生化物质的制备

1、提取与沉淀分离技术提取与沉淀分离技术化学与生命科学学院化学与生命科学学院生化分析与实验生化分析与实验 生化物质（生命大分子物质）生化物质（生命大分子物质）通常是指通常是指动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈代谢时，所形成的蛋白质（包括酶）和核酸代谢时，所形成的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。等有机化合物的总称。 生化物质的提取与沉淀分离技术生化物质的提取与沉淀分离技术 生化物质的特点：生化物质的特点：1、生化物质、生化物质组成非常复杂组成非常复杂。其中包括数百种甚至。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物数千种化合物，并且

2、在分离过程中，这些化合物仍仍在发生代谢变化在发生代谢变化，如，如 蛋白质和核酸的水解。蛋白质和核酸的水解。2、有些化合物的、有些化合物的含量极微含量极微，如激素等。，如激素等。3、许多具有、许多具有生物活性生物活性的物质一旦离开活体，很易的物质一旦离开活体，很易变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。第一节第一节 生物材料的选择生物材料的选择n（一）选择生物材料的原则：（一）选择生物材料的原则： 有效成分含量多，稳定性好； 来源丰富，保持新鲜； 提取方法简单； 有综合利用价值等。n（二）生物材料一般可以分为两大类：（二）生物材料一般可以分为两大类

3、： 天然生物材料 人工生物材料n天然生物材料天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。n人工生物材料人工生物材料又分为三种： 1、新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料n（三）蛋白质原料的选择（三）蛋白质原料的选择 如何提高制备如何提高制备天然蛋白质的品质、天然蛋白质的品质、产量和降低成本？产量和降低成本？种属、发育阶段、生物状态、来源、解种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位剖部位、生物技术产品的宿主菌宿主菌或细胞细胞1 1种属种属 猪胰脏中 单位含量3000 IUkg牛胰脏中 单位含量4000 IUkg 抗原性方面猪胰岛素比牛胰岛素低，

4、前者与抗原性方面猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有人胰岛素相比，只有1 1个个氨基酸的差异，而氨基酸的差异，而牛有牛有3 3个个氨基酸的差异。氨基酸的差异。胰岛素（胰岛素（isulin)isulin) PKPK2 2发育阶段发育阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄后幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。动物。 胸腺（胸腺（thyumsthyums）胸腺素调节免疫功能）胸腺素调节免疫功能3 3生物状态生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但素含量增加，对提取胰岛素

5、有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。汁的收集不利。 4 4原料来源原料来源 血管舒缓素血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。因其不含蛋白水解酶。 5 5原料解剖学部位原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含猪胰脏中，胰尾部分含激素激素较多，较多，而胰头部分含而胰头部分含消化酶消化酶较多。如分别摘取较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。则可提高各产品的收率。 胃膜素胃膜素以采取全胃粘膜为好，以采取

6、全胃粘膜为好，胃蛋白胃蛋白酶酶(pepsin)(pepsin)则以采取胃底部粘膜为好，则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。因胃底部粘膜富含消化酶。 6.6.从简化提纯步骤着手从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取如从鸽肝中提取乙酰化酶乙酰化酶，需，需将动物饥饿后取材，可减少肝糖将动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。原，以简化纯化步骤。7 7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。胞也应考虑到后处理的问题。 大肠杆菌大肠杆菌表达；（分泌，毒素）表达；（分泌，毒素）

7、 枯草杆菌枯草杆菌或或酵母菌酵母菌表达；（糖基化）表达；（糖基化） 动物细胞动物细胞和和昆虫细胞昆虫细胞表达表达第二节第二节 细胞及组织的破碎细胞及组织的破碎 细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的细胞破碎方法：和材料的不同可以采用不同的细胞破碎方法：（一）机械破碎方法：（一）机械破碎方法： 主要通过机械运动所产生的剪切力的作用，使组主要通过机械运动所产生的剪切力的作用，使组织或细胞破碎的方法织或细胞破碎的方法。 捣碎法、研磨法、匀浆法捣碎法、研磨法、匀浆法（二）物理破碎方法（二）物理破碎方法1.1.温度差破碎法（反复冻融

8、法）温度差破碎法（反复冻融法） 把待破碎的样品把待破碎的样品迅速冷迅速冷至至15152020，使之凝固，然后使之凝固，然后缓慢地溶解缓慢地溶解，如此反复操作，如此反复操作，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可以破碎。大部分组织细胞及细胞内的颗粒可以破碎。也采用先高温然后突然冷冻的方法。也采用先高温然后突然冷冻的方法。通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。使组织细胞破碎的方法。 2. 2. 压力差破碎法压力差破碎法高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法 加气压或水压达加气压或水压达20.5920.5934.32MPa34.32MPa的压

9、力时，的压力时，可使可使90%90%以上细胞被压碎。以上细胞被压碎。（1.013105 Pa10.336m水柱）3 3超声波处理法超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。（三）化学破碎法（三）化学破碎法有机溶剂：有机溶剂：可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性。表面活性剂：表面活性剂：表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。 较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、去氧胆酸钠、特立顿（Triton）、吐温（Tween）等。1. 1.

10、自溶法自溶法 即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。 自溶的温度，动物材料选在04，微生物材料则多在室温下进行。（四）酶促破碎法（四）酶促破碎法 通过细胞本身的酶系本身的酶系或外加酶制剂外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏。2 2酶处理法酶处理法 用外来酶处理生物材料： 溶菌酶溶菌酶是专一地破坏革兰氏阳性菌细胞壁的酶； - -葡聚糖酶葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎； 用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶糖酶等。第三节第三节 生物分子的提取生物分子的提

11、取提取：提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）是指在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充分溶解到溶剂（溶液）中的过程，也称为中的过程，也称为抽提。抽提。提取液应具备的条件提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等价格低廉、操作安全等。 生物分子可以分为：生物分子可以分为： 生物大分子生物大分子和和生物小分子生物小分子 生物小分子生物小分子的结构由较强的共价键决定； 生物大分子生物大分子中除共价

12、键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。（一）提取方法（一）提取方法1. 盐溶液提取：盐溶液提取：盐溶现象盐溶现象与与盐析现象盐析现象2. 酸溶液提取酸溶液提取3. 碱溶液提取碱溶液提取4.有机溶剂提取有机溶剂提取 分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子离散，溶入水中。子离散，溶入水中。（二）影响提取的因素（二）影响提取的因素1. 1. 溶解度（溶剂的性质）：溶解度（溶剂的性质）：根据相似相溶原理2. 2. 扩散速度：扩散速度：与温度、黏

13、度、扩散面积、扩散距离、浓度差有关。3. 3. 温度：温度：注意蛋白、核酸等分子的变性失活。4.4. PHPH值：值：等电点等电点（pI） 两性电解质5. 5. 提取液的体积：提取液的体积：提取液为原料液的3-5倍，多次提取第四节：第四节：生物分子的浓缩生物分子的浓缩（沉淀分离）（沉淀分离）n1 1、沉淀法、沉淀法: :是通过改变某些条件或添加某种物是通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，再经过离心或过滤收集沉淀物。沉淀析出，再经过离心或过滤收集沉淀物。n A.A.盐析法；盐析法； 硫酸铵硫酸铵 盐析注意事项盐

14、析注意事项n B.B.等电点沉淀法；等电点沉淀法；pI（isoelectric point） n C.C.有机溶剂沉淀法；有机溶剂沉淀法；乙醇，异丙醇乙醇，异丙醇n D.D.复合沉淀法；复合沉淀法； PEGPEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）n E.E.金属盐沉淀法；金属盐沉淀法；n F. F. 选择性变性沉淀法。选择性变性沉淀法。 蛋白质分子表面的疏水性区域都聚集许多水分子，当蛋白质分子表面的疏水性区域都聚集许多水分子，当大量盐类加入时这些水分子被抽出，以便与盐离子进大量盐类加入时这些水分子被抽出，以便与盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域相互结合形成沉淀。行水合，暴露出来的疏水性区域相互结合形成

15、沉淀。n2 2、吸附法：、吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。n 3、超过滤法：、超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。4. 4. 透析浓缩法透析浓缩法n1 1、原理：、原理：n 天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差时，小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不断去除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。n影响透析的因素影响透析的因素 1 1、半透膜的通透性：、半透膜的通透性：半透膜的通透性取决于膜孔径的大小，在能阻碍大分子扩散

16、的前提下，孔径越大，透析速度越快。 2 2、透析外液的更换、透析外液的更换 3 3、温度：、温度：温度越高，透析速度越快。 4 4、压力：、压力：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。n5 5、减压蒸馏浓缩法：、减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。旋转蒸发仪旋转蒸发仪6 6、冰冻干燥法、冰冻干燥法浓缩实例浓缩实例（一）、硫酸氨盐析法（一）、硫酸氨盐析法1.1.原理：原理： 根据蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着根据蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，增高到

17、一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，盐析的发生在于盐浓度增直至蛋白质析出，盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐水化膜逐渐被破坏渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。集并从溶液中析出。2 2、影响蛋白质盐析的因素、影响蛋白质盐析的因素（）蛋白质浓度对盐析的影响：（）蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%的蛋

18、白质浓度较适中。（）离子强度和离子类型对盐析的影响：（）离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。（）对盐析的影响：（）对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。（二）、有机溶剂沉淀法（二）、有机溶剂沉淀法n1 1、原理：、原理：n 有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。淀作用。n 对于具有表面水层的生物大