分子标记辅助育种--前沿讲座

1、12转基因途径相对传统育种法的优点转基因途径相对传统育种法的优点传统育种法传统育种法: :相关的相关的品种品种亚种亚种种种基因转移基因转移相关的相关的品种品种亚种亚种种种转基因途径转基因途径:动物动物 植物植物 噬菌体噬菌体细菌细菌 病毒病毒 真菌真菌 34转转Bt基因玉米的基因玉米的PCR检测结果检测结果转基因亲本的转基因亲本的Southern检测结果检测结果1：MK；2：CK+，Bt质粒；质粒；3：CK-；4-13：转基因亲：转基因亲本本5分子育种学分子育种学分子标记技术分子标记技术转基因技术转基因技术常规育种技术常规育种技术经验、机遇经验、机遇科学、技术科学、技术67传统回交育种与标记辅

2、助选择方法的比较：传统回交育种与标记辅助选择方法的比较：8第一节第一节 植物中常用的遗传标记植物中常用的遗传标记( (Genetic markers) )9遗传标记类型遗传标记类型: :10在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：记应具备以下几个条件：11一、形态标记一、形态标记（morphological markermorphological marker）12水稻形态标记连锁图水稻形态标记连锁图13棉花多标记基因材料棉花多标记基因材料14利用形态标记进行辅助选择实例利用形态标记进行辅助选择实例15形态标记的缺点：形态标记的缺点：16二

3、、细胞学标记二、细胞学标记( (cytological marker) )1718作物遗传育种研究中已建立的细胞标记：作物遗传育种研究中已建立的细胞标记：192021应用实例应用实例22优缺点：优缺点：23三、生化标记三、生化标记(biochemical marker)24分析方法分析方法25玉米姊妹系和姊妹种的醇溶蛋白玉米姊妹系和姊妹种的醇溶蛋白262728优缺点：优缺点：29四、分子标记四、分子标记 （Molecular markers）n广义的分子标记也包括广义的分子标记也包括，即指可遗传并可检，即指可遗传并可检测的测的DNADNA序列及其产物，而狭义的分子标记仅指序列及其产物，而狭义的

4、分子标记仅指DNADNA标标记。记。n生物各种性状的变异主要是遗传物质生物各种性状的变异主要是遗传物质DNADNA差异造成的，差异造成的，因而通过因而通过DNADNA分子标记可以直接检测基因组的遗传变分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、异，它更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体的差异。品系间个体的差异。30相对性状相对性状DNA序列的差序列的差异：异：1、单碱基突变、单碱基突变2、插入突变、插入突变3、缺失突变、缺失突变4、重复序列、重复序列31分子标记产生的基本原理分子标记产生的基本原理32分子标记产生的基本原理分子标记产生的基本

5、原理33分子标记产生的基本原理分子标记产生的基本原理34与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：的优越性，表现为：35分子标记应用分子标记应用36373839404142第二节第二节 分子标记的类型及原理分子标记的类型及原理nDNA分子标记的基本原理主要是基于限分子标记的基本原理主要是基于限制性内切酶酶切、制性内切酶酶切、PCR扩增或两者结合扩增或两者结合而获得的。分为而获得的。分为43第一类是以分子杂交为核心的分子标记第一类是以分子杂交为核心的分子标记44第二类是以聚合酶链式反应（第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase c

6、hain reaction , ,简称简称PCRPCR反应）为核心的分子标记反应）为核心的分子标记45第三类是一些新型的分子标记第三类是一些新型的分子标记4647第三节第三节 分子标记在基因作图中的应用分子标记在基因作图中的应用48一一 应用分子标记构建遗传图谱应用分子标记构建遗传图谱n构建作物的遗传图谱，不仅是遗传研究的重要内容，而且构建作物的遗传图谱，不仅是遗传研究的重要内容，而且为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规为作物种质资源收集、目标基因定位、基因克隆、育种规模大小及相应育种方法的确定提供了理论依据。模大小及相应育种方法的确定提供了理论依据。49遗传图谱和物理图谱 50

7、遗传作图遗传作图51遗传作图基本原理：连锁分析遗传作图基本原理：连锁分析孟德尔独立分配规律的要点是：各种配子基因型的比率是相等的孟德尔独立分配规律的要点是：各种配子基因型的比率是相等的（左图）；若出现亲本型配子的比率高于重组型配子，则说明基（左图）；若出现亲本型配子的比率高于重组型配子，则说明基因间出现连锁（右图）。因间出现连锁（右图）。52重组率和遗传图距重组率和遗传图距 重组率（重组率（r r）的计算式为：）的计算式为： r r 重组型重组型/(/(亲本型亲本型+ +重组型重组型) ) 如又图例子如又图例子: : r (76+75)/(542+537+76+75) 0.1228 作图函数作

8、图函数( (mapping function) ) Haldane Haldane作图函数作图函数 r 1-exp(-0.02D)/2 Kosambi作图函数作图函数 r 1-exp(-0.04D)/2 1+exp(-0.04D) 式中式中:D=两基因间遗传图距两基因间遗传图距 图距单位图距单位: 1cM(厘摩厘摩)=1%重组率重组率; 100cM=1M53构建分子遗传图谱的基本程序构建分子遗传图谱的基本程序54555657RFLP marker58592. RAPDLane 1 and lane 22 DNA marker, lane 2 Rf1 bulked, lane 3 rf1 bul

9、k, lanes 412 fertile plants, lanes 1321 sterile plants 603. CAPs 6162确定连锁群与染色体的关系确定连锁群与染色体的关系63水稻分子连锁遗传图（染色体水稻分子连锁遗传图（染色体1 1- -6 6）64水稻分子连锁遗传图（染色体水稻分子连锁遗传图（染色体7 7- -1212）6566几个重要的概念671、比较基因组学(Comparative Genomics) 682、同线性与共线性69完全共线性完全共线性( (complete colinearity)()(相似性相似性) )70717273747576771.80.68.53.

10、31.71.70.30.10.41.21.60.0定位结果定位结果78不育系综不育系综3恢复系恢复系871不育胞质恢复不育胞质恢复型豫玉型豫玉22质量性状定位质量性状定位79质量基因定位的分离群体质量基因定位的分离群体1 1、F F2 2群体群体Cms-C(rf4rf4)N(Rf4Rf4)F1 Cms-C(Rf4rf4)F2 1 Cms-C(Rf4Rf4) 2 Cms-C(Rf4rf4) 1 Cms-C(rf4rf4)80质量基因定位的分离群体质量基因定位的分离群体2 2、BCBC1 1群体群体Cms-C(rf4rf4)N(Rf4Rf4)Cms-C(rf4rf4)Cms-C(Rf4rf4)BC

11、1 1 Cms-C(Rf4rf4) 1 Cms-C(rf4rf4)81质量基因定位的分离群体质量基因定位的分离群体3 3、NILsNILs群体群体82质量性状基因的初步定位质量性状基因的初步定位 BSA分群法分群法(分离体分分离体分组混合分析法组混合分析法 在作图群体中，依据目标性状表型的相对差在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与感病），将个体或株系分成两组，异（如抗病与感病），将个体或株系分成两组，然后分别将两组中的个体或株系的然后分别将两组中的个体或株系的DNADNA混合，形成混合，形成相对的相对的DNADNA池。根据亲本与池。根据亲本与DNADNA池扩增带型之间的池扩增带型

12、之间的差异，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。差异，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。83 可以推测，这两个可以推测，这两个DNADNA池之间除了在目标池之间除了在目标基因座所在的染色体区域的基因座所在的染色体区域的DNADNA组成上存在差组成上存在差异之外，来自基因组其它部分的异之外，来自基因组其它部分的DNADNA组成是完组成是完全相同的，都是该作图群体基因库的一个随机全相同的，都是该作图群体基因库的一个随机样本。样本。84BSABSA分群的基本原理分群的基本原理85抗病单株抗病单株感病单株感病单株86抗病单株抗病单株感病单株感病单株P1P2F2 RF2 S87抗病单株抗病单株感病单株感病

13、单株P1P2F2 RF2 S88 在在F2群体中，对于群体中，对于5cM的区间，当混合体所含个的区间，当混合体所含个体数不超过体数不超过40时，双交换概率小于时，双交换概率小于10%。当目标区间。当目标区间增大到增大到10cM时，混合个体数必须小于时，混合个体数必须小于10，才能保持，才能保持10%的双交换概率。的双交换概率。 Goivannoni等建议混合体所含个体数应大于等建议混合体所含个体数应大于5，目，目标区间的长度应小于标区间的长度应小于15cM。 混合群体的单株个数混合群体的单株个数89P1P2F2FF2s玉米玉米C型胞质雄性不育恢复基因型胞质雄性不育恢复基因Rf5 SSR分子标记

14、的筛选分子标记的筛选90分离群体的基因型判断与相应的分子分离群体的基因型判断与相应的分子 标记数据的处理标记数据的处理1、分离群体的标记数据、分离群体的标记数据2 2、依据表型推断每一分离群体的单株基因型、依据表型推断每一分离群体的单株基因型1）BC1群体：如果抗病亲本为群体：如果抗病亲本为1，感病亲本为，感病亲本为2；在；在BC1群体中抗病单株为群体中抗病单株为3，感病单株为，感病单株为2。2）F2群体：如果抗病亲本为群体：如果抗病亲本为1，感病亲本为，感病亲本为2；在；在F2群群体中感病单株为体中感病单株为2，抗病单株可能为，抗病单株可能为3或或1，因此利用，因此利用F2的的表型不能推知其

15、基因型，所要利用表型不能推知其基因型，所要利用F3群体判断群体判断F2的基因的基因型。型。91交换值的计算交换值的计算 原理：根据单株基因型与标记数据，利用三点原理：根据单株基因型与标记数据，利用三点测验或两点测验计算目标基因与连锁标记之间的交测验或两点测验计算目标基因与连锁标记之间的交换值，然后利用换值，然后利用KosambiKosambi作图函数进行校正：作图函数进行校正：常用的统计软件有：常用的统计软件有：Jointmap 和和Mapmaker92Cms-C Mo17（rf4rf4rf5rf5)凤可凤可1（Rf4Rf4Rf5Rf5)Cms-C Mo17 F1BC1F23 : 1 15 :

16、 1 玉米玉米C型胞质雄性不育的恢复存在两对重叠恢复主基因型胞质雄性不育的恢复存在两对重叠恢复主基因例：玉米例：玉米C型胞质雄性不育恢复基因的定位型胞质雄性不育恢复基因的定位93玉米玉米C型胞质雄性不育恢复基因定位型胞质雄性不育恢复基因定位94玉米温敏核雄性不育系琼玉米温敏核雄性不育系琼6868的育性受一对隐性基因控制的育性受一对隐性基因控制琼琼68 68 K12 K12琼琼68 68 F1 F1BC1 F2BC1 F2可育：不育可育：不育 1 1：1 31 3：1 1 umc1185phi08317.5nc13314.9umc23807.7umc156012.4umc14976.1umc24

17、023.1umc21294.6TM3/tm33.7umc10421.5phi25137.7bnlg13293.5bnlg15204.7phi32818912.4umc19477.9umc152524.9bnlg207711.2bnlg18935.7phi10104916.3phi03923.0玉米温敏核雄性不育基因玉米温敏核雄性不育基因TMS3/tms3的遗传连锁图的遗传连锁图95质量性状基因的精细定位质量性状基因的精细定位 NILs法法96Cms-El（rf4rf4）Cms-El(Rf4Rf4)恢复基因恢复基因Rf4的精细定位的精细定位Cms-C(rf4rf4)Cms-C(Rf4rf4)BC

18、1 1 Cms-C(Rf4rf4) 1 Cms-C(rf4rf4) 10000株分离群体利用87-1背景的恢复基因Rf4的NILs9798991001012.102103区间作图法：区间作图法：104105106107 复合区间作图法，由于多元回归中表型对标记的偏回归复合区间作图法，由于多元回归中表型对标记的偏回归系数只取决于两个相邻标记所包括区间存在的系数只取决于两个相邻标记所包括区间存在的QTL，与其，与其它区间的它区间的QTL无关，因此在简单回归分析之后选择多个可无关，因此在简单回归分析之后选择多个可能的标记作为前景干扰进行分析，求出特定能的标记作为前景干扰进行分析，求出特定QTL与性状

19、间与性状间的偏回归系数来判断的偏回归系数来判断QTL是否存在。此法添加了背景控制是否存在。此法添加了背景控制，使一个区间的测定不受定义区间以外的其它标记和，使一个区间的测定不受定义区间以外的其它标记和QTL影响，减小了剩余方差，提高了影响，减小了剩余方差，提高了QTL的检测能力（的检测能力（Zeng，1993；1994）。）。 复合区间作图法复合区间作图法108基于混合线性模型的复合区间作图法基于混合线性模型的复合区间作图法 朱军等（朱军等（1998）提出了基于混合线性模型的复合区间作）提出了基于混合线性模型的复合区间作图法，利用随机效应的预测方法获得基因型效应及基因型图法，利用随机效应的预测

20、方法获得基因型效应及基因型与环境互作效应的预测值，然后再用复合区间作图法分别与环境互作效应的预测值，然后再用复合区间作图法分别进行遗传主效应及基因型进行遗传主效应及基因型环境互作效应的环境互作效应的QTL分析。该分析。该方法把群体均值、方法把群体均值、QTL遗传主效应（包括加性效应、显性遗传主效应（包括加性效应、显性效应和上位性效应）作为固定效应，而把环境效应、效应和上位性效应）作为固定效应，而把环境效应、QTL与环境互作效应、分子标记效应及其与环境的互作效应以与环境互作效应、分子标记效应及其与环境的互作效应以及剩余方差作为随机效应，将效应估计和定位分析结合起及剩余方差作为随机效应，将效应估计

21、和定位分析结合起来，进行多环境下的联合来，进行多环境下的联合QTL定位分析，提高了作图的精定位分析，提高了作图的精度与效率。度与效率。 109常用的常用的QTL作图软件作图软件 目前目前QTL定位过程中广泛使用的软件有定位过程中广泛使用的软件有：MAPMAKER/QTL 1.1、QTLmapper 1.0、QTLmapper 1.6、QTLmapper 2.0、Jointmap、Qgene2.29、QTLcarttographer 等。等。110影响影响QTL作图精度的主要因子作图精度的主要因子 QTL作图精度一般包括作图精度一般包括QTL的发现能力、的发现能力、位置和效应估计的准确程度等。同

22、时位置和效应估计的准确程度等。同时,QTL作图作图一般要经过世代分离、标记检测、数量性状值一般要经过世代分离、标记检测、数量性状值测定和统计分析等多个环节测定和统计分析等多个环节, 因而因而QTL作图精作图精度会受到许多因素的影响。度会受到许多因素的影响。 111 何小红等何小红等(2001) 认为：认为：( 1)在在QTL发现能力上，适当发现能力上，适当大标记密度较有利于大标记密度较有利于QTL的检测的检测,过大或过小都不利；随过大或过小都不利；随着遗传力提高和样本容量变大发现着遗传力提高和样本容量变大发现QTL能力提高，但效能力提高，但效率下降。如率下降。如QTL的遗传力为的遗传力为10%

23、，标记间距，标记间距15cM，则样，则样本容量本容量300就可保证就可保证QTL的发现能力达的发现能力达80%以上。以上。(2)只只要标记间距不过大，一般来说，一旦要标记间距不过大，一般来说，一旦QTL能被检测到，能被检测到，则其位置和效应的估计也较准确，其位置估计值的则其位置和效应的估计也较准确，其位置估计值的95%置信区间绝大多数在置信区间绝大多数在20cM之内。之内。 112Chr.2Chr.1Chr.3Chr.4Chr.5113Chr.6Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10QTL detected for grain yieldQTL detected for ear lengt

24、hQTL detected for kernels weightQTL detected for row numberNote:114115l分子标记辅助选择分子标记辅助选择116117 利用利用MAS的遗传基础的遗传基础MRmr供体供体受体受体目标基因与目标基因与DNA标记间标记间的遗传距离为的遗传距离为p一一一一mr一一一一亲本中亲本中DNA标记的带型标记的带型F1杂种中杂种中DNA标记的带标记的带型型一一一一一一一一MR在在F2分离群体中分子标记类分离群体中分子标记类型，即型，即MM、Mm和和mm型型118 在分子标记为在分子标记为MM群体中，大群体中，大多数个体由于连锁应携带该抗病基因

25、多数个体由于连锁应携带该抗病基因R，若重组值为，若重组值为p，其基因型纯合时，即，其基因型纯合时，即RR的概率为的概率为（1-p）2，杂合基因型，杂合基因型Rr的概率为的概率为2p（1-p），而错选率，而错选率rr仅为仅为p2。119 2.MAS的的基本条件基本条件 分子标记与目标基因的遗传距离应是共分离或紧分子标记与目标基因的遗传距离应是共分离或紧密连锁（一般要小于密连锁（一般要小于5cM才能有效用于才能有效用于MAS） 简便快捷的简便快捷的DNA自动化提取方法及检测方法。自动化提取方法及检测方法。所用分子标记类型最好是所用分子标记类型最好是PCR标记；标记； 检测技术在不同的实验室或研究者

26、间应有很高检测技术在不同的实验室或研究者间应有很高的重复性，且经济实用；的重复性，且经济实用； 最好有一套能准确进行数据分子的统计软件。最好有一套能准确进行数据分子的统计软件。 120二、进行二、进行MAS育种的限制因素及改进措施育种的限制因素及改进措施1212. 降低成本办法降低成本办法122 夏军红等（夏军红等（2002）利用分子标记对玉米）利用分子标记对玉米S胞质雄性不育的恢复基因胞质雄性不育的恢复基因Rf3进行回交选择，进行回交选择，在在HSBC1F1群体中，通过一代标记辅助选择群体中，通过一代标记辅助选择，可育单株遗传背景与轮回亲本最高相似程度，可育单株遗传背景与轮回亲本最高相似程度

27、已达到已达到83.9%；在；在MYBC3F1群体中，通过一群体中，通过一代表型选择和两代代表型选择和两代MAS，可育单株遗传背景与，可育单株遗传背景与轮回亲本最高相似程度已达到轮回亲本最高相似程度已达到98%。 MAS应用实例应用实例123 Stuber等（等（1995）利用）利用MAS将决定玉米高产的主效基因从自交将决定玉米高产的主效基因从自交系系TX303转移到转移到B73，OH43转移到转移到Mo17，育成的新自交系，育成的新自交系“增强增强B73”和和“增强增强Mo17”，二者配制的杂交种，二者配制的杂交种较对照增产较对照增产15%。124 研究表明，在一个有研究表明，在一个有100个

28、个体个个体的回交后代群体中，借助的回交后代群体中，借助100个个RFLP标记选择，只需标记选择，只需3代就可使后代的基代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的因型回复到轮回亲本的99.2，而利，而利用常规回交转育的方法则需要选择用常规回交转育的方法则需要选择7代才能达到，大大缩短了育种时间。代才能达到，大大缩短了育种时间。125126（一）、多重（一）、多重PCRPCR法法127实例：实例：128129130131四、四、MASMAS技术在育种程序中的应用技术在育种程序中的应用132I I、利用利用MASMAS对目标性状进行回交转对目标性状进行回交转育的两个基本过程：育的两个基本过程：133134

29、IIII、利用、利用MASMAS技术进行回交转育的基本程序技术进行回交转育的基本程序1351 1、合适分子标记的选择、合适分子标记的选择1362 2、亲本多态性筛选、亲本多态性筛选137138139140141III、分子标记辅助的回交育种模式图、分子标记辅助的回交育种模式图142143五、五、MASMAS技术在作物育种程序中成功应用的实例技术在作物育种程序中成功应用的实例144 将多个基因利用分子标记辅将多个基因利用分子标记辅助选择的方法，整合到一个新的材助选择的方法，整合到一个新的材料中，从而创造一个含有多个有利料中，从而创造一个含有多个有利基因的新材料或自交系的方法。基因的新材料或自交系

30、的方法。l 基因聚合基因聚合145（一）、目标质量性状的选择（一）、目标质量性状的选择146（一）、目标质量性状的选择（一）、目标质量性状的选择147（二）、（二）、QTL(Quantitative Trait Locus)QTL(Quantitative Trait Locus)的选择的选择148影响准确辅助选择影响准确辅助选择QTLQTL的因素：的因素：149六、用于六、用于MASMAS的育种策略的育种策略1501 1、基本原理、基本原理1512 2、基本步骤、基本步骤152七、分子标记用于作物遗传多样性分析七、分子标记用于作物遗传多样性分析153l 分子标记在种子生产中分子标记在种子生产

31、中的应用的应用154品种鉴定品种鉴定 Hu和和Quiros等（等（1991）利用）利用4个随机引物鉴别个随机引物鉴别14个青花菜和个青花菜和12个个花椰菜品种；南京农业大学发现利用一花椰菜品种；南京农业大学发现利用一个引物个引物OPP-09可把可把9个棉花品种区个棉花品种区分开。分开。155 种子纯度的鉴定种子纯度的鉴定利用利用SSR分子标记对玉米杂交种农大分子标记对玉米杂交种农大108的纯度进行鉴定的纯度进行鉴定156品种保护中的应用品种保护中的应用157恢复型不育胞质杂交种的鉴定恢复型不育胞质杂交种的鉴定 玉米生产上利用雄性不育胞质杂交种玉米生产上利用雄性不育胞质杂交种的途径主要有：的途径

32、主要有：1、全恢复型不育胞质杂交、全恢复型不育胞质杂交种；种；2、“两系法两系法”，即不育胞质杂交种和，即不育胞质杂交种和正常胞质杂交种按照一定比例进行掺和。正常胞质杂交种按照一定比例进行掺和。158 CMS-T-F: 5-CAT GAA ATG GGT GAA GTC TCT TTC-3CMS-T-R: 5-AAG AGA AAG GGA GAC TTT GGT CCC-3CMS-C-F: 5-ATG CTA ATG GTG TTC CGA TTC C-3CMS-C-R: 5-AGC ATC ATC CAC ATT CGC TAG-3CMS-S-F: 5-CAA CTT ATT ACG AG

33、G CTG ATG C-3CMS-S-R: 5-AGT TCG TCC CAT ATA CCC GTA C-3 根据玉米不育系线粒体根据玉米不育系线粒体DNA的的R区重区重复序列，分别设计了玉米复序列，分别设计了玉米T、C和和S三种不育三种不育胞质的特定引物，可以通过胞质的特定引物，可以通过PCR的方法准确的方法准确鉴定杂交种中不育胞质杂交种的类型及比例鉴定杂交种中不育胞质杂交种的类型及比例。159C型不育胞质杂交种农大型不育胞质杂交种农大3138的鉴的鉴定定C型不育胞型不育胞质农大质农大3138正常胞质杂交正常胞质杂交种农大种农大3138160l 分子标记在杂种优势研究分子标记在杂种优势研究

34、中的应用中的应用161162 王庆东（王庆东（2003）利用）利用SSR标记将标记将16个玉米自交系分成个玉米自交系分成8个类，分别为唐四平头个类，分别为唐四平头群群 （黄早（黄早4、K12 ） ， Reid群群 （掖（掖478和和郑郑58 ） ， 旅大红骨群（丹旅大红骨群（丹340、郑、郑22）、）、 Lancaster群群 （ Mo17 ） ，自，自330群（自群（自330）、）、 综合种选系（综合种选系（ N808和综和综3 ） ，亚热带，亚热带种质（种质（ Pop49、8085 ）以及温热群）以及温热群 （豫（豫87-1、豫、豫87-3、P138、许、许178 ） 。 分子标记在玉米杂种优势分子标记在玉米杂种优势类群中的应用类群中的应用163Coefficient0.180.560.941.321.70huangzao4 po