实验汇报(提总RNA及RT-PCR)--叶跃天

1、 TrizolTrizol法提总法提总RNARNA 及及RT-PCRRT-PCR技术技术TrizolTrizol法提总法提总RNARNA Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使离，使RNARNA与蛋白质分离与蛋白质分离。加入氯仿氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。实验原理一、实验准备一、实验准备仪器：仪器：离心机、恒温箱、涡旋仪、酶标仪、水浴锅、PCR仪、上样电泳仪、电子天平

2、等工具工具: : 泡沫盒、手套（线、乳胶、塑料薄膜）、EP管、研钵、多型号微量移液器、RNA专用枪头、试管、量筒等。试剂试剂: : 液氮、无水乙醇、DEPC水（焦磷酸二乙酯：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性高致癌性）、TRI-ZOL、氯仿、异丙醇、核酸胶（琼脂粉、TAE缓冲液、EB）、Loading buffer（上样缓冲液）、Marker（分子标记）、反转录引物、反转录试剂盒、PCR试剂盒等。样本：样本：根据实验要求取样。二、注意事项二、注意事项(一)试验中会遇到有毒有害试剂，所以在试验中务必遵守实验规程，带好手套及口罩，勿随手触摸试剂等。(二)RNA实验失败的主要原因是R

3、NARNA酶的污染酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。1、人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。2、实验所用枪头、EP管须在DEPC水中过夜浸泡，取出后放 在高压蒸汽灭菌箱内处理，121、30分钟。3、研钵洗净后放在鼓风干燥箱内处理，180、6小时。取出后冷凉，再放入-80冰箱中预冷。4、实验开始之前要先将37恒温箱打开。同时打开水浴锅，温度分别调到65和42。三、试验流程三

4、、试验流程取材：取材：取少量液氮于泡沫盒中，从-80冰箱中取出样本、研钵、研磨棒。样品投入液氮中。配置裂解液：配置裂解液：取8支EP（标记，以后做转移时都要标记），各加1ml Tri-zol+10ul 蛋白酶水。研磨：研磨：用镊子取适量样品与研钵中研磨，研磨过程中不断添加不断添加液氮液氮（防止化冻，内源性RNA酶降解RNA）。研磨充分后用枪头尽可能快地将样品转入事先准备好的裂解液中，剧烈震荡剧烈震荡。静置15min。三氯甲烷：向8支EP管中各加200ul三氯甲烷（枪头悬空加，不用换），充分混匀充分混匀后，静置15min。离心：15min后，12000rpm-4-15min异丙醇：离心完成后，吸

5、出上清转移至另8支EP中，再加入500ul异丙醇（沉淀RNA），静置10min。离心：10min后，12000rpm-4-10min离心完成后，倒掉上清，向各管中加入1ml 75%乙醇。直接离心，10000rpm-5min离心后，倒掉上清，稍微离心，取出，用虹吸的方法洗出残留的乙醇。晾置10min。当RNA边缘约1/3开始透明时，加适量DEPC水（一般约20-30ul），RNA较多时可加35-40ul。37恒温箱中，30min。RNARNA提取结果的鉴定提取结果的鉴定1、将恒温箱中的RNA取出，轻轻吹打，并转移至另8支EP（作详细编号，eg：热对1-1,2013.11.9）2、从上述含有RNA

6、的EP中各取3ul，放到酶标仪的板上（加一组DEPC水作为对照）3、测吸光度：设定在230nm、260nm、280nm处的吸光度。设置预计算，计算A260/A280是否在1.8-2.0之间。（若比值高于（若比值高于2.02.0，表明，表明RNARNA有降解，若低于有降解，若低于1.81.8，表明，表明RNARNA被污染，可能是蛋被污染，可能是蛋白质或是酚污染。）白质或是酚污染。）4、打开酶标仪中EXCEL表格，输入EP对应的编号，并找出各自对应的A260的值，保存，计算出RNA的浓度。RNA=A260RNA=A2604040稀释倍数稀释倍数/1000 (ug/ul)/1000 (ug/ul)

7、本实验定量RNA为0.1ug，由此可根据RNA浓度，计算出每个样本RNA所需要的体积。因为之后的反转录体系为20ul，RNA+H2O=10ul，由此再计算出所加水的体积。eg：假设A260/A280=2.0 得到RNA=2.040/1000=0.08ug/ul VRNA=0.1/0.08=1.25ul VH2O=10-1.25=8.25ul反转录反转录 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。反转录的简要过程表示如下： 反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3桹H末端上，按53方向，合

8、成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。1、取16支EP，分为两组：H H组（组（HSPHSP，热休克蛋白）和，热休克蛋白）和G G组组（GAPDH,GAPDH,内参蛋白）内参蛋白），编号：热对-1,11.9，H。2、配制反转录体系20ul：12ul12ul： 上游引物： 1ul 下游引物： 1ul RNA+H2O：10ul轻微离心，65水浴5min。取出后置于冰

9、上。同时配置8ul体系：本实验16支EP，按18支量配，以防不足。 buffer 4ul riblock 1ul 10mM dNTP 2ul 反转录酶抑制剂 1ul配制完成后，16支EP各加8ul，轻微离心。水浴锅中，42，2h。可以混合后添加（H和和G组要分组要分开开）PCRPCR（DNADNA）扩增）扩增 聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏9595高温时变高温时变性会变成单链，低温（经常是性会变成单链，低温（经常是6

10、060C C左右）时引物与单链按碱基左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至互补配对的原则结合，再调温度至DNADNA聚合酶最适反应温度聚合酶最适反应温度（7272C C左右），左右），DNADNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)(5-3)的方向合的方向合成互补链。成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性变性温度，复性复性温度，延伸延伸温度之间很好地进行控制。 1、准备16支小EP，备用。2、配制PCR反应体系，25ul25ul，分三步添加。按18支配制，以防不足。 模板 5ul 上游引物 1ul 下游引物 1ul 10buffer

11、2.5ul dNTP 2ul 酶 0.2ul DEPC水 13.3ul3、添加完成后，轻微离心。4、将小的EP放入PCR仪中。设置好步骤，温度（98、56、72）、循环数（30）后开始扩增。可以混合后添加（H H和和G G组要分开组要分开）琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA核酸胶的制备核酸胶的制备电子天平取1g琼脂粉量筒取100ml TAE微波炉（锥形瓶中）加热至完全融化（130）自来水冲瓶降温，温热即可。加入少许EB（1滴即可），混匀将制胶板两端封好，插上梳子，倒入琼脂糖，室温冷却凝固将凝胶置入电泳槽中，加TAE至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。跑胶（电泳）跑胶（电泳）

12、1、从各组EP管中各取3ul扩增后的DNA，混合2-3ul的 Loading Buffer。按顺序依次注入到核酸胶的齿槽中。2、最后保留一孔，加入5ul Marker。3、对应正负极对应正负极，红对红、黑对黑，盖上电泳仪的盖子，插上电源，调整好电压，电流。4、当液体跑开成两条蓝色带，最后一条跑至胶长度1/3处且两条带间距适中时，即可关掉电源。5、戴手套取出胶块，紫外分析仪中观察。若样品跑出一条清晰明亮的短带时，且Marker条带明显即可视为实验结果成果。点点 样样 生物体内一般含有核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转运RNA(tRNA)三种主要的RNA,其中rRNA含量最多,提

13、取组织总RNA所得最多的就是rRNA.真核生物中含有5S、5.8S、18S、28S,原核生物中有5S、16S、23S；而植物组织中一般较多的为5S、18S、28S。S代表沉降系数,当用超速离心测定一个粒子的沉降速度时,此速度与粒子的大小直接成比例。5S、18S、28S分别具有120、1900和4700个核苷酸。原理原理: :酶标仪酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计分光光度计，其基本工作原，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同理与主要结构和光电比色计基本相同. .结构：结构：规格有规格有2424孔板，孔板，4848孔板，孔板，9696孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测. .用途：用途：可广泛应用于可广泛应用于低紫外区的低紫外区的DNADNA、RNARNA定量及纯度分析（定量及纯度分析（A260/A280A26