生物化学第9章 酶的作用机制和酶活性调节

1、第第9 9章章 酶的作用机制和酶酶的作用机制和酶的调节的调节主要内容主要内容n酶的活性部位及其确定方法酶的活性部位及其确定方法n酶促反应机制酶促反应机制n酶活性的别构调节酶活性的别构调节n酶活性的共价调节酶活性的共价调节n同工酶同工酶11.1、酶的活性部位酶的活性部位（一）基本概念：（一）基本概念：酶的活性中心（酶的活性中心（active centeractive center）是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是一级结构相隔很远，而三维结构比较靠近常是一级结构相隔很远，而三维结构比较靠近的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心的氨基酸残基形成的

2、三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位和催化部位。包括两个功能部位：结合部位和催化部位。1 1结合部位（结合部位（ Binding siteBinding site） 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。合部位。此部位决定酶的专一性。2 2催化部位（催化部位（ catalytic site catalytic site ） 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。此部位决定酶所催化反应的性质。（二）酶活性部位的特点（二）酶活性部

3、位的特点1.1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的往只占整个酶分子体积的1%-2%1%-2%。2.2.酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。结构。 3.3.酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催

4、化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（这个动态辨认过程称为诱导契合（induced-fit）.4.4.酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（隙（crevicecrevice）内）内. .裂隙内是一个相当疏裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。水的环境，从而有利于同底物的结合。5.5.底物靠次级键较弱的力与酶结合。底物靠次级键较弱的力与酶结合。6.6.酶的活性部位具有柔性和可运动性酶的活性部位具有柔性和可运动性课下习题：课下习题：如何确定酶的活性部位？如何确定酶的活性部位？11

5、.2、酶促反应机制酶促反应中发生的最本质变化是什么？（一）基元催化的分子机制n酶是最复杂的催化剂，它的催化作用包括若干基元催化。n基元催化是由某些基团或小分子催化反应的，包括酸碱催化、共价催化、和金属离子催化等。n这些小分子催化剂或催化基团不是亲电体（eletrophilic group）就是亲核体(nucleophilic group)，它们是电荷极化的结果。蛋白质的水解酸碱催化与共价催化生物体内每时每刻都在发生着蛋白质的水解反应但是，生理pH下，没有催化剂时，肽键极难水解。（为什么？）v酰胺氮上的孤对电子与酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间具有共振相邻羰基之间具有共振作用，形成共振杂化体，作

6、用，形成共振杂化体，阻止了水对羰基的亲核阻止了水对羰基的亲核进攻。进攻。v从化学的角度，如何帮从化学的角度，如何帮助水实现对羰基的亲核助水实现对羰基的亲核进攻？进攻？1 1、酸碱催化（、酸碱催化（acid-base catalysisacid-base catalysis）n酸酸- -碱催化可分为狭义的酸碱催化可分为狭义的酸- -碱催化和广义的碱催化和广义的酸酸- -碱催化。酶参与的酸碱催化。酶参与的酸- -碱催化反应一般都碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。是广义的酸碱催化方式。n广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子子, ,或是通过质子碱接受部分质子的

7、作用，以或是通过质子碱接受部分质子的作用，以稳定过渡态，达到降低反应活化能的一种催稳定过渡态，达到降低反应活化能的一种催化机制化机制。酶分子中可作为酸碱催化的功能基团酶分子中可作为酸碱催化的功能基团n影响酸碱催化反应的因素包括酸碱强度及质子影响酸碱催化反应的因素包括酸碱强度及质子传递的速率。传递的速率。nHisHis咪唑基的解离常数约咪唑基的解离常数约6.06.0，咪唑基解离下来，咪唑基解离下来的质子浓度与水中的的质子浓度与水中的HH+ + 相近，在中性条件下，相近，在中性条件下，一半以酸形式存在，一半以碱形式存在一半以酸形式存在，一半以碱形式存在; ;同时，同时，咪唑基接受质子和供出质子的速

8、率十分迅速，咪唑基接受质子和供出质子的速率十分迅速，半衰期小于半衰期小于1010-10-10秒。秒。n所以，所以，HisHis是酶中最有效最活泼的一个催化功是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。能基团。2、共价催化（Covalent catalysis）n共价催化包括亲核催化和亲电催化。但由于参与共价催化的主要是亲核基团，所以共价催化也称为亲核催化。胰凝乳蛋白酶的Asp102、His57、Ser195组成了催化三联体结构（ the catalytic triad ）通过Asp102、His57、Ser195组成的质子传递链，使Ser195失去质子，生成强亲核基团-O-底物结合(step 1),

9、 S195羟基对底物羰基碳发动亲核进攻。 (step 2). 底物羰基氧附近的酰胺区域可以稳定氧负离子氧离子洞在His57帮助下，H2O对酯基的羰基碳发动亲核进攻。同样通过四面体中间体，生成羧基，离开活性中心。胰凝乳蛋白酶催化蛋白质的水解n丝氨酸蛋丝氨酸蛋白酶的催白酶的催化机制化机制n共价催化是由亲核催化剂加速反应的，催化剂向反应物的亲电中心提供电子，形成共价配位键，并产生一个不稳定的共价中间物。n中间物的反应性比原来的反应物更大，将受到第二底物，如H2O分子进攻，生成最终产物应用举例：有机磷杀虫剂3 3、金属离子催化、金属离子催化）需要金属的酶分类：）需要金属的酶分类：（1 1）金属酶）金属

10、酶metalloenzyme:metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。含紧密结合的金属离子。如如FeFe2+2+、FeFe3+3+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+、MnMn2+2+（2 2）金属）金属- -激活酶（激活酶（metal-activated enzymemetal-activated enzyme）: :含含松散结合的金属离子，如松散结合的金属离子，如NaNa+ + K K+ + MgMg2+ 2+ CaCa2+2+2 2）金属离子的催化作用）金属离子的催化作用：n通过结合底物为反应定向。通过结合底物为反应定向。n通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。通过可

11、逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。n通过静电稳定或屏蔽静电荷。通过静电稳定或屏蔽静电荷。金属离子催化的例证：烯醇化酶（二）酶具有高催化能力的原因（二）酶具有高催化能力的原因1 1、底物和酶的邻近效应（、底物和酶的邻近效应（approximationapproximation）与定向）与定向效应（效应（orientationorientation）n在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的

12、效应叫做心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做邻近效应。邻近效应。n定向效应：定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。使酶具有高效率和专一性特点。咪唑催化对咪唑催化对- -硝基苯酚乙酸酯的水解反应硝基苯酚乙酸酯

13、的水解反应CH3COONO2NNH.NNHCOCH3+O-NO2+NNHCOONO2.ONNH+O-NO2+实验结果表明，分子内咪唑基参与的水解反应实验结果表明，分子内咪唑基参与的水解反应速度比相应的分子间反应速度大速度比相应的分子间反应速度大 24 24 倍。说明倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。很大的影响。轨道定向轨道定向(orbital-steering)(orbital-steering)假说示意假说示意图图Rate enhancement by entropy reduction. Shown here are rea

14、ctions of an ester with a carboxylate group to form an anhydride.The R group is the same in each case.2、诱导契合（、诱导契合（induced fit）和底物）和底物的形变（的形变（distortion）n酶酶- -底物复合物形成时，酶分子构象发生底物复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲

15、，有助于过度态的中间产物产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成形成, ,从而降低了反应的活化能。从而降低了反应的活化能。诱导契合模型与底物的形变诱导契合模型与底物的形变n第第4 4个糖残基个糖残基D D环因空间原因环因空间原因必须由正常的必须由正常的椅式变形为能椅式变形为能量较高的半椅量较高的半椅式构象。因此式构象。因此糖苷键的稳定糖苷键的稳定性降低，键容性降低，键容易从此断裂。易从此断裂。3、电荷极化和多元催化n酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”，催化肽键水解；核糖核酸酶催化水解时，His12起广义碱催化作用，接受一个质子，

16、而His119起广义酸作用，和磷酸的氧原子形成氢键。4、疏水微环境影响 n酶促反应在酶表面的疏水裂缝（活性中心）中进行，如同在有机溶剂中反应。疏水环境中介电常数比在水中低，两个电荷之间的作用力显著的增强，亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu35的羧基在非极性区，催化功能增速3106倍。 n酶的微环境还创造了溶液中不可能达到的条件，如同时存在高浓度的酸碱。四、酶活性的别构调节四、酶活性的别构调节n生物体内酶催化反应的调节可以通过生物体内酶催化反应的调节可以通过改改变酶结构、结合激促蛋白质或抑制蛋白变酶结构、结合激促蛋白质或抑制蛋白质质而使其催化活性发生改变，也可以通而使其催化活性发生改变，也可以

17、通过过改变酶含量改变酶含量来改变其催化速率，还可来改变其催化速率，还可以通过以以通过以不同形式的酶不同形式的酶在不同组织中的在不同组织中的分布差异来调节代谢活动。分布差异来调节代谢活动。n酶结构的调解是通过对现有酶分子结构酶结构的调解是通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性。这是一种的影响来改变酶的催化活性。这是一种快速调节方式。分为别构调控和共价调快速调节方式。分为别构调控和共价调控两种机制。控两种机制。别构调控别构调控n很多寡聚酶，当它们的亚基上的配体结合部位与配体很多寡聚酶，当它们的亚基上的配体结合部位与配体非共价可逆结合时，将发生构象变化并影响同一酶分非共价可逆结合时，将发生构象

18、变化并影响同一酶分子上的其它亚基上的空活性部位的亲和力，这一现象子上的其它亚基上的空活性部位的亲和力，这一现象称为酶的称为酶的别构调节别构调节（allosteric regulationallosteric regulation）。）。n酶的别构效应包括涉及酶与底物结合时催化部位和催酶的别构效应包括涉及酶与底物结合时催化部位和催化部位之间的相互作用即同促效应，和涉及酶与调节化部位之间的相互作用即同促效应，和涉及酶与调节物结合时调节部位与活性部位之间的相互作用即异促物结合时调节部位与活性部位之间的相互作用即异促效应。效应。n具有这种调节作用的酶称为具有这种调节作用的酶称为别构酶别构酶（allos

19、eric alloseric enzymeenzyme）。）。n凡能使酶分子发生别构作用的物质称为凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物（效应物（effectoreffector）或别构剂）或别构剂。n因别构导致酶活性增加的物质称为因别构导致酶活性增加的物质称为正效正效应物应物（positive effectorpositive effector）或别构激活）或别构激活剂，反之称为剂，反之称为负效应物负效应物（negative negative effectoreffector）或别构抑制剂。）或别构抑制剂。n当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂

20、）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的构酶的协同效应协同效应。n别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节，常见的为酶进行调节，常见的为负反馈调节负反馈调节。 ABCDPE1E2E3En典型的别构酶天冬氨酸转氨甲酰酶典型的别构酶天冬氨酸转氨甲酰酶（ ATCase ATCase ）ATCaseATCase的一个最有效的的一个最有效的抑制剂是代谢途径的终抑制剂是代谢途径的终产物胞嘧啶三磷酸产物胞嘧啶三磷酸（CTPCTP），

21、而），而ATPATP是酶的是酶的激活剂。激活剂。n在在E.coliE.coli中中ATCaseATCase催化由氨甲酰磷酸和天冬氨催化由氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸。酸生成氨甲酰天冬氨酸。nN-N-氨基甲酰磷酸与天冬氨酸的结合是协同的，协同结氨基甲酰磷酸与天冬氨酸的结合是协同的，协同结合使底物浓度只在一个很窄的范围内开启合使底物浓度只在一个很窄的范围内开启N-N-氨甲酰天氨甲酰天冬氨酸的合成。底物分子本身对别构酶的调节作用称冬氨酸的合成。底物分子本身对别构酶的调节作用称为为同促效应。同促效应。nCTPCTP在不影响酶的在不影响酶的VmaxVmax的情况下，通过降低酶与底物的的情况下，

22、通过降低酶与底物的亲和性来抑制亲和性来抑制ATCaseATCase；ATPATP可增强酶与底物的亲和性，可增强酶与底物的亲和性，也不影响也不影响VmaxVmax。这种非底物分子的调节物对酶的调节。这种非底物分子的调节物对酶的调节作用，称为作用，称为异促效应异促效应。别构激别构激活活别构抑别构抑制制V0 S底物敏感底物敏感区区Two views of the regulatory enzyme aspartate transcarbamoylase.(Derived from PDB ID 2AT2.) This allosteric regulatory enzyme has two stac

23、ked catalytic clusters, each with three catalytic polypeptide chains (in shades of blue and purple), and three regulatory clusters, each with two regulatory polypeptide chains (in red and yellow). The regulatory clusters form the points of a triangle surrounding the catalytic subunits. Binding sites

24、 for allosteric modulators are on the regulatory subunits. Modulator binding produces large changes in enzyme conformation and activity.别构酶的基本性质别构酶的基本性质n别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基多亚基构构成。成。n因别构酶有协同效应，故其因别构酶有协同效应，故其SS对对v v的的动力学曲动力学曲线线不符合米氏方程。不符合米氏方程。n效应物可分为效应物可分为K K型和型和V V型型两种类型。两种类型。n别构酶经加热或

25、化学试剂处理，可引起别构酶别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏作用。解离，失去调节活性，称为脱敏作用。多亚基多亚基调节亚基调节亚基催化亚基催化亚基协同效应协同效应别构激活剂别构激活剂别构抑制剂别构抑制剂正协同正协同负协同负协同别构酶的动力学别构酶的动力学nSS对对v v的动力学曲线不是双曲线，而是的动力学曲线不是双曲线，而是S S形曲形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。均不符合米氏方程。2 2米氏曲线米氏曲线1 1负协同负协同3 3正协同正协同321V0 SVn正协同效应：底物或调节物的结合大大增

26、加了酶对后续底物分子的亲和性。（S型曲线）n负协同效应：底物浓度较小的范围内，酶活力上升很快，随后底物浓度虽有较大提高，但反应速率升高很小，表现为负协同。（表观双曲线）n饱和比值（饱和比值（RsRs）可用来鉴别不同的协同作用以）可用来鉴别不同的协同作用以及协同的程度。及协同的程度。 典型的米氏类型的酶典型的米氏类型的酶Rs=81Rs=81 具有正协同效应的别构酶具有正协同效应的别构酶Rs81Rs81Rs81， Rs Rs 负负协同效应协同效应意义：意义：n在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控制酶活力，因此是生物代谢中许多代谢途径的制酶活力，因此是生物

27、代谢中许多代谢途径的关键酶。关键酶。别构激别构激活活别构抑别构抑制制V0 S底物敏感底物敏感区区2 2 米 氏米 氏曲线曲线1 1负协同负协同3 3正协同正协同321V0 SVnK K型效应物和型效应物和V V型效应物型效应物K K型型V V型型别构模型别构模型n齐变模型（齐变模型（WMCWMC） 别构酶的所有亚基，或全部呈坚固紧密的，不利于结别构酶的所有亚基，或全部呈坚固紧密的，不利于结合底物的合底物的“T T”状态，或者全部是松散的，有利于结合状态，或者全部是松散的，有利于结合底物的底物的RR状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时的，齐步发生的。

28、是同时的，齐步发生的。TT状态中亚基的排列是对称状态中亚基的排列是对称的，变成的，变成RR状态后亚基的排列仍然是对称的。状态后亚基的排列仍然是对称的。n序变模型（序变模型（KNFKNF） 酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构象状态。象状态。 五、酶活性的共价调节n共价调节即利用蛋白质共价结构的变化调节酶的活性，包括不可逆共价变化（酶原激活）和可逆共价变化（如磷酸化）两种形式。（一）不可逆共价调节（一）不可逆共价调节酶原的激活酶原的激活n处于无活

29、性状态的酶的前体物质就称为处于无活性状态的酶的前体物质就称为酶原酶原。n酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称为为酶原的激活酶原的激活。n酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改变。变。酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。n举例：消化系统蛋白酶原的激活，凝血机制。举例：消化系统蛋白酶原的激活，凝血机制。消化系统蛋白酶原的激活消化系统蛋白酶原的激活凝血机制凝血机制（二）可逆共价调控（二）可逆共价调控n酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化酶蛋白分子中的某些基团可