第六章发酵工艺实例介绍第一节味精一、概述早期—从天然

1、 第六章第六章 发酵工艺实例介绍发酵工艺实例介绍 第一节第一节 味精味精一、概述一、概述Introduction History of amino acids production:The story of started in 1908 Isolated glutamic acid, delicious tasteScreen for amino-acid-excreting microorganisms:Corynebacterium glutamicum, In 1957.Monosodium glutamate (MSG):A flavor-enhancing compound二、谷氨

2、酸的生物合成机理二、谷氨酸的生物合成机理 1. 1. 谷氨酸谷氨酸 （ - -氨基戊二酸）氨基戊二酸） O C-OH 第一代鲜味剂第一代鲜味剂 H2N- C- H L-L-谷氨酸单钠盐谷氨酸单钠盐味精味精 H-C-H H-C-H H-C O OH L-型NH42.2.谷氨酸的生物合成谷氨酸的生物合成 葡萄糖葡萄糖 6-P-葡萄糖葡萄糖 6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸 3-P-甘油醛甘油醛 5-P-核糖核糖 丙酮酸丙酮酸 乙酰乙酰CoA 草酰乙酸草酰乙酸 柠檬酸柠檬酸 苹果酸苹果酸 异柠檬酸异柠檬酸 延胡索酸延胡索酸 琥珀酸琥珀酸 - 酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸 透过细胞膜透过细胞膜 谷氨酸谷氨酸

3、HMP: Hexosemonophosphate pathway（1 1）EMP:EMP:丙酮酸，丙酮酸，ATP,NADHATP,NADH2 2（2 2）HMP:HMP:6 6磷酸果糖磷酸果糖 3 3磷酸甘油酸磷酸甘油酸 NADPHNADPH2 2: : 酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。（3 3）TCATCA循环循环: :生成谷氨酸前体物质生成谷氨酸前体物质 酮戊二酸。酮戊二酸。（4 4）COCO2 2固定反应固定反应: :补充草酰乙酸。补充草酰乙酸。（5 5）乙醛酸循环）乙醛酸循环: :使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得 到补充，

4、维持到补充，维持TCATCA循环的正常运转。循环的正常运转。 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶（6 6）还原氨基化反应）还原氨基化反应: : 酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸丙酮酸丙酮酸回补反应NADHNAD+苹果酸脱氢酶OCOOHCCH2COOH苹果酸酶NADP+CO2NADPHOCH3CCOOHHOHCCH2COOHCOOH 3. 3.谷氨酸生产菌的生化特征谷氨酸生产菌的生化特征 （1 1）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。 （2 2） 酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢 酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。 （3 3

5、）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPHNADPH2 2 的能力弱。的能力弱。 （4 4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。）菌体本身利用谷氨酸的能力低。 4. 4.谷氨酸产生菌（全是细菌）谷氨酸产生菌（全是细菌） 棒杆菌属棒杆菌属 北京棒杆菌北京棒杆菌 C. pekinenseC. pekinense CorynebacteriumCorynebacterium 钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌 C. crenatumC. crenatum 谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌 C. glutamicumC. glutamicum 短杆菌属短杆菌属 黄色短杆菌黄色短杆菌 B. flv

6、umB. flvum Brevibacterium Brevibacterium 产氨短杆菌产氨短杆菌 B. ammoniagenesB. ammoniagenes 小杆菌属小杆菌属 嗜氨小杆菌嗜氨小杆菌 M. ammoniaphilumM. ammoniaphilum Microbacterium Microbacterium 节杆菌属节杆菌属 球形节杆菌球形节杆菌 A.A. globiformis globiformis ArthrobacterArthrobacter 共同点：共同点： 1 1）革兰氏阳性。）革兰氏阳性。 2 2）不形成芽孢。）不形成芽孢。 3 3）没有鞭毛，不能运动。）

7、没有鞭毛，不能运动。 4 4）需要生物素作为生长因子。）需要生物素作为生长因子。 5 5）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸发酵的工艺控制三、谷氨酸发酵的工艺控制（一）培养基（一）培养基 1. 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃 （1 1）淀粉水解糖的制备）淀粉水解糖的制备 （2 2）糖蜜原料）糖蜜原料 2. 2.氮源：铵盐、尿素、氨水氮源：铵盐、尿素、氨水 C/NC/N100100：1515 2121，实际高达，实际高达100100：2828 因为：因为：1 1）用于调整）用于调整pHpH。 2 2）分

8、解产生）分解产生的的NHNH3 3从发酵液中逸出。从发酵液中逸出。 产酸阶段：产酸阶段： NHNH4 4+ +不足不足：使：使 - -酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。 NHNH4 4+ +过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。3.3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中 磷酸盐对发酵有显著影响。磷酸盐对发酵有显著影响。 不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。 过多：过多：a.a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b.

9、b.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩 合生成缬氨酸的前体物合生成缬氨酸的前体物 乙醛乳酸，乙醛乳酸， 使使缬氨酸在发酵液中蓄积。缬氨酸在发酵液中蓄积。 4. 4. 生长因子：生物素生长因子：生物素 作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。 （1 1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoACoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响 磷酯的合成。磷酯的合成。 （2 2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：）浓度过大：促进菌体

10、生长，谷氨酸产量低。因为： a.a.乙醛酸循环活跃，乙醛酸循环活跃， - -酮戊二酸生成量减少。酮戊二酸生成量减少。 b.b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。 生物素：生物素：B B族维生素的一种，又称维生族维生素的一种，又称维生素素H H或辅酶或辅酶R R。是合成脂肪酸所必需的。是合成脂肪酸所必需的。 脂肪酸的生物合成：脂肪酸的生物合成： 利用乙酰利用乙酰CoACoA（直接原料是丙二酸单酰（直接原料是丙二酸单酰CoACoA）在乙酰）在乙酰CoACoA羧化酶（辅基为生物素）催羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。化下合成。 脂肪酸甘油磷酸脂肪酸甘油磷

11、酸 磷脂蛋白质磷脂蛋白质 生物膜生物膜 因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。 生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。 使胞内代谢产物迅速排出的方法使胞内代谢产物迅速排出的方法 1. 用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜合成或使膜受缺损直接抑制膜合成或使膜受缺损 如如: Glu发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌Glu；当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；素的方法； 2.

12、 利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。量谷氨酸。 控制细胞

13、膜的渗透性控制细胞膜的渗透性(1) (1) 通过生理学手段控制细胞膜渗透性通过生理学手段控制细胞膜渗透性(2) (2) 通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸细胞膜渗透性细胞膜渗透性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸油酸n工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，应采用的最好方法是（应采用的最好方法是（ ）A A加大菌种密度加大菌种密度B B改变碳源和氮源比例改变碳源和氮源比例C C改变菌体细胞膜通透性改变菌体细胞膜通透性D D加大葡萄糖释放量加大葡萄糖释放量 为什么添加适量生物素或青霉素

14、可提高谷氨酸产量？为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？ 生物素生物素：乙酰：乙酰-CoA-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。酸的分泌和反馈调节。 生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍GluGlu分泌，并引起反馈分泌，并引起反馈抑制，加适量青霉素可提高抑制，加适量青霉素可提高GluGlu产量。产量。 青霉素青霉素：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活

15、性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。外渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。 （二）（二）pHpH的影响及其控制的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。 在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。酵转向谷氨酰胺发酵。 pHpH控制在中性或微碱性。控制在中性或微碱性。 方法：流加尿素和氨水。方法：流加尿素和氨水。（三）温度的影响及其控制（三）温度的影响及其控制

16、菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。同。菌体生长阶段：菌体生长阶段：3030 3434产酸阶段：产酸阶段：3434 3636 （四）溶解氧的控制（四）溶解氧的控制 大小由通风量和搅拌转速决定。大小由通风量和搅拌转速决定。 发酵产酸阶段，通风量要适量。发酵产酸阶段，通风量要适量。不足：发酵液不足：发酵液pHpH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。过大：过大：NADPHNADPH2 2通过呼吸链被氧化，影响通过呼吸链被氧化，影响 - -酮戊二酸

17、还原酮戊二酸还原 氨基化，使氨基化，使 - -酮戊二酸蓄积。酮戊二酸蓄积。控制控制因子因子产物产物氧氧( (不足不足) )乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸 谷氨酸谷氨酸( (充足充足) -) -酮戊二酸酮戊二酸( (过量过量) ) NHNH+ +4 4( (不足不足)-)-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸( (适量适量) ) 谷氨酰胺谷氨酰胺( (过量过量) )生物生物素素谷氨酸谷氨酸 ( (限量限量) ) 乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸( (充足充足) )pHpH( (酸性酸性)N-)N-乙酰乙酰- -谷氨酰胺谷氨酰胺 谷氨酸谷氨酸( (中性或微碱性中性或微碱性) ) 磷酸磷酸盐盐( (适量适量) )谷氨酸

18、谷氨酸 缬氨酸缬氨酸 环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换三、下游过程三、下游过程（一）谷氨酸的提取方法（一）谷氨酸的提取方法 1.1.等电点沉淀法等电点沉淀法 （1 1）水解等电点法）水解等电点法 （2 2）低温等电点法）低温等电点法 （3 3）低温连续等电点法）低温连续等电点法2. 2. 不溶性盐沉淀法不溶性盐沉淀法（1 1）锌盐法）锌盐法谷氨酸锌离子谷氨酸锌离子 谷氨酸锌沉淀谷氨酸锌沉淀 溶液溶液 谷氨酸结晶谷氨酸结晶pH6.3加酸加酸pH2.4（2 2）盐酸盐法：）盐酸盐法： GluGlu在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。

19、这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。（3 3）钙盐法：）钙盐法： 高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质 分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加NaHCONaHCO3 3 直接得直接得 到味精。到味精。 3.3.离子交换法离子交换法 用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱（离子，再用热碱（ 60 60 4% NaOH 4% NaOH ）洗脱，）洗脱，收集相应流分，加盐酸结晶。收集相应流分，加盐酸结晶。 GA+ GA GA- GA= 12 pI 谷氨酸是酸性氨基酸，含谷氨酸是酸性氨基酸，含2 2个羧基个羧基1 1个个氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，换树脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而用阳离子交换树脂。因而用阳离子交换树脂。 理论上讲发酵液上柱的理论上讲发酵液上柱的pHpH值应低于值应低于3.223.22，但实际上控制在，但实际上控制在5.0 5.0 6.06.0之间，之间，