总结报告-模板

1、专硕1班：邓剑平学号：2111740137重组乙肝疫苗的开发目录CONTENTS目的：开发治疗乙型肝炎的新药，获得新药临床试验批件，新药证书.意义：乙肝 在全世界广泛流行，给人类社会带来沉重的健康和经济负担，已成为主要的公共卫生问题之一。接种乙肝疫苗已成为预防控制乙肝病毒 感染传播最经济有效的措施。但由于血源性乙肝疫苗具有产量低、生产成本高、浪费血浆等特点，因此我国原卫生部明确规定，从1998年6月30日起停止生产血源性乙肝疫苗，并于2000年停止使用，而采用基因重组乙肝疫苗。重组CHO细胞乙肝疫苗免疫保护效果优于重组酵母疫苗，大剂量重组酵母乙肝疫苗持久性优于小剂量。国内外研究现状： 目前普遍

2、推行的乙肝疫苗主要是由重组的酿酒酵母、汉逊酵母或中国仓鼠卵巢细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原添加到氢氧化铝或磷酸铝佐剂中制备而成。全程免疫后，的免疫人群均可产生型体液免疫应答，从而起到抗感染的保护作用。然而，它对于早期细胞免疫，阻断病毒母婴传播并不能发挥有效作用，对于肝细胞内寄生的，亦不能发挥细胞免疫作用，也不能有效清除病毒。现行乙肝疫苗全程免疫一般需要多次注射， 不断加强免疫效果， 才能诱发机体产生长效的免疫应答。 近年来，接种乙肝疫苗的不良反应在国内外已经引起广泛关注，且不良反应范围甚广，如可以引起过敏性休克，一旦发生后果很严重。影响疫苗免疫效果的因素主要抗原纯度、使用的佐剂、灭活方法和贮存

3、条件等。提高乙肝疫苗的免疫原性，增强各人群对疫苗的应答水平，简化免疫程序，改变给药方式，既能发挥免疫预防作用，又可以有效清除病毒并达到治疗效果，是有效遏制乙型肝炎的发展趋势乙肝疫苗的结构特点：HBV DNA的两链长短不一，长链（L）完整，为负链，长度恒定，约3200个核苷酸。短链（S）为正链，长度可变，约为长链长度的50100%，链的增生按5-3顺序进行。在不同分子中短链3端的位置是可变的，而短链和长链的5端位置固定点为粘性末端，通过250300个核苷酸碱基配对，以维持DNA分子的环状结构。在粘性末端两侧，两链5端各有一个由11个bp组成的直接重复序列 (Direct repeat DR)-5

4、TTCACCTCTCC，该DR位于第1824个核苷酸者称DR1，位于第1590个核苷酸者称DR2，在病毒复制中起作用。常见的HBV病毒基因变异（1）S基因区变异：S基因区包括前S1、 前S2 及S基因， 分别编码前S1 蛋白、 前S2 蛋白及主蛋白。（2）前C/C基因变异： C1896 位(A83)的变异是HBV中最常见的变异。（3）P基因区变异：P基因区编码HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突变率与逆转录病毒gag基因相近。 （4）X基因变异：X基因是病毒复制的重要调节区， 是转录、 反转录和正链合成的起点， 也是多种细胞因子结合点， 此区变异影响到病毒的转录和复制。目前专利情况（来源

5、于药渡网）目前国内外对乙肝疫苗的开发比较成熟，全球有31个已经批准上市，有14个处于临床试验，专利申请数量有22个，中国CED注册与受理的有133个公司机构，以国内本土企业居多。乙肝疫苗的生产过程Step 1.目的基因的获得:在NCBI网站上搜索HBsAg的基因序列,用Primer3 (v. 0.4.0)软件在线设计引物,然后进行PCR. 引物如下:上游：5- cctgcacgactactgctcaa-3下游：5-gcccactcccataggaattt-3PCR扩增合成基因 变性：92 ，1min 退火：55 ，1min 延伸：72，2min 30个循环。 延伸：72 ,4min 产物经电泳

6、后割胶回收171bpDNA片段。Step 2 . HBsAg重组子的构建及筛选用EcoRI 和 Nhe I双酶切扩增出来的DNA片段及p CIneo质粒，用DNA连接酶连接切割产物，将连接产物转入大肠杆菌（DH5）感受态细胞。在涂布有氨苄青霉素的平板上进行阳性筛选。Step 3. HBsAg的表达及鉴定 采用PCR法和酶切法进行鉴定。PCR法：以表达载体为模板，利用引物进行PCR扩增，观察扩增出的基因片段是否与预期相符。酶切法：用 Asu和 Xba I 双酶切达载体，观察片段大小是否符合预计大小。生产工艺与质量控制体系的建立 1、细胞库（菌种）：（大肠杆菌、目的基因（HBsAg）、载体（p C

7、Ineo质粒）、杂菌、病毒、致病基因的质量控制）在同一实验工作区不得同时操作两种不同菌种， 同一工作人员不得同时操作两种不同细胞。 细胞染色标记方法测细胞活性，这才能真实反映生产的药物效价MTT 3H-Thymidine 流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡）2、发酵工艺及分离纯化工艺（中间体）：表达水平、 总产量的测定 （1）有限代次生产控制：对培养和诱导基因产物的材料有详尽的资料，培养过程及收获时，有灵敏的检测措施。在生产周期结束时，做质粒拷贝数、大肠杆菌表达载体存留的程度、含插入基因的载体的酶切图谱。 （2）纯化工艺过程的控制：尽量除去污染病毒、核酸、宿主细胞、杂蛋白等及纯化过程带来的有害物质

8、。这些可以利用凝胶、离子交换等层析方法来进行除杂。 3、最终产品的控制 对产品的鉴别、纯度、稳定性和活性等的试验方法，检测项目与纯度要求要根据纯化工艺过程、产品理化性质和用途等来确定。 （1）物理化学鉴定：包括氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析、肽图分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦、高效液相色谱、残余细胞DNA测定、其他外源性物质测定 （2）生物学测定：包括鉴别试验、效价测定、热原质试验、病毒污染检查、无菌试验、抗原物质检查、毒性试验临床前药理学研究和安全性评价1、建立HBV实验模型 可利用小鼠来制造病理模型2、药理研究：（1）主要药效学研究：将实验小鼠分成两组：空白对照组（不注射乙肝疫苗）

9、和实验组（注射乙肝疫苗），分布不同给药剂量，通过观察治疗效果。（2）一般药理学研究对神经系统影响：观察受试小鼠的行为变化，检测其神经中枢兴奋或抑制状态；对心血管系统影响：测定受试小鼠血压、心电图、心率和心律变化对呼吸系统影响：测定受试小鼠呼吸频率和深度3、毒理研究包括： 3.1单次给药毒性试验：试验时间一般12周，检测指标包括体重、笼旁观察、大体解剖检查等。可以得到关于全身和/或局部毒性的剂量-效应关系数据，这些数据可用于选择重复给药毒性试验的剂量。3.2重复给药毒性试验: 试验的持续时间应基于临床的接受剂量和适应症，乙肝疫苗注射时间为1-3个月。检测指标包括急毒试验中常规的项目, 还有特殊检

10、测项目的如眼底镜检查、心电图描记、体温、血压等。 3.3安全性药理试验:安全性药理试验的目的是观察任何对主要生理系统功能 (如心血管、呼吸、肾脏和中枢神经系统)可能的影响。安全性药理试验评价药物潜在毒性的功能指数，这些功能指数可以通过单独的试验观察，也可结合在单次和多次给药毒性试验中进行。考虑到可能有免疫复合物的产生，包括对肾脏的检查（尿液分析和肾脏电镜检查）3.4生殖和发育毒性试验:小鼠（生育力、胚胎-胎儿 、围产期毒性试验）3.5致癌性实验：未进行3.6免疫毒性试验：在重复给药毒性实验时，进行血液学检查、关于免疫器官详细的组织病理学检查以及称量淋巴器官的重量等，必要时增加免疫功能的测定指标

11、。（只有毒性研究结果表明有必要时，才进行另外的免疫毒性评价）3.7遗传毒性试验：由于生物技术药物及其降解产物很难与DNA或其它染色体物质发生直接作用，因此研发者通常不需要进行常规的遗传毒性试验。3.8局部耐受性试验：致癌潜力的筛查。注射部位的炎症反应提示刺激反应，但应认识到简单的注射创伤和/或配方中载体引起的特殊毒性效应可能也会导致注射部位的毒性变化。临床研究：I期临床试验：初步的临床药理学及人体安全性评价试验。以观察人体对于新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案提供依据。II期临床试验：随机盲法对照临床试验，治疗作用初步评价阶段。初步评价药物对目标适应症患者的治疗作用和安全性；为III期临床试验研究设计和给药剂量方案的确定提供依据。III期临床试验：治疗