分子生物学第08章PCR-聚合酶链反应

1、8.1 PCR 的基本原理的基本原理8.2 PCR 条件的优化条件的优化8.3 由基本由基本 PCR 扩展的相关技术及其应用扩展的相关技术及其应用8 PCR聚合酶链反应PCR的特点 聚合酶链反应（聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增）是一种体外扩增DNA片片段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩增相比，有简便、快速的优点，并有许多增相比，有简便、快速的优点，并有许多特殊的用处。特殊的用处。 PCR的基本原理一PCR的基本原理二图图81 PCR的的基本原基本原理理PCR反应的体系DNA模板模板一对引物一对引物耐

2、热的耐热的DNA聚合酶聚合酶4dNTP缓冲液缓冲液Mg2+、K+离子离子酶活性保护剂酶活性保护剂PCR仪 PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它仪实际上就是一种温度循环仪，它能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑控制。常用的反应容器有控制。常用的反应容器有0.2ml的薄壁的薄壁Eppendorf管和毛细玻璃管。管和毛细玻璃管。 对DNA模板的要求 对对DNA模板纯度的要求不很高，但必须除去模板纯度的要求不很高，但必须除去DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就模板分子就可以扩增出大量的产物，实际上使用可以扩增出大量的产物，实

3、际上使用pgng级的模板级的模板量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模板板DNA分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成较短的片段。由于环状较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状模板的扩增效率较线状DNA模板低，所以最好先将环状模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成用限制酶切成线状再行扩增。线状再行扩增。 RNA模板应先逆转录成模板应先逆转录成cDNA再进行再进行PCR扩增。扩增。引 物长度一般为长度一般为1530个核苷酸。引物太短与模个核苷酸。引物太短与模板结合的位点特异性差，引物太长与模板结板

4、结合的位点特异性差，引物太长与模板结合的速率下降，影响合的速率下降，影响PCR的效率。的效率。不应有超过不应有超过3个连续的个连续的C或或G。引物自身不存。引物自身不存在互补序列，两个引物之间也不能有超过在互补序列，两个引物之间也不能有超过4个连续碱基互补的情况。个连续碱基互补的情况。当引物的当引物的3端有足够长与模板互补的序列时，端有足够长与模板互补的序列时，引物的引物的5端可以不与模板互补，利用这点可端可以不与模板互补，利用这点可在在PCR产物的两端加上特殊序列（如限制性产物的两端加上特殊序列（如限制性内切酶位点）。内切酶位点）。图图82 引物引物5端外加端外加BamH酶切酶切 位点掺入产

5、物的两端位点掺入产物的两端引 物为了方便为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引产物的检测和分析，可以在引物的物的5端以同位素或非同位素修饰（端以同位素或非同位素修饰（32P、荧、荧光素、生物素等）。光素、生物素等）。当要扩增的当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨序列不知，但知其编码的氨基酸序列，可反推出基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物序列，为设计引物提供依据。因简并密码的存在，反推出的提供依据。因简并密码的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。序列是不唯一的，这时应采用简并引物。表表8 81 1 引物引物 5 5 端修饰技术端修饰技术修饰法修饰法用途用途修饰法修

6、饰法用途用途1.附加核酸序列附加核酸序列2.功能基因修饰功能基因修饰酶切位点酶切位点便于克隆等便于克隆等同位素同位素(35S, 32P)检测，定量检测，定量噬菌体启动子噬菌体启动子测序，合成测序，合成RNA探针等探针等生物素生物素检测，纯化，定量检测，纯化，定量蛋白质结合序列蛋白质结合序列产物纯化，检测产物纯化，检测荧光素荧光素检测，纯化检测，纯化酶酶检测检测Taq DNA聚合酶 现在常用的现在常用的Taq酶，在酶，在95的变性温度下的变性温度下（20秒），经过秒），经过50次循环仍保持次循环仍保持65 %的酶活性。的酶活性。对于对于Taq酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为酶的聚合酶活性来说，

7、最佳作用温度为7580，60时聚合酶活性仅剩时聚合酶活性仅剩1/2，37时时聚合酶活性仅剩聚合酶活性仅剩1/10。但在许多情况下，需要。但在许多情况下，需要在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引物从模板上解离下来。物从模板上解离下来。 Taq DNA聚合酶 Taq酶有酶有53的聚合活性和的聚合活性和53的外切活性，的外切活性，但缺少但缺少35的外切活性，所以没有校正功能，有的外切活性，所以没有校正功能，有时会发生错误合成。使用时会发生错误合成。使用Taq酶还往往在所有扩增酶还往往在所有扩增产物的产物的3端增加一个非模板依赖的端增加一个非模板依赖的A。现

8、在作为商。现在作为商品供应的品供应的Taq酶有从嗜热水生菌中提纯的天然酶和酶有从嗜热水生菌中提纯的天然酶和利用大肠杆菌生产的基因工程酶。利用大肠杆菌生产的基因工程酶。 PCR的反应体系 PCR中常用的缓冲液是中常用的缓冲液是1050 mmol / L的的Tris-HCl缓冲液，缓冲液，pH8.38.9，还需要合适的，还需要合适的Mg2+浓度（约浓度（约1.5 mmol / L）和）和K+浓度（浓度（50 mmol / L），），其中其中Mg2+浓度须经过预备实验确定合适的值，在浓度须经过预备实验确定合适的值，在0.05 mmol / L和和5 mmol / L之间试验，按每之间试验，按每0.5

9、 mmol / L增加。增加。Mg2+浓度太高时非特异扩增增加，浓度太高时非特异扩增增加，太低时产物减少。太低时产物减少。 PCR的反应体系 Taq酶的用量必须适当，一般典型的扩增反酶的用量必须适当，一般典型的扩增反应加应加2单位的酶，太高非特异扩增增加，太低时单位的酶，太高非特异扩增增加，太低时扩增效率下降。扩增效率下降。4种种dNTP的浓度应相等，浓度的浓度应相等，浓度在在20200mol/L之间。反应体系中加入之间。反应体系中加入BSA或或明胶可以保护明胶可以保护Taq酶活性。在无热盖的酶活性。在无热盖的PCR仪上，仪上，反应液表面应加矿物油以阻止蒸发。反应液表面应加矿物油以阻止蒸发。

10、循环条件的设定变性变性-退火退火-链延伸链延伸循环循环变性变性退火退火链延伸链延伸首轮循环首轮循环94 5 min50 2 min72 3 min中间循环中间循环94 1 min50 2 min72 3 min末轮循环末轮循环94 1 min50 2 min7210min循环条件举例循环条件举例循环条件的设定 在循环温度的设定中，最重要的是退在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。退火温度较低可提高扩增效率，火温度。退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差；退火温度较高可提但产物的特异性较差；退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。高产物的特异性，但扩增效率较低。嵌套PCR( n

11、ested PCR)嵌套PCR提高产物特异性的原理单用第一对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。单用第一对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。单用第二对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。单用第二对引物扩增，得一特异性产物和一非特异性产物。以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特异性产物。异性产物。特异性产物特异性产物特异性产物特异性产物非特异性产物非特异性产物非特异性产物非特异性产物反向PCR( inverted PCR)锚式PCR( anchored PCR)RACERapid Amplifi

12、cation of cDNA Ends扩增扩增mRNA3端或端或5端的序列称为端的序列称为RACE。锚式PCR扩增已知序列3侧序列锚式PCR扩增已知序列5侧序列锚式PCR扩增全长的mRNA序列 要扩增全长的要扩增全长的mRNA，先用，先用oligo(dT) 作引物逆转录该作引物逆转录该mRNA成全长的成全长的cDNA第一第一链，再给链，再给cDNA第一链的第一链的3端进行同聚物加端进行同聚物加尾（如尾（如GGGGG），最后用），最后用oligo(dT)和和oligo(dC)进行扩增。进行扩增。 不对称PCR( asymmetric PCR)定量PCR 严格地掌握实验条件，使严格地掌握实验条件，

13、使PCR扩增产物扩增产物量与模板量成正比。这样可将痕量的模板扩量与模板量成正比。这样可将痕量的模板扩增后检测，从而得到原模板的量。增后检测，从而得到原模板的量。 此法常用于低丰度此法常用于低丰度mRNA的检测。先将的检测。先将mRNA反转录成反转录成cDNA，再以，再以cDNA为模板扩为模板扩增出产物，检测产物的量从而推算出低丰度增出产物，检测产物的量从而推算出低丰度mRNA的量。这种方法称为反转录的量。这种方法称为反转录PCR（RTPCR）。）。( quantitative PCR )定量PCR中的内标 由于影响扩增产量的因素较多，模板与扩增由于影响扩增产量的因素较多，模板与扩增产物量的比例

14、关系难以确定，所以必须在同一次产物量的比例关系难以确定，所以必须在同一次PCR中加入内标。在一次中加入内标。在一次PCR中同时加入两种模中同时加入两种模板，一种是待测模板，另一种是按确定量加入的板，一种是待测模板，另一种是按确定量加入的作为内标的对照模板，二者使用相同的引物，对作为内标的对照模板，二者使用相同的引物，对照模板与待测模板的差异应尽量小，以便最大程照模板与待测模板的差异应尽量小，以便最大程度地减少扩增效率的系统误差。对照模板扩增产度地减少扩增效率的系统误差。对照模板扩增产物和待测模板扩增产物必须能由电泳分辨出来，物和待测模板扩增产物必须能由电泳分辨出来，比如二者的分子量有一定的差异

15、，或是二者序列比如二者的分子量有一定的差异，或是二者序列中有限制酶切位点的差异。中有限制酶切位点的差异。 荧光定量PCR 1995年美国年美国PerKin Elmer公司研制成功具有公司研制成功具有革命性意义的荧光定量革命性意义的荧光定量PCR技术，它融合了技术，它融合了PCR高灵敏性、高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点。荧光定量术的高精确定量等优点。荧光定量PCR是直接是直接探测探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，不需要结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭后处理或电泳检测，完全闭管操作，在整个过程

16、中，仅有加入样品的一次开管操作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开盖。盖。 TaqMan荧光探针（线性探针）（线性探针） 在在PCR扩增体系中加入一个特异性的、能与扩增体系中加入一个特异性的、能与PCR产物中部杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两产物中部杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭）和一个荧光淬灭基团（基团（Q）。探针完整时，）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被基团发射的荧光信号被Q基团吸收，结果是没有荧光出现。基团吸收，结果是没有荧光出现。PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的53外切活性将探针酶切降解，使

17、外切活性将探针酶切降解，使R基基团与团与Q基团分离，基团分离，Q基团对基团对R基团的荧光淬灭作用消基团的荧光淬灭作用消失，于是产生荧光信号。每扩增一条失，于是产生荧光信号。每扩增一条DNA链，就有链，就有一个一个R基团分离，游离的基团分离，游离的R基团数量（也就是荧光强基团数量（也就是荧光强度）与度）与PCR产物的形成完全同步。通过检测荧光强度产物的形成完全同步。通过检测荧光强度的变化，机内的电脑可以计算并直接给出初始模板的的变化，机内的电脑可以计算并直接给出初始模板的数量。数量。 TaqMan荧光探针工作原理分子信标（环状探针）（环状探针） 分子信标荧光探针的设计与分子信标荧光探针的设计与T

18、aqMan荧光探针荧光探针相似，只不过探针的相似，只不过探针的5端和端和3端的一小段序列被端的一小段序列被设计成互补的，探针没有与靶序列杂交时会形成茎设计成互补的，探针没有与靶序列杂交时会形成茎环结构，环结构，R基团和基团和Q基团靠近，不能产生荧光。当基团靠近，不能产生荧光。当分子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得分子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得R 基团和基团和Q基团分开基团分开足够远，足够远，Q基团对基团对R基团的荧光淬灭作基团的荧光淬灭作用消失。余同前。用消失。余同前。SYBR荧光染料 在在PCR反应体系中，加入过量的反应体系中，加入过量的SYBR荧荧光染料，光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入荧光染料能特异性地掺入DNA双链中，产生荧光信号，而不掺入双链中，产生荧光信号，而不掺入DNA双链中双链中的的SYBR荧光染料不会发出荧光。这样荧光强荧光染料不会发出荧光。这样荧光强度就与双链度就与双链DNA的量成正比。的量成正比。 荧光定量PCR仪光路图PCR产物与载体的连接解决办法：解决办法：用用T4 DNA聚合酶除去聚合酶除去PCR产物产物3端多余的端多余的核苷