无菌检查方法验证方案

1、安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案文件编号：QY-TS050000批准日期：年月日实施日期年月日安徽捷众生物化学有限公司文件审批表文件名称：无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案文件编号：QYTS05-007文件提出部门：质量控制部/QC文件起草目的：新订回修订匚文件起草人（签字）：完成日期：年月日文件会审部门文件审核人（签字）审核日期质量管理部年月日质量保证部/QA年月日质量控制部/QC年月日生产部年月日工程（设备）部年月日文件批准人（签字）：批准日期年月日文件实施日期：仝E月日起实施文件编制依据：1、卫生部：药品生产质量管理规范2010年修订版和修订附录2、中华人民共和

2、国药典（二部）2010年版附录。文件复制人：校对人：复制份数：复制日期：年月日颁发部门：质量管理部分发单位：备注：安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案目录1 .验证目的2 .验证频次3 .验证操作内容与要求3.1. 验证操作试验3.2. 验菌要求3.3. 验证方法步骤3.4. 验证准备3.5. 证试验操作4 .验证结果评价分析5 .附件安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案编RQY-TS05-0070页数共11页制定人制定日期年月日修订日期年月日审核人审核日期年月日颁发部门质量管理部批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门相关部门1.验证目的确认所采

3、用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。2 .验证频次2.1. 建立药品的无菌检查法时2.2. 修订检验方法时2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时3 .验证操作内容与要求：3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验：3.1.1. 对每一试验菌应逐一进行验证。3.1.2. 硫乙醇酸盐流体培养基一金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌。3.1.3. 改良马丁琼脂培养基一白色念珠菌、黑曲霉。3.2. 验菌要求：3.2.1. 验证试验所用的菌株传代次数不得

4、超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。3.2.2. 验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进行时，若验证试验失败，则供试品的无菌检查结果是不成立的3.3. 验证方法步骤：3.3.1. 验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照无菌检查方法（薄膜过滤法）进行平行试验，通过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）是否对产品有影响。3.3.2. 试验结果可接受标准用无菌标准评价方法”0.9%氯化钠注射液（三层共挤膜袋）的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%,试验组的回收率也不低于70

5、%03.4. 验证准备：准备验证所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备和菌种。3.4.1. .培养基硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基备注：3.4.1.1 培养基应注明来源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。3.4.1.2 配制后的培养基应按照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”项下检验无菌性和灵敏度。3.4.2. 仪器设备3.4.2.1 净化工作台3.4.2.2 生物洁净安全柜3.4.2.3 集菌仪3.4.2.4 生化培养箱3.4.2.5 霉菌培养箱3.4.2.6 高温试验箱3.4.2.7 台式灭菌器3.4.2.8 医药品冷藏柜3.4.2

6、.9 微波炉3.4.2.10 器具无菌培养皿：（直径90mm）无菌移液管（5ml）等备注：以上仪器设备需要确认与验证的均应已按要求验证。3.4.3. .菌种3.4.3.1 金黄色葡萄球菌CMCC(B)260033.4.3.2 枯草芽抱杆菌CMCC(B)635013.4.3.3 白色念珠菌CMCC(F)980013.4.3.4 黑曲霉CMCC(F)980033.4.3.5 铜绿假单胞菌CMCC(B)101043.4.3.6 生抱梭菌CMCC(B)649413.4.4. 操作环境：3.4.4.1 操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。3.4.4.2 环境洁净度不应低于C级，净化工作台洁净度为A级。3

7、.4.4.3 操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于10pa3.4.5. 试验样品：0.9%氯化钠注射液（三层共挤膜袋）规格：250ml批号：生产日期：批号：生产日期：批号：生产日期：3.4.6. 稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白冻缓冲液无菌十四烷酸异丙酯3.4.7. 验证用微生物名称及其编号3.4.7.1实验菌株的来源：厅P菌株名称菌株代码及编号内控编p1金黄色葡稳球菌CMCC(B)260032铜绿假单胞菌CMCC(B)101043枯草芽抱杆菌CMCC(B)635014白色念珠菌CMCC(F)980015生抱梭困CMCC(B)649416黑曲霉CMCC(F)980

8、033.4.7.2编号由菌名首字母一传代代数一制备日期组成3.4.8培养基名称生产商培养基批号配制日期后效期营养琼脂改良马丁琼月日A"L上3.5. 证试验操作：3.5.1. 试验菌的制备和稀释：3.5.1.1 将金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035c下培养1824小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，2328c下培养2448小时。3.5.1.2 将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在2328c下培养57天小时。3.5.1.3 将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。3.5.2. 用不同类别的微生物考察

9、供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组3.5.2.1 样品试验组：A准确取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。B然后加入45c的PH7.0无菌氯化钠-蛋白冻缓冲液100ml,振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1:10的供试液。C用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照平皿法测定其菌数。3.5.2.2 菌液组：按中国药典附录“无菌检查法”中“灵敏度检查”项下的菌液制备A在平皿中注入1m

10、l的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。B供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。C稀释剂对照组取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。D对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的试验人员的测定结果可能有很大的误差。所以在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。E当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体分散于稀释液中。F为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。G液体培养物直接稀

11、释法较比浊法造成误差小，基本保证每次菌数能控制在要求的范围内。I最终制得的菌悬液应为小于100CFU/ml。J金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌采用营养琼脂培养基；生抱梭菌采用血琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉采用改良马丁琼脂培养基。3.5.3. 培养将金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌在3050c下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在2328c下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。3.5.4. 试验结果3.5.4.1 稀释剂对照组菌的回收率接入菌种0.9%氯化钠注射液批号菌落计数（cfu/皿）回收率稀释剂对照组菌液组金黄色葡锢球平均值铜绿假单胞菌平均值枯草芽抱杆菌平均值白色念珠菌平

12、均值生抱梭困平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数+菌液组的平均菌落数X100%3.5.4.2 试验组的菌的回收率接入菌种0.9%氯化钠注射液批号菌落计数（cfu/皿）回收率试验组供试品对照组金黄色葡锢球平均值铜绿假单胞菌平均值枯草芽抱杆菌平均值白色念珠菌平均值生抱梭困平均值黑曲霉平均值表中：回收率=(试验组的平均菌落数一供试品对照组的平均菌落数的值)+菌液组的平均菌落数X100%04 .验证结果评价分析4.1. 对验证结果的评审应包括:（1） 验证试验是否有遗漏？（2） 验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准?(3)验证记录是否完整？（4） 验证试

13、验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明合理？是否需进步补充试验？4.5. .结果判断：？4.5.1.供试品按无菌检查法进行检查，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，结果判断验证无效，并重新进行方法验证。4.5.2如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量，增加培养基用量，使用中和剂或灭菌剂；更换滤膜品种等方法，并重新进行方法验证。5.附件附件1产品试验组的微生物生长检查记录：菌种名称产品试验组计数结果（cfu/皿）平均值金黄色葡锢球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌生抱梭困黑曲霉供试品对照组的微生物生长检查记录菌种名称供试品对照组计数结果（cfu/皿）平均值金

14、黄色葡锢球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌生抱梭困黑曲霉稀释剂照组的微生物生长检查记录菌种名称阳性对照计数结果（cfu/皿）平均值金黄色葡锢球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌生抱梭困黑曲霉菌液组菌种名称阳性对照计数结果（cfu/皿）平均值金黄色葡稳球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌白色念珠菌生抱梭困黑曲霉测试人/测试日期：复核人/复核日期:附件2安徽捷众生物化学有限公司质量控制检测仪器（设备）验证结果评价表验证名称无菌检查方法（溥膜过滤法）哈VF-PR-17-A验证方案验证结果评价及建议确认验证小组：年月日附件3安徽捷众生物化学有限公司质量控制检测仪器（设备）验证报告年月日至年月日，验证小组根据批准的编号为“VF-PR-17-A”的无菌检查方法（薄膜过滤法）验证文件对无菌检查方法（薄膜过滤法）检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明