次体外培养物的生长生物学

1、会计学1次体外培养物的生长生物学次体外培养物的生长生物学我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）应包括如下内容：应包括如下内容：1 1、培养目的：、培养目的：2 2、实验室条件：、实验室条件：已具备的条件；尚未具备的条件。已具备的条件；尚未具备的条件。3 3、培养方法：、培养方法： 1 1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液；）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液； 2 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 3 3）培养过程的观察注意事项；）培养过程的观察注意事项；4 4、目

2、的细胞的鉴定方法：、目的细胞的鉴定方法： 1 1）具体方法（可列）具体方法（可列1 13 3种）；种）； 2 2）应出现的结果：阳性；阴性。）应出现的结果：阳性；阴性。5 5、困难及解决办法：、困难及解决办法：本课程的作业及考核依据之一本课程的作业及考核依据之一注意事项：注意事项：1 1、作业上交时间及地点：、作业上交时间及地点： 时间：校历第时间：校历第1919周（周（2013.1.112013.1.11）前）前 地点：地点：104104馆三楼（组胚教研室）馆三楼（组胚教研室）我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）本课程的作业及考核依据之一本课程的作业及考核依据

3、之一注意事项：注意事项：2 2、作业必须标明下列项目：、作业必须标明下列项目：题题 目目学号学号 姓名姓名 专业专业 导师导师 我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）本课程的作业及考核依据之一本课程的作业及考核依据之一体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法六、培养物的观察检测

4、方法体外培养有机体的体外培养有机体的结构成分结构成分，其生长生物学特征具有两重，其生长生物学特征具有两重性：性：一方面，培养物取自于体内，它的一方面，培养物取自于体内，它的基本生物学特征仍与体基本生物学特征仍与体内的细胞相似内的细胞相似，乃所谓，乃所谓“万变不离其宗万变不离其宗”。另一方面，培养物在体外条件下生长，生长环境与体内相另一方面，培养物在体外条件下生长，生长环境与体内相比有很大差异，比有很大差异，尤其是失去了在体时有机体整体的生长调节机尤其是失去了在体时有机体整体的生长调节机制制，因而培养物的许多生长生物学行为将会发生改变，此即为，因而培养物的许多生长生物学行为将会发生改变，此即为“

5、入乡随俗入乡随俗”。分析和评价体外培养的结果需同时考虑到此两方面的特征分析和评价体外培养的结果需同时考虑到此两方面的特征，既不能生搬硬套，既不能生搬硬套在体细胞在体细胞的生物学规律，也的生物学规律，也不要完全否认不要完全否认培培养物的生长生物学行为与体内的一致性养物的生长生物学行为与体内的一致性。体外培养物的生长生物学体外培养物的生长生物学体外培养物的生长生物学体外培养物的生长生物学二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点三、影响动物细胞体外生长的因素三、影响动物细胞体外生长的因素一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细

6、胞培养物的生长类型按照体外培养的结构成分可将培养的类型分为按照体外培养的结构成分可将培养的类型分为组织培养组织培养、细胞培养、器官培养、细胞培养、器官培养以及以及整体培养整体培养等。等。下面讨论的主要是细胞培养时的情况。下面讨论的主要是细胞培养时的情况。体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为黏附型黏附型和和悬浮型悬浮型两大类。两大类。黏附型细胞黏附型细胞是必须附着在某一固相支持物表面才能生长是必须附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。的细胞。悬浮型细胞悬浮型细胞则是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮则是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长

7、的细胞。状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞绝大多数有机体细胞属于属于黏附型细胞黏附型细胞，只有，只有少数细胞类少数细胞类型型如某些肿瘤细胞和白细胞以及有些微生物可在悬浮状态下生如某些肿瘤细胞和白细胞以及有些微生物可在悬浮状态下生长。长。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞黏附黏附(adherence)(adherence)是大多数有机体细胞在体内生存和生长是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。发育的基本存在方式。黏附黏附有两方面含义：其一是细胞与细胞之间相互接触；有两方面含义：其一是细胞与细胞之间相互接触；其二是细胞与细胞外基质结合。其二是细胞与细胞外基质结合。当细胞被放到

8、体外环境中以后，需要黏附于某一固相表当细胞被放到体外环境中以后，需要黏附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于面才能生存和生长，因而属于黏附型细胞黏附型细胞。其中有一些细胞类型其中有一些细胞类型惟有惟有黏附于固相表面才能生存，这黏附于固相表面才能生存，这样的细胞被称为样的细胞被称为黏附（锚定或锚着）依赖型（性）细胞黏附（锚定或锚着）依赖型（性）细胞（anchorage-dependent cellanchorage-dependent cell）。）。一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型由于体内、外生长环境不同，故细胞在体内、外由于体内、外生长环境不同，故细胞在体内、外的黏

9、附方式也存在差异。的黏附方式也存在差异。在体内，细胞的黏附是全方位的，细胞的各个部在体内，细胞的黏附是全方位的，细胞的各个部分都与周围环境相接触，因而细胞外形具有分都与周围环境相接触，因而细胞外形具有复杂的立复杂的立体特征体特征。当细胞被转移到体外环境中之后，能够提供附着当细胞被转移到体外环境中之后，能够提供附着面的只有培养器皿的壁，大多数情况下，细胞只有一面的只有培养器皿的壁，大多数情况下，细胞只有一个附着平面，因而培养细胞的外形一般与在体时明显个附着平面，因而培养细胞的外形一般与在体时明显不同。不同。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型

10、按照培养细胞的主要形态，可将其分为几大类型：按照培养细胞的主要形态，可将其分为几大类型：上皮型细胞上皮型细胞成纤维细胞型细胞成纤维细胞型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型上皮型细胞：上皮型细胞： 体外培养中的体外培养中的上皮型细胞上皮型细胞泛指那些外形上类似上皮细泛指那些外形上类似上皮细胞，大体为扁平样的胞，大体为扁平样的多种多种培养细胞。培养细胞。这类培养细胞的这类培养细胞的主要形态学特征主要形态学特征是：是：扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，胞体近中扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，

11、胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现互拥挤而呈现“铺路石样铺路石样”，局部可构成单层的上皮样，局部可构成单层的上皮样“膜膜片组织片组织”。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型培养的上皮型细胞培养的上皮型细胞成纤维细胞型细胞：成纤维细胞型细胞：成纤维细胞型的细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，成纤维细胞型的细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，胞体大致呈梭形或

12、不规则形。胞体大致呈梭形或不规则形。这类培养细胞的这类培养细胞的主要形态学特征主要形态学特征是：是：细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，后两种情况细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，后两种情况下常具宽扁胞质突起（片状伪足）；胞质近中央处有椭圆形胞下常具宽扁胞质突起（片状伪足）；胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体一般铺展很开。多数情况下，细胞之间排列疏松，有核，胞体一般铺展很开。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状较大细胞间隙。有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式。、漩涡状等走行形式。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体

13、外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型培养的成纤维细胞型细胞培养的成纤维细胞型细胞游走型细胞：游走型细胞：体外培养中的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。体外培养中的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。其其形态学特征形态学特征是：是：细胞相互分散，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的细胞相互分散，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起（伪足）。吞噬性颗粒，常具有胞质突起（伪足）。这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，经常处于这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且

14、不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，不规则形态由宽多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样

15、不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。经胶质细胞。多形型细胞：多形型细胞： （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型培养中的星形胶质细胞培养中的星形胶质细胞（8d）星形胶质细胞星形胶质细胞培养中的星形胶质细胞培养中的星形胶质细胞（传（传1代）代）培养中的星形胶质细胞培养中的星形胶质细胞（传（传2代）代）星形胶质细胞（传星形胶质细胞（传3 3代）代）（GFAPGFAP标记免疫荧光）标记免疫荧光）上述四种形态学类型是培养细胞的常见形式，也是上述四种形态学类型是培养细胞的

16、常见形式，也是较为明显的几种形态学形式。较为明显的几种形态学形式。然而，许多情况下，所培养的细胞并不一定呈现典然而，许多情况下，所培养的细胞并不一定呈现典型的形态形式，而出现一些过渡形态。型的形态形式，而出现一些过渡形态。能够影响细胞形态学特征的能够影响细胞形态学特征的主要因素主要因素包括包括血清成分血清成分、培养液中的、培养液中的添加成分添加成分、培养液的、培养液的酸碱度酸碱度、气相环境气相环境、温度温度等条件。例如，许多已分化的细胞，在有血清的培等条件。例如，许多已分化的细胞，在有血清的培养液中生长或者在无血清培养液中生长，形态上就有差养液中生长或者在无血清培养液中生长，形态上就有差异。异

17、。 （一）黏附型细胞（一）黏附型细胞一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞培养物的生长类型 二、悬浮型细胞二、悬浮型细胞这类细胞的生命活动不需要固相支持物。其这类细胞的生命活动不需要固相支持物。其主要形态学特点主要形态学特点是是胞体始终为胞体始终为球形球形。能以悬浮状态生长的细胞，密度一般都可以较大，故培养的效率高。能以悬浮状态生长的细胞，密度一般都可以较大，故培养的效率高。以这种方式培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及收获细胞都比较容以这种方式培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及收获细胞都比较容易。易。不足之处是不方便观察。不足之处是不方便观察。一、体外细胞培养物的生长类型一、体外细胞

18、培养物的生长类型二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点体外培养物的细胞生物学特性与其在体内生长时到体外培养物的细胞生物学特性与其在体内生长时到底有哪些差别？这是运用体外培养这门技术研究生命科底有哪些差别？这是运用体外培养这门技术研究生命科学和从事生产实践活动首先要了解和掌握的问题。学和从事生产实践活动首先要了解和掌握的问题。（一）培养细胞分化状态的变化（一）培养细胞分化状态的变化（二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程（四）体外培养细胞的形态学（四）体外培养细胞的形态学（五）植块培养物的生长生物学（五）植块培

19、养物的生长生物学 （一）培养细胞分化状态的变化（一）培养细胞分化状态的变化由受精卵通过细胞增生与分化产生原始的胚层结构，由受精卵通过细胞增生与分化产生原始的胚层结构，再由后者进一步分化、发育和衍生出体内各种各样的细胞再由后者进一步分化、发育和衍生出体内各种各样的细胞及体内组织器官，这是脊椎动物胚胎发育的基本过程。及体内组织器官，这是脊椎动物胚胎发育的基本过程。在以后的生长发育过程中，体内每一个细胞都将始终在以后的生长发育过程中，体内每一个细胞都将始终受到三方面的影响与调节，即来自受到三方面的影响与调节，即来自体外环境体外环境的影响、的影响、体内体内神经一体液因素神经一体液因素的调节以及的调节以

20、及细胞与局部微环境细胞与局部微环境的相互作用的相互作用。这些因素控制着体内细胞的增殖活动、代谢和功能状态。这些因素控制着体内细胞的增殖活动、代谢和功能状态，维持着细胞的分化特征。，维持着细胞的分化特征。二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点当有机体的细胞被置于体外环境中培养时，主要的体当有机体的细胞被置于体外环境中培养时，主要的体内调节因素丧失，细胞所面临的基本生活环境就是培养液内调节因素丧失，细胞所面临的基本生活环境就是培养液以及大为减弱的相邻细胞间的相互作用。以及大为减弱的相邻细胞间的相互作用。失去了体内多方面调节因素的压力，细胞随即转向失去了体内多方面调节因素的压力

21、，细胞随即转向“自由自由”生长状态。生长状态。增殖约束逐渐取消，分化特征逐渐减弱，原本各种各增殖约束逐渐取消，分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性个性”，表，表现出某种趋同性，这种现象被称为现出某种趋同性，这种现象被称为去分化去分化或或脱分化脱分化（dedifferentiationdedifferentiation）。）。 （一）培养细胞分化状态的变化（一）培养细胞分化状态的变化二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点相反，低密度生长、低相反，低密度生长、低CaCa2+2+浓度（仅浓度（仅10010

22、0600 mol/L600 mol/L）以及有细胞生长因子的存在（如以及有细胞生长因子的存在（如表皮生长因子表皮生长因子、成纤维细胞生成纤维细胞生长因子长因子、血小板来源的生长因子血小板来源的生长因子等），有利于细胞增殖，不利等），有利于细胞增殖，不利于细胞分化。于细胞分化。根据实验目的的不同，有时为了防止培养细胞根据实验目的的不同，有时为了防止培养细胞“自主自主”去分化去分化，可以采取某些措施，如在培养时：，可以采取某些措施，如在培养时：* * 提高接种的细胞密度（高于提高接种的细胞密度（高于10105 5个个cmcm2 2）；）；* * 提高提高CaCa2+2+浓度（至浓度（至300300

23、1500 1500 mol/Lmol/L）；）；* * 使用诱导分化的激素与或生长因子。使用诱导分化的激素与或生长因子。 （一）培养细胞分化状态的变化（一）培养细胞分化状态的变化二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点 （二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力分裂增殖分裂增殖和和生长发育生长发育（后者包含分化）是体外培养细胞的（后者包含分化）是体外培养细胞的两大生命特征两大生命特征。大多数类型的有机体细胞在培养过程中能始终保持有丝分裂的能力。培大多数类型的有机体细胞在培养过程中能始终保持有丝分裂的能力。培养中的细胞只要生长空间许可，就会发生分裂增殖。只有当增殖生长至

24、相互紧养中的细胞只要生长空间许可，就会发生分裂增殖。只有当增殖生长至相互紧密接触成片时，便发生所谓的密接触成片时，便发生所谓的“接触抑制接触抑制”现象而停止增殖。现象而停止增殖。二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点体外培养的体外培养的人胚成纤维细胞人胚成纤维细胞可连续经历可连续经

25、历150150300300个个增殖周期，不间断地反复传代达增殖周期，不间断地反复传代达30305050代，最后衰老死亡代，最后衰老死亡，寿命约为一年。，寿命约为一年。 （二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力大多数分化程度较高的细胞，如大多数分化程度较高的细胞，如上皮源性的细胞上皮源性的细胞，在，在体外培养时仅能传代几次或体外培养时仅能传代几次或1010余次。其原因：余次。其原因：除了胚胎细除了胚胎细胞本身的生命力比成年组织细胞旺盛外，还有一个可能就胞本身的生命力比成年组织细胞旺盛外，还有一个可能就是，胚胎组织内存在分化水平较低的、可增殖的前体细胞是，胚胎组织内存在分化水平较低的、可增

26、殖的前体细胞或者胚胎干细胞。或者胚胎干细胞。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点 （二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力高度分化的高度分化的有丝分裂后细胞有丝分裂后细胞如如神经元神经元和和肌细胞肌细胞，体外，体外培养时的生长繁殖能力与其在体内时相似，除了来自早期培养时的生长繁殖能力与其在体内时相似，除了来自早期胚胎的材料尚能进行

27、很有限的数次分裂外，一般没有分裂胚胎的材料尚能进行很有限的数次分裂外，一般没有分裂增殖能力，体外培养这些细胞仅能表现一定程度的生长发增殖能力，体外培养这些细胞仅能表现一定程度的生长发育现象，通常不进行传代。育现象，通常不进行传代。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点 （二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力只有那些获得永生性（或称

28、不死性）的只有那些获得永生性（或称不死性）的肿瘤细胞肿瘤细胞才可才可以在体外几乎无期限地传代下去。以在体外几乎无期限地传代下去。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如：二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点 （二）培养细胞的增殖能力（二）培养细胞的增殖能力（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程从体外培养的总的过程来看，体外培养细胞的整个生命活动可分为三从体外培养

29、的总的过程来看，体外培养细胞的整个生命活动可分为三个时期：个时期：1 1、原（初）代培养期、原（初）代培养期2 2、传（继）代培养期、传（继）代培养期3 3、衰退期、衰退期二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点1 1、原代培养期、原代培养期原（初）代培养期是指从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传原（初）代培养期是指从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期。代之前的这一段时期。一般为一般为1 14 4周。周。由于体外培养中的由于体外培养中的“传代传代”并不与细胞周期的长短相关，并不与细胞周期的长短相关，传不传代传不传代及及何何时传代时传代与与原代培养原

30、代培养接种的细胞数量接种的细胞数量、培养瓶皿的大小培养瓶皿的大小以及以及培养条件培养条件密切相关，密切相关，在一定程度上具有可人为操作的特征。在一定程度上具有可人为操作的特征。（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点原代培养期内，培养物的细胞成分是混杂的，即呈原代培养期内，培养物的细胞成分是混杂的，即呈现现异质性异质性（heterogeneheterogene），除了目的细胞之外，接种的），除了目的细胞之外，接种的细胞悬液中的其它各种细胞都还存在。细胞悬液中的其它各种细胞都还存在。这一时期的细胞生长能力逐渐旺盛，细胞的

31、分裂活这一时期的细胞生长能力逐渐旺盛，细胞的分裂活动逐渐增强。由于分裂的次数还不多，细胞之间发生相动逐渐增强。由于分裂的次数还不多，细胞之间发生相互影响，尤其是可能导致细胞性状发生改变的影响（如互影响，尤其是可能导致细胞性状发生改变的影响（如细胞融合）还不大，细胞的结构和功能与体内仍很相似细胞融合）还不大，细胞的结构和功能与体内仍很相似，故原代培养期的故原代培养期的细胞最接近在体时的情况。细胞最接近在体时的情况。1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点原代培养期细胞的主要生长生物学行为包括

32、以下几个方面：原代培养期细胞的主要生长生物学行为包括以下几个方面：（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁（2 2）铺展）铺展（3 3）细胞运动）细胞运动（4 4）细胞分裂）细胞分裂1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁黏附于固相表面是黏附于固相表面是锚定依赖性细胞锚定依赖性细胞生命活动的基本要求生命活动的基本要求。分散生物体组织制成的细胞悬液，当被接种到培养器皿分散生物体组织制成的细胞悬液，当被接种到培养器皿内以后，首先要发生内以后，首先要发生黏附黏附(adhe

33、rence),(adherence),即细胞要黏着或结合即细胞要黏着或结合到生长基质表面上，这是细胞培养开始以后能否成功的第一到生长基质表面上，这是细胞培养开始以后能否成功的第一步。步。锚定依赖性细胞锚定依赖性细胞在解离成单个细胞悬液后耽搁得越久，在解离成单个细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化。越容易发生退化。1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点贴壁（贴壁（attachmentattachment）与与黏附黏附只是程度上的不同，没只是程度上的不同，没有截然的界限。有截然的界限。贴壁贴

34、壁可以理解为，培养细胞黏附以后更进一步地与可以理解为，培养细胞黏附以后更进一步地与生长表面结合的过程。生长表面结合的过程。黏附黏附的细胞可能通过少数接触点与生长表面结合，的细胞可能通过少数接触点与生长表面结合，而贴壁的细胞会以整个接触面与生长表面牢靠结合。而贴壁的细胞会以整个接触面与生长表面牢靠结合。（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点不同细胞的黏附能力不同。不同细胞的黏附能力不同。有些细胞如有些细胞如巨噬细胞巨噬细胞、成纤维细胞成纤维细胞的黏附能力强，

35、的黏附能力强，这些细胞被接种到培养器皿内以后，能在数分钟至数十这些细胞被接种到培养器皿内以后，能在数分钟至数十分钟内黏附到固相表面。分钟内黏附到固相表面。而有的细胞如而有的细胞如神经元细胞神经元细胞、羊水细胞，其黏附能力、羊水细胞，其黏附能力弱，当被接种到培养器皿内以后，需要数小时乃至更长弱，当被接种到培养器皿内以后，需要数小时乃至更长的时间才能黏附到固相表面。的时间才能黏附到固相表面。（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点降低培养液降低培养液的悬浮力的悬

36、浮力* *减少接种时细胞悬液的量，以减少接种时细胞悬液的量，以小量细胞悬液接种，使得细胞只小量细胞悬液接种，使得细胞只需下沉很短的距离即可触及生长需下沉很短的距离即可触及生长表面。待细胞黏附和贴壁之后，表面。待细胞黏附和贴壁之后，再补充足够的培养液。再补充足够的培养液。* *减少培养液中血清的含量使培减少培养液中血清的含量使培养液的黏度降低。养液的黏度降低。促进促进因素因素使用细胞外使用细胞外基质成分基质成分（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点培养液中的

37、离子成分及其浓度可影响细胞的黏附和贴壁（培养液培养液中的离子成分及其浓度可影响细胞的黏附和贴壁（培养液中的中的CaCa2+2+含量过低不利于细胞的黏附、贴壁和铺展）。含量过低不利于细胞的黏附、贴壁和铺展）。影响影响因素因素培养液的温度也会影响黏附和贴壁的速度（低温会减低细胞的培养液的温度也会影响黏附和贴壁的速度（低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁）。活动，妨碍黏附和贴壁）。（1 1）黏附与贴壁）黏附与贴壁1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（2 2）铺展）铺展铺展铺展（spreads

38、pread）是大多数培养细胞进行）是大多数培养细胞进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为生命活动的一种基本的生长特点或生长行为。对对锚定依赖性细胞锚定依赖性细胞来说，铺展状况将制来说，铺展状况将制约着细胞的分裂增殖活动。约着细胞的分裂增殖活动。1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点细胞的铺展状况可用两种参数描述：细胞的铺展状况可用两种参数描述：其一其一是培养细胞的是培养细胞的面积大小面积大小，这一参数可以在显微镜下直接用测微尺测，这一参数可以在显微镜下直接用测微尺测量；量；其二其二是

39、培养是培养细胞的高度细胞的高度，实际上就是细胞在垂直方向上的厚度（可以通，实际上就是细胞在垂直方向上的厚度（可以通过在显微镜下观察已发生铺展的细胞）。过在显微镜下观察已发生铺展的细胞）。（2 2）铺展）铺展1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点扁平的扁平的极性细胞极性细胞（polarized cellpolarized cell）放射状铺展细胞持续放射状铺展细胞持续0.5-2h0.5-2h便逐渐铺开伸展便逐渐铺开伸展铺展过程铺展过程细胞的细胞的形态变化形态变化细胞：圆形细胞：圆形细胞：圆

40、饼形细胞：圆饼形 称为称为放射状铺展细胞放射状铺展细胞（radial spread cell) radial spread cell) （2 2）铺展）铺展1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点极性细胞极性细胞就是各种有机体细胞在体外的特征性细就是各种有机体细胞在体外的特征性细胞形态，有的为梭形、有的为三角形、有的为其它不胞形态，有的为梭形、有的为三角形、有的为其它不规则形态等等。规则形态等等。培养细胞铺展以后的培养细胞铺展以后的极性细胞极性细胞形态不是固定不变形态不是固定不变的，相反，

41、会随着细胞的生命活动尤其是细胞运动而的，相反，会随着细胞的生命活动尤其是细胞运动而发生改变。发生改变。（2 2）铺展）铺展1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点铺展以后的细胞在相差显微镜下进行观察，细胞铺展以后的细胞在相差显微镜下进行观察，细胞轮廓清楚，胞核隐约可见，常可看到核仁。在每一个轮廓清楚，胞核隐约可见，常可看到核仁。在每一个细胞的周围，有一圈亮的光晕，称为细胞的周围，有一圈亮的光晕，称为生长晕（生长晕（growth growth hallowhallow）。）。这是细胞与周围生

42、长基质之间厚度不同而产生的这是细胞与周围生长基质之间厚度不同而产生的一种光学现象。一种光学现象。（2 2）铺展）铺展1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点海马神经元海马神经元（培养（培养7d7d）生长状况良好的细胞，细胞透亮匀质，生长晕明显。生长状况良好的细胞，细胞透亮匀质，生长晕明显。细胞生长状况不良时，细胞色暗、轮廓明显、反差增大，有时候胞质内出细胞生长状况不良时，细胞色暗、轮廓明显、反差增大，有时候胞质内出现小的颗粒结构和泡状结构，可能分别为变形的线粒体及液泡（溶酶体）。现小的颗粒

43、结构和泡状结构，可能分别为变形的线粒体及液泡（溶酶体）。（2 2）铺展）铺展1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（3 3）细胞运动）细胞运动原代培养期内，细胞常常会发生活跃的运动。有时原代培养期内，细胞常常会发生活跃的运动。有时候，甚至可从生长基质的某处迁移到另处。候，甚至可从生长基质的某处迁移到另处。细胞的运动与细胞质周边部分伸出的伪足有关，伪细胞的运动与细胞质周边部分伸出的伪足有关，伪足可分为丝状和片状两种。足可分为丝状和片状两种。这些伪足向外伸出后，在适当的生长基质部位停留这些伪

44、足向外伸出后，在适当的生长基质部位停留或者附着在某处，细胞体内部的微管和微丝重新排列，或者附着在某处，细胞体内部的微管和微丝重新排列，进一步引起胞质的流动。进一步引起胞质的流动。1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（4 4）细胞分裂）细胞分裂对大多数在体内可分裂的细胞来讲，体外培养时细对大多数在体内可分裂的细胞来讲，体外培养时细胞能否恢复分裂增殖活动、恢复得快慢以及分裂能力的胞能否恢复分裂增殖活动、恢复得快慢以及分裂能力的大小等关系到整个培养的效果。大小等关系到整个培养的效果。一般来说

45、，原代培养的细胞至少要渡过一般来说，原代培养的细胞至少要渡过242496h96h甚甚至更长的潜伏期，才能恢复分裂。至更长的潜伏期，才能恢复分裂。1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点* * 不同细胞分裂增殖活动恢复得快慢不同。不同细胞分裂增殖活动恢复得快慢不同。* * 肿瘤细胞比正常二倍体细胞恢复得快。肿瘤细胞比正常二倍体细胞恢复得快。* * 在体内原本增殖能力强的细胞恢复得快。在体内原本增殖能力强的细胞恢复得快。* * 原代培养时接种的细胞密度越大，潜伏期越原代培养时接种的细胞密度越大

46、，潜伏期越 短，细胞分裂增殖活动恢复得越快。短，细胞分裂增殖活动恢复得越快。* * 培养条件适宜、稳定，营养供应充足，细胞培养条件适宜、稳定，营养供应充足，细胞 分裂增殖活动恢复得快。分裂增殖活动恢复得快。（4 4）细胞分裂）细胞分裂1 1、原代培养期、原代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点2 2、传代培养期、传代培养期一旦原代培养物经过分割，重新接种到两个或两个以上一旦原代培养物经过分割，重新接种到两个或两个以上的器皿内进行培养，就标志着原代培养期结束，培养过程进入的器皿内进行培养，就标志着原代培养期结束

47、，培养过程进入了了传（继）代培养期传（继）代培养期。原则上，传代是以原代培养物贴壁生长，长满培养器皿原则上，传代是以原代培养物贴壁生长，长满培养器皿的生长面（器皿的底壁）或者在悬浮培养状态下细胞密度足够的生长面（器皿的底壁）或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行。但传代的具体时间并不是固定的，操作者可以根据大时进行。但传代的具体时间并不是固定的，操作者可以根据具体情况安排传代时间。具体情况安排传代时间。但是，提前或推后传代（尤其是后者）都不好。但是，提前或推后传代（尤其是后者）都不好。（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生

48、物学特点在这一时期内，在这一时期内，最主要的特征最主要的特征是细胞分裂增殖活动旺盛是细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。，细胞生长活跃。传代培养期并不单指原代培养物经首次传代后的传代培养期并不单指原代培养物经首次传代后的“第一第一代代”培养过程，而是指由首次传代开始经反复传代，一直到培养过程，而是指由首次传代开始经反复传代，一直到培养物开始衰退之前的全部时间。培养物开始衰退之前的全部时间。按照体外培养技术领域的传统概念，分离（散）细胞培按照体外培养技术领域的传统概念，分离（散）细胞培养物一旦经过传代即改称为养物一旦经过传代即改称为细胞系细胞系。细胞系可以继续传代。细胞系可以继续传代。因此，从培

49、养物的角度来讲，传代培养期就是维持细胞系增因此，从培养物的角度来讲，传代培养期就是维持细胞系增殖、生长的培养过程。殖、生长的培养过程。2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点传代培养期是整个培养过程的主要时期，此期具有以下特点：传代培养期是整个培养过程的主要时期，此期具有以下特点：持续时间长、细胞分裂增殖活动旺盛以及细胞生长活跃。持续时间长、细胞分裂增殖活动旺盛以及细胞生长活跃。在传代培养期内，细胞逐渐进入在传代培养期内，细胞逐渐进入去分化去分化状态。原本成分混杂的培养物中状态。原本成分混

50、杂的培养物中，某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势，比例越来越大，而将其它数量较，某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势，比例越来越大，而将其它数量较少、比例较小的细胞逐渐淘汰掉。少、比例较小的细胞逐渐淘汰掉。2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点在传代培养期内，需要进行多次的传代。在传代培养期内，需要进行多次的传代。在每一次人为的传代培养过程中，培养物将首先被蛋白酶消化而被制备成细在每一次人为的传代培养过程中，培养物将首先被蛋白酶消化而被制备成细胞悬液，再用于种植。种植后的细胞都要经

51、历相似的恢复和生长过程。胞悬液，再用于种植。种植后的细胞都要经历相似的恢复和生长过程。根据每一次传代培养的细胞生长变化的过程，习惯上把每一代细胞的生长过根据每一次传代培养的细胞生长变化的过程，习惯上把每一代细胞的生长过程分为程分为潜伏期、指数生长期潜伏期、指数生长期和和停滞期停滞期三个阶段。三个阶段。2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（1 1）潜伏期）潜伏期(latent phase)(latent phase)即细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期。这即细胞对传代

52、操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期。这也是原代培养开始时细胞必须经历的时期。也是原代培养开始时细胞必须经历的时期。2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点不论是原代培养前从生物体组织分离（散）制备细胞悬不论是原代培养前从生物体组织分离（散）制备细胞悬液，还是在进行传代操作时，都要使用蛋白酶消化或其它生物液，还是在进行传代操作时，都要使用蛋白酶消化或其它生物化学试剂，使细胞表面与其它细胞以及支持物黏附与连接的分化学试剂，使细胞表面与其它细胞以及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到

53、损伤，分散的细胞悬液，全部细胞变为圆子被破坏，细胞受到损伤，分散的细胞悬液，全部细胞变为圆球形。球形。接种到培养器皿内以后，细胞开始经历与原代培养期内接种到培养器皿内以后，细胞开始经历与原代培养期内相似的黏附、贴壁、铺展等过程。修复损伤，相似的黏附、贴壁、铺展等过程。修复损伤，“熟悉熟悉”环境，环境，恢复生长，但很少分裂。恢复生长，但很少分裂。（1 1）潜伏期）潜伏期(latent phase)(latent phase)2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点潜伏期的长短与潜伏期的长短与

54、细胞种类细胞种类、接种的、接种的细胞密度细胞密度、培养条件培养条件等等因素均有关。接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容因素均有关。接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短，相反，即便是在很小的培养空易适应体外环境，潜伏期就短，相反，即便是在很小的培养空间内，如果接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。间内，如果接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。传代培养细胞的潜伏期要比原代培养的细胞短。传代培养传代培养细胞的潜伏期要比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞，潜伏期一般为期期的细胞，潜伏期一般为期6 624 h24 h。当细胞开始分裂，意味着细胞已完全恢复生长状态，

55、潜伏当细胞开始分裂，意味着细胞已完全恢复生长状态，潜伏期结束。期结束。（1 1）潜伏期）潜伏期(latent phase)(latent phase)2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点（2 2）指数生长期）指数生长期( (或称或称对数对数生长期生长期logarithmic logarithmic growth phasegrowth phase）它是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的它是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数量呈指数增长。细胞数量呈指数增长。指数

56、生长期内细胞分裂活动的程度（即增殖活性）可以指数生长期内细胞分裂活动的程度（即增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。常以常以有丝分裂指数有丝分裂指数（mitotic indexmitotic index，MIMI）、）、细胞群体细胞群体倍增倍增时间来表示。时间来表示。MIMI是指培养物中分裂相数量占全部细胞数是指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比。量的百分比。2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点细胞的增殖活性与细胞种类、供体年龄以及

57、培养条件等多细胞的增殖活性与细胞种类、供体年龄以及培养条件等多种因素密切相关。种因素密切相关。一般细胞的一般细胞的MIMI约为约为0.1%0.1%0.5%0.5%。原代培养物的。原代培养物的MIMI比继代培比继代培养物的养物的MIMI低。连续细胞系和肿瘤细胞的低。连续细胞系和肿瘤细胞的MIMI较高，可达较高，可达3%3%5%5%。在接种的细胞数量适中、培养条件适宜的情况下，指数生在接种的细胞数量适中、培养条件适宜的情况下，指数生长期一般持续长期一般持续3 35d5d，细胞即可长满培养器皿，相互汇合成片。，细胞即可长满培养器皿，相互汇合成片。（2 2）指数生长期）指数生长期( (或称或称对数对数

58、生长期生长期logarithmic logarithmic growth phasegrowth phase）2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点如果培养的是正常有机体细胞（非转化细胞），当细如果培养的是正常有机体细胞（非转化细胞），当细胞相互接触连接成片时，细胞便不再运动，表现出由于接触胞相互接触连接成片时，细胞便不再运动，表现出由于接触而相互抑制的特征，此即为而相互抑制的特征，此即为接触抑制接触抑制。细胞在发生接触抑制以后，虽然运动受到抑制，但只细胞在发生接触抑制以后，虽然运动受到

59、抑制，但只要营养成分充足，仍然可进行短期的分裂增殖。要营养成分充足，仍然可进行短期的分裂增殖。只有当细胞密度增大到一定程度，相互拥挤或挤压而只有当细胞密度增大到一定程度，相互拥挤或挤压而致铺展程度降低细胞变高（厚），使得致铺展程度降低细胞变高（厚），使得DNADNA合成受到限制时合成受到限制时，细胞便不再分裂增殖。，细胞便不再分裂增殖。（2 2）指数生长期）指数生长期( (或称或称对数对数生长期生长期logarithmic logarithmic growth phasegrowth phase）2 2、传代培养期、传代培养期（三）体外培养细胞的生长过程（三）体外培养细胞的生长过程二、体外培养

60、物的细胞二、体外培养物的细胞生物学特点生物学特点肿瘤细胞没有接触抑制现象。肿瘤细胞没有接触抑制现象。没有接触抑制特征的恶性细胞即便是发生相互接触，但没有接触抑制特征的恶性细胞即便是发生相互接触，但仍然可以运动和增殖，于是会在所形成的单层细胞层上继续仍然可以运动和增殖，于是会在所形成的单层细胞层上继续堆叠。堆叠。由于细胞密度增大而致的分裂抑制现象被称为由于细胞密度增大而致的分裂抑制现象被称为密度依赖密度依赖性细胞生长抑制性细胞生长抑制。（2 2）指数生长期）指数生长期( (或称或称对数对数生长期生长期logarithmic logarithmic growth phasegrowth phase