222动物细胞融合与单克隆抗体(2课时)

1、 资料：资料：19701970年年LD.FryeLD.Frye和和H.EdidinH.Edidin的人的人鼠鼠细胞融合实验：分别用绿色和红色荧光染料标记细胞融合实验：分别用绿色和红色荧光染料标记两种细胞的蛋白质两种细胞的蛋白质细胞膜上的蛋白质分子能够运动细胞膜上的蛋白质分子能够运动 荧光标记荧光标记 蛋白质蛋白质诱导诱导融合融合4040分钟后分钟后37370 0C C如何实现人如何实现人- -鼠细胞融合鼠细胞融合? ? 动物融合后有何用途动物融合后有何用途? ?植物植物体细体细胞的胞的杂交杂交杂种细胞杂种细胞愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物细胞植物细胞A A植物细胞植物细胞B B 原生质体

2、原生质体A A原生质体原生质体B B正在融合的原生质体正在融合的原生质体去壁去壁去去壁（方法？）壁（方法？）人工诱导人工诱导( (方法？方法？) )再生壁再生壁脱脱分化分化再分化再分化植物体细胞融植物体细胞融合完成的标志合完成的标志动植物细胞动植物细胞在结构上在结构上有何区别？有何区别？一、动物细胞融合一、动物细胞融合1 1、概念：、概念： 是指是指 个或个或 动物细胞动物细胞 形形成成 细胞的过程，又称细胞的过程，又称 。两两多个多个结合结合一个一个细胞杂交细胞杂交2.2.融合的原理融合的原理3.3.诱导融合的方法诱导融合的方法4.4.融合的过程融合的过程5.5.融合的用途融合的用途细胞膜的

3、流动性细胞膜的流动性17为何可用灭活的病毒作为诱导剂？为何可用灭活的病毒作为诱导剂？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。不灭活的病毒可作为诱导剂吗？不灭活的病毒可作为诱导剂吗？一般不能！一般不能！ 因为不灭活的病毒会感染细胞，而不因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。能诱导细胞融合。在动物细胞融合的实际操作过程中，是只在动物细胞融合的实际操作过程中，是只 用单个的两种细胞来融合吗？用单个的两种细胞来融合吗？1918细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核灭活的

4、灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面病毒颗粒黏附在细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞细胞融合，形成杂交细胞细胞融合方法 化学：PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇） 物理：电融合：电融合 生物：病毒（灭活仙台病毒）：病毒（灭活仙台病毒）仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性 （不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性 （诱导细胞融合）（诱导细胞融合）1 1、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？、传统的抗体生产方法及缺陷是什么？ 传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物

5、血清中某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。2 2、B B淋巴细胞有什么特点？淋巴细胞有什么特点？ B B淋巴细胞能产生抗体，但每一个淋巴细胞能产生抗体，但每一个B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。只分泌一种特异性抗体。 因此，要想获得大量的单一抗体，必须因此，要想获得大量的单一抗体，必须用单用单个个B B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是克隆形成细淋巴细胞进行无性繁殖，也就是克隆形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单胞群，

6、这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体一、特异性强的抗体，即单克隆抗体。，即单克隆抗体。1 1、两位科学家极富创造性的设想是什么？、两位科学家极富创造性的设想是什么？ 如果把一种如果把一种B B淋巴细胞与能在体外大量增殖的淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。2.2.如果把如果把B B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式？有几种融合方式？B B淋巴细胞间的融合、淋巴细胞间的融合、B B淋巴

7、细胞与骨髓瘤细胞间淋巴细胞与骨髓瘤细胞间的融合、骨髓瘤细胞间的融合的融合、骨髓瘤细胞间的融合3.3.如何筛选我们所需的杂交瘤细胞？如何筛选我们所需的杂交瘤细胞？在具有筛选作用的培养基上培养，再进行抗体在具有筛选作用的培养基上培养，再进行抗体检测。检测。 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体诱导其融合的方诱导其融合的方法有哪些？法有哪些？两次筛选分别有什么目

8、的？两次筛选分别有什么目的？本过程利用了哪些原理？本过程利用了哪些原理？为什么选用小鼠骨髓瘤为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与细胞与B B细胞融合？细胞融合？3 3、单克隆抗体的特点、单克隆抗体的特点与与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显强，灵敏度高，优越性十分明显。 临床诊断临床诊断 作为载体，运载抗癌药物，形成作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹” ” 治疗肿瘤治疗肿瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、许多

9、缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的注意，目前，主也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。4 4、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用要点解读要点解读 (1)(1)诱导融合的诱导融合的2 2种细胞名称及作用种细胞名称及作用 免疫过的免疫过的B B淋巴细胞淋巴细胞( (浆细胞浆细胞)产生抗体产生抗体

10、; ; 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞无限增殖。无限增殖。 (2)(2)诱导融合与原生质融合的不同方法诱导融合与原生质融合的不同方法 动物细胞诱导融合的特有方法动物细胞诱导融合的特有方法灭活病毒诱导。灭活病毒诱导。 (3)2(3)2次筛选的目的及方法次筛选的目的及方法 在特定的选择性培养基上在特定的选择性培养基上, ,未融合的亲本细胞未融合的亲本细胞 ( (浆细胞和骨髓瘤细胞浆细胞和骨髓瘤细胞) )和融合的具有同种核的细和融合的具有同种核的细 胞胞(BB(BB融合细胞、瘤瘤融合细胞融合细胞、瘤瘤融合细胞) )都会死亡都会死亡, ,只有融只有融 合的杂种细胞合的杂种细胞( (杂交瘤细胞杂交瘤细胞) )才能

11、生长。这种杂种才能生长。这种杂种 细胞的特点是既能迅速大量繁殖细胞的特点是既能迅速大量繁殖, ,又能产生单一的又能产生单一的 特异性抗体。特异性抗体。 经选择性培养的杂交瘤细胞并非都是能分泌所经选择性培养的杂交瘤细胞并非都是能分泌所 需抗体的细胞需抗体的细胞( (很多种杂交瘤细胞很多种杂交瘤细胞),),需经克隆化培需经克隆化培 养和抗体检测养和抗体检测, ,经多次筛选后就可获得足够数量的经多次筛选后就可获得足够数量的 能分泌所需抗体的细胞。能分泌所需抗体的细胞。 (4)2(4)2个培养提取场所个培养提取场所 体外培养体外培养培养液提取。培养液提取。 体内小鼠腹腔中培养体内小鼠腹腔中培养小鼠腹水

12、中提取。小鼠腹水中提取。 提醒提醒 取相应取相应B B细胞前必需先注射相应抗原细胞前必需先注射相应抗原, ,形象形象 地说先地说先“打针打针”, ,否则失败。否则失败。(5)(5)原理：细胞膜的流动性和细胞增殖及免疫学原理。原理：细胞膜的流动性和细胞增殖及免疫学原理。 拓展提升拓展提升 植物体细胞杂交和单克隆抗体的制备的比较植物体细胞杂交和单克隆抗体的制备的比较植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合( (单克隆抗体单克隆抗体的制备的制备) )理论基础理论基础( (原理原理) )细胞膜的流动性、细胞的细胞膜的流动性、细胞的 全能性全能性细胞膜的流动性、细胞增殖细胞膜的流动性、细胞增

13、殖融合前融合前处理处理酶解法去除细胞壁酶解法去除细胞壁( (纤维素纤维素酶、果胶酶酶、果胶酶) )注射特定抗原注射特定抗原, ,免疫处理正免疫处理正 常小鼠常小鼠促融方法促融方法(1)(1)物理法：离心、振动、物理法：离心、振动、电刺激等电刺激等(2)(2)化学法：聚乙二醇化学法：聚乙二醇(PEG)(PEG)(1)(1)物、化法：与植物细胞物、化法：与植物细胞 融合相同融合相同 (2)(2)生物法：灭活的病毒生物法：灭活的病毒过过程程第第一一步步原生质体的制备原生质体的制备( (酶解法酶解法) )正常小鼠正常小鼠免疫处理免疫处理第第二二步步原生质体的融合原生质体的融合( (物、化法物、化法)

14、)动物细胞的动物细胞的融合融合( (物、物、化、生法化、生法) )第第三三步步杂种细胞的杂种细胞的筛选和培养筛选和培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞的筛选与培的筛选与培养养第第四四步步杂种植株的杂种植株的诱导与鉴定诱导与鉴定单克隆抗体单克隆抗体的提纯的提纯意意义义和和用用途途(1)(1)克服远缘杂交不亲和的障碍克服远缘杂交不亲和的障碍, ,大大扩展杂交的亲本组合范围大大扩展杂交的亲本组合范围(2)(2)克服有性杂交的母系遗传现克服有性杂交的母系遗传现象象、获得细胞质基因的杂合子获得细胞质基因的杂合子、研究细胞质遗传研究细胞质遗传(1)(1)制备单克隆抗体制备单克隆抗体(2)(2)诊断诊断、治疗治疗、预防

15、预防疾病。例如疾病。例如: :单抗诊断单抗诊断盒盒、“生物导弹生物导弹”治治 疗癌症疗癌症 1、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞

16、培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC练一练练一练2、A 、 B细胞为动物细胞细胞为动物细胞,请据图回答问题请据图回答问题:A细胞细胞B细胞细胞C细细胞胞D细细胞胞(1)若若A细胞为骨髓瘤细胞细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细胞,

17、那么那么D细胞细胞称为称为 细胞细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征细胞具有两个亲本细胞的特征,一方一方面因具有骨髓瘤细胞的面因具有骨髓瘤细胞的 性质性质,通过通过 方式方式产生大量细胞产生大量细胞,我们称之为我们称之为 过程过程;另一方面能分泌另一方面能分泌大量的抗体大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称我们把该过程分泌的抗体称 .杂交瘤杂交瘤连续分裂连续分裂有丝分裂有丝分裂单克隆单克隆单克隆抗体单克隆抗体练一练练一练(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合合成该物质的场所是成该物质的场所是 ,它是由它是由 控制控制合成的合成的,合成过程包括合成过程包括 和和 两个

18、重要步骤两个重要步骤.球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转录转录翻译翻译(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用,与血清抗与血清抗体相比其优越之处在于体相比其优越之处在于 强强, 高高.免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)若若A为人细胞为人细胞,B为鼠细胞为鼠细胞,用同位素标记用同位素标记A细胞膜上的细胞膜上的蛋白质蛋白质,B不标记不标记,在在C细胞时细胞时,检测结果发现整个细胞一检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有半有放射性另一半没有.在在D细胞时细胞时,检测结果发现整个检测结果发现整个细胞都有放射性细胞都有放射性,请解释原因请解释原因 .构成细胞膜的蛋白质构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动分子大都可以流动练一练练一练3.3.利用细胞工程方法，以利用细胞工程方法，以SARSSARS病毒核衣壳蛋白为抗病毒核衣壳蛋白为抗 原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ） A.A.用纯化的