观遗传研究或进行染色、形态观察等察等的良好材料的良好材料。3.3.稳定期稳定期u又称：恒定期或最高生长期又称：恒定期或最高生长期u特点：特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等

23、，微生物的微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。目达到最高值。u细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。菌开始产芽孢。u此时期的微生物开始此时期的微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物，对于发酵，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。是最佳的收获时期。n产生原因：产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适；营养物的比例失调，如碳

24、氮比不合适；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（物化条件（pHpH、氧化还原势等）不合适。、氧化还原势等）不合适。u 对实践的指导意义：对实践的指导意义：（1 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：措施如下： 补充营养物质（补料即流加）补充营养物质（补料即流加） 调调pH pH 调整温度调整温度 （2 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。4.4.衰亡期衰亡期u特点：特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现所谓的负生长。群体中的活