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1、Chignolin蛋白的高压变性研究（题目：小二号黑体加黑）王贞营（姓名：小四黑体）(德州学院物理系，山东德州253023)（院系：五号黑体）摘 要 随着计算机模拟技术的发展，本文利用GROMACS软件，对Chignolin在2000bar和10000bar两个压强下进行的独立的分子动力学模拟，以揭示压强对蛋白质去折叠（变性）的影响并探讨其机理。通过分析模拟结果发现：Chignolin蛋白在高温下RMSD最大时去折叠程度明显不同;小蛋白随着压强的增加其折叠与去折叠过程有一个反复阶段;高压下的蛋白质去折叠不是完全折叠;高压对Chignolin的构象影响较大，变性明显，甚至出现了完全去折叠的情况。

2、关键词 Chignolin; 分子动力学模拟； 去折叠； 高压（“摘要”和“关键词”字样用五号黑体字，后空一格用五号宋体字单倍行距打印摘要内容，“摘要”两字中间空两空格，关键词用五号宋体，每个关键词后用“；”再空两格。摘要内容在200-300字之间，不分段。） 绪论（一级标题：小三号黑体，顶格写）（正文部分均用小四号宋体，1.5倍行距）蛋白质是一切生命活动的主要物质基础，结构决定其功能。蛋白质折叠和去折叠问题是当前生物信息学、生物物理学等生命科学领域面临的一项长期而具有极其重要地位的课题。其重要任务之一便是通过施加外界驱动力（如温度，压强，机械力等）来致使蛋白质变性，通过研究其去折叠过程探索蛋

3、白质的折叠和去折叠机制。近年来随着实验手段和计算机水平的不断提高，许多实验仪器和理论方法被用来研究蛋白质的折叠和去折叠过程。从实验上研究蛋白质高压去折叠存在着各种问题,如时间周期长，设备复杂、昂贵；且技术难度大等，无法在原子层次和飞秒分辨率下进行研究。用计算机模拟的理论方法研究蛋白质的高压去折叠是实验研究的有利补充，可以在原子层次和很高的时间分辨率上研究实验无法实现的新现象，对实验研究有重要的指导作用。分子动力学模拟可以从原子水平和飞秒分辨率上研究蛋白质的高压去折叠，这一点目前实验上无法实现。目前对蛋白质折叠的研究采取的策略之一就是用加速去折叠过程来研究蛋白质的折叠问题。蛋白质去折叠可以通过诱

4、导变性条件加速其进程，这样可以对蛋白质构象膨胀的早期阶段进行观察，而这种过程在一定程度上反映了蛋白质的折叠过程1 。蛋白质高压去折叠（变性）的研究是当今蛋白质工程中还未完全解决的一项重要内容。对温度导致去折叠过程已经进行了广泛的研究,而对压强导致蛋白质去折叠（变性）的研究相对较少，仅做了少量的模拟研究1。上角标1：表示参考文献，要求与后面参考文献标号一一对应，正文中的参考文献按照先后顺序从1、22蛋白质和分子动力学模拟原理21 蛋白质（二级标题：四号黑体，顶格写） 蛋白质是一类重要的生物大分子，在体内占有特殊的地位，是生命活动的主要承担者，是生命现象的主要物质基础。它是由一系列-氨基酸通过缩水

5、过程而聚合成一种线性的高分子物质。作为构成蛋白质的基本单元，自然界共有20种-氨基酸。它们具有相似的结构特征，差别在于连接在残基原子上的侧链R的不同。不同的侧链形成各种氨基酸各种不同的理化特性。根据它们在水溶液中的表现，可分为疏水性氨基酸和亲水性氨基酸。为了表达蛋白质的不同组织层次，经常使用一级结构和空间结构（二、三、四级结构）等术语对其分子结构进行阐述。 从能量的角度看，蛋白质系统有很多自由度，其能量曲面可看作是高维的曲面。蛋白质折叠的过程可看作是顺着折叠漏斗发生的过程。折叠被看成一个链状分子系统的平行流的过程，就像很多溪水从具有复杂地形结构的山坡上流下，而不仅仅是一条溪水从单一山谷中流下。

6、图2-1 具有高低起伏的能量面（图标：五号宋体）（所有图标的标注以章节为基础，如图2-1、2-2、；3-1、3-2、）研究蛋白质的折叠过程，对于了解蛋白质的折叠机制，理解蛋白质的快速折叠的来源，都是必不可少的一个方面。我们通过一个简化的统计模型中勾画出折叠过程的简单图像，通过引入短程相关的协作性特征，在一定程度上刻画了蛋白质动力学对折叠结构的依赖性；并根据统计物理的方法讨论了复温度场中体系的配分函数的零点，并由此分析了体系相变的特征，这不仅重新检验了原有理论，为其提供了理论上的可靠性，而且提供了一条途径，对蛋白质的折叠转变的热力学性质进行更为细致的刻画，为不同模型之间的比较提供了有益的参考。2

7、2 分子动力学（MD） 生物大分子的分子动力学模拟方法，无论是在模拟算法和力场参数，还是在模拟体系的大小，模拟时间的长短上，都取得了巨大的进步。这些进步使得计算机模拟技术成为了除X射线晶体学方法和核磁共振波谱学方法外又一个研究蛋白质结构和功能关系的重要工具。通过对生物大分子的模拟，一方面我们可以从原子水平上解释实验现象和结果，另一方面我们可以得到一般实验无法获得的微观信息。在分子动力学模拟中，我们把每个原子看作一个粒子，对于一个含有N个粒子的体系，我们把第i个粒子的质量记为Mi，它的空间位置计作矢量ri，而空间坐标的一级和二级导数我们用和来表示。根据牛顿第二定律： （2.2）（重要公式的标注：

8、同图标，以章节为基础，如：2.1、2.1、等）这里的是所有其它粒子作用到粒子i 上的合力，这可以由N个粒子的位能函数V的负梯度表示，即： （2.3）在笛卡尔座标中，可以用它的3个分量来表示。若Xi(t)是时刻t粒子i在x方向的座标。使用泰勒（Taylor）展开，我们可以得到：（2.4）（2.5）其中和分别表示t时刻粒子i在方向的速度和加速度。上述两式的方程是精确的，但是含有无限项。在实际中我们通常用Verlet方法进行近似求解。方法如下：将2.4和2.5两式分别相加和相减得到：（2.6）其中：（2.7）由于在t和t-t时刻，第i个粒子位置是知道的，加速度可以从位能函数的负梯度求出。所以以后任何

9、时刻粒子的位置，速度和加速度都可迭代求解。这就是计算牛顿运动方程的Verlet方法3。23 经验力场和位能函数 分子动力学模拟方法是把分子体系看作在势能面中质点的运动4。为了便于描述往往选用某些与原子座标相关的函数对势能面进行拟合，得到势能面的近似解析表示。这种势均力敌能面的表示方法称为力场（force field）,而这和与坐标相关的函数称为位能函数。 近10多年来已发展了多种力场，它们基本形式是相似的，只是在能量函数各项的选取和参量化上有差别。其中常用的有AMBER CHARMM GROMOS 和CVFF等力场。2.3.1 能量优化（三级标题：小四黑体，前面空两空格（一个汉字字符）分子动力

10、学模拟与能量优化是紧密相关的，但又是存在明显差别的两种方法。两者紧密的联系是都使用相同的力场和位能函数，因而在程序化时，他们有大量相同的子程序。两者最大的差别是与时间的关联上。分子动力学模拟考虑体系结构与能量的时间演化，而能量优化则只是搜寻构象空间的某个静态点，在这一点上作用在每个原子上的力都达到平衡，因而体系是稳定的。能量优化得到的构象仅是体系的局域极小构象。尽管能量优化不能给出构象演化的信息和体系的总体能量极小构象，但它可以用于优化X射线晶体学，多维NMR波谱学方法所测定的实际验结构；它还可以用于研究生物大分子的局域构象（如loop区等）；可以分析配体与受体的对接（docking）过程；可

11、以为分子动力学模拟准备初始构象，等等5,6。3 Chignolin小蛋白的去折叠研究3. 1 分子动力学模拟的准备工作本实验就是利用GROMACS这一软件对Chignolin小蛋白进行高压去折叠研究。本实验的工作平台是Linux。Linux系统作为GROMACS程序软件包的工作平台，分子动力学模拟的前期准备工作是做好本次模拟实验至关重要的一个环节，其步骤如下：1、对pdb文件的转换先将pdb文件转化为GROMACS文件（*,gro）。Pdb文件中的原始数据经常不完全，与碳原子相连的氢原子常常会漏掉。转换工具pdb2gmx检查结构文件中每一个残基并补充上所有缺失的氢原子。在转换过程中它同时会生成

12、一个拓扑文件以记录原子间的相互作用。在此过程中我们使用的是gromos9643a1力场（标准力场）。2、盒子的生成在模拟过程中我们要将蛋白质置于含水的环境中。首先我们确定盒子的大小要适中，然后在盒子中加满水。这两个步骤分别是由Editconf和Genbox两个子程序来完成。3、能量极小化能量极小化是由分子动力学程序mdrun来进行的。它的目的是用来除去蛋白质中的氢原子产生的内力，以及结构过于紧密而导致的不正确的范德华力。Mdrun只输入一个grompp结合拓扑文件（.top）、结构文件（.gro）和参量文件（minim.mdp）而生成的轨迹文件（.tpr）。3. 2 Chignolin蛋白的系

13、统参数设置3.2.1 Chignolin小蛋白以人工设计的最小蛋白质Chignolin（PDB代码为1uao）为研究对象 。Chignolin是最近人工合成的迄今为止最小的蛋白，仅有十个残基（GYDCPETGTWG），它的晶体结构是由两个片组成的发卡（图1），是蛋白质折叠/去折叠研究很好的模板，目前国内外还尚未见有关chignolin高压去折叠的有关报道。本文用充分含水模型对该蛋白在300K下，高压影响去折叠过程进行研究，揭示压强对蛋白质去折叠（变性）的影响并探讨其机理。3.2.2 系统参数的设置1、系统大小系统大小由程序editconf决定并将信息通过一个.out文件输出。本次模拟将蛋白质与

14、盒子边沿距离设定为1.0nm，最终系统大小为3.95nm,3.72nm和3.11nm，系统体积为45.91nm。2、系统的组成由editconf生成的盒子限制了系统的大小后，经过genbox填充了系统中未被蛋白质分子占据的空间，可以从拓扑文件(.top)看出在这个过程中加入了1764个水分子。 由输出的结果可以看出，系统中共有20个氨基酸残基和1764个其它原子团，非氨基酸残基原子团的数目恰好与拓扑文件中的水分子数目相等。在此之后，要对系统的典型进行中和，本次模拟是在系统中加入2个钠离子，同时去掉一个水分子，最终系统有10个氨基酸、718个水分子和2个钠离子组成。由于水的压缩性系数随着压强的升

15、高而改变，在模拟中我们充分考虑了各高压下压缩性系数的改变情况（见表3-1）。表3-1 不同压强下的压缩性系数值（表头：五号宋体，居中，其标注同图标，以章节为基础编号）Pressure (bar)Compressibility (bar-1)145.610-620003510-61000010.510-6 3. 3 实验结果分析基于上述2000bar和10000bar两个压强下进行的独立的分子动力学模拟，通过分析模拟结果发现，高压对chignolin的构象影响较大，变性明显，甚至出现了完全去折叠的情况。进一步研究蛋白质与周围水分子的作用情况发现，水分子对chignolin的去折叠有着重要作用。

16、图2给出了Chignolin在高压2000bar和10000bar时的RMSD（root mean square deviations）和Rg(radius of gyration)随时间变化图。由图2a可见，在2000bar时，Chignolin的RMSD在前5ns急剧增加，一致到13ns相对平稳，在13ns达到第一个极大值，然后又一直到20ns平稳上升，20ns左右急剧增加，达到极大值，此后出现剧烈震动，在30ns附近达到最大值，此时RMSD最大值为0.8（angstrom），图3a给出了此时的构象快照，可见此时Chignolin已经完全去折叠。在10000bar时，从图2a可以看出，RM

17、SD在前3ns一直上升，3ns后经过一段时间的回落以后又持续上升在35ns附近到达最大值，由图3b给出的在10000bar时Chignolin的构象快照可见，在35.3ns小蛋白已经完全去折叠。4 结论图2是高压影响下小蛋白去折叠的RMSD和Rg随时间变化图，由图中可以发现，chignonlin在高压影响下产生了比较明显的变性，同时由图2-a和图2-b也可以看出，两个压强时RMSD和Rg变化趋势较一致。图3的结构图表明，小蛋白chignonlin在高压下达到了完全去折叠。由于技术条件和其它因素的限制，对高压诱导变性的研究相对较少，本论文研究的高压诱导chignolin变性首次发现了小蛋白出现完

18、全去折叠，这是原来没有发现的，但蛋白质折叠机制是一个长期而复杂的课题，要解释其机理还需要理论学家和实验学家共同努力。希望我们的工作能为相关研究提供有用的理论依据。参考文献（“参考文献”字样要求同一级标题，）文献标号以方括号加阿拉伯数字，后空一格，文献正文部分为五号字。参考文献不能少于15篇，其中至少三篇外文文献，15篇文献中要求有至少五篇近三年的参考文献。1 阎隆飞，孙之荣主编.蛋白质分子结构.北京: 清华大学出版社,1999:250-2562 赵南明，周海梦主编. 生物物理学.北京:高等教育出版社,2000:3-53 王骏.蛋白质折叠和蛋白质组成复杂性简化的研究:博士论文,南京:南京大学物理

19、系 ,2001:4-64 赵立岭.蛋白质折叠的计算机模拟:硕士论文 ,德州:德州学院生物物理研究所,2005:1-25 王恒粱,谭天伟.蛋白质生物化学与生物技术.北京:化学工业出版社,2001,12-146 梁毅. 结构生物学.北京:科学出版社,2005:157 7 何忠效.生物化学实验技术.北京:科学出版社,2003:167 8 Jihua Wang,Zhiyong Zhong, Haiyan Liu, Yunyu Shi.Quasiequilibrium unfolding thermodynamics of a small protein studied by molecular dyn

20、amics simulation with an explicit water model. PHYSICAL REVIEW,2003:E67,316-3229 Liewei Wang, Tien V. Nguyen, Richard W. McLaughlin, Human thiopurine S-methyltransferase pharmacogenetics: Variant allozyme misfolding and aggresome formation . PNAS. originally published online Jun 20, 2005; 102;9394-9

21、399;10 Ida Berglin Enquist, Eva Nilsson, Andreas Ooka, Effective cell and gene therapy in a murine model of Gaucher disease . PNAS .originally published online Sep 5, 2006; 006;103;13819-13824;11 John R. Duguid, Craig W. Bohmont, Changes in Brain Gene Expression Shared by Scrapie and Alzheimer Disea

22、se . PNAS.1989;86;7260-7264 （英文摘要和关键词（Abstract、Keywords）为12磅加粗Times New Roman字,其余为12磅Times New Roman字。）Study of High Pressure Induced Denaturation of Miniprotein Chinolin （18磅Times New Roman字加粗）Wang Zhenying(Department of Physics ,Dezhou University,Dezhou,253023)Abstract Along with the computer simu

23、lation technology development, in this paper the computer simulation of Chignolin protein unfolding is made by GROMACS in 2000bar and 10000 bar two intensities of pressure, promulgates the intensity of pressure folds (denaturation) to the protein the influence and discusses its mechanism. Discovered through the analysis analogue result that ,Chignolin protein when high temperature RMSD biggest obviously folds the de