第11章抗生素类药物的分析

1、第十一章第十一章 抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析 （Analysis of Antibiotics Drugs）第一节第一节 概概 述述一、抗生素药物的特点一、抗生素药物的特点v 抗生素抗生素： 是指是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异性在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异性抑制作用的化学物质的总称抑制作用的化学物质的总称”。 v 来源来源：主要为微生物发酵合成，其次是半合成或化学合成。主要为微生物发酵合成，其次是半合成或化学合成。v 药物特点药物特点 1化学纯度较低化学纯度较低: 主要由三种现象所导致，即主要由三种现象所导致，即“同系物多、异构体多同系物多、异构体多和

2、降解物多和降解物多” 。2活性组分易发生变异：活性组分易发生变异： 如组分变化、组成变化如组分变化、组成变化3稳定性差：因抗生素分子中多含有活泼基团所致。稳定性差：因抗生素分子中多含有活泼基团所致。二、抗生素药物的质量分析：鉴别、检查、含量（效价）二、抗生素药物的质量分析：鉴别、检查、含量（效价）v 方法方法：理化方法、生物学方法：理化方法、生物学方法（一）（一） 鉴别试验鉴别试验 1 官能团的显色反应官能团的显色反应 2 光谱法：光谱法：UV、IR 3 色谱法：色谱法：TLC、HPLC 4生物学法：检查抗生素灭活前后的抑菌能力，将其与对照品生物学法：检查抗生素灭活前后的抑菌能力，将其与对照品

3、比较进行鉴别。比较进行鉴别。 （二）（二）检查检查检查项目包括：检查项目包括：1）影响产品稳定性的指标；）影响产品稳定性的指标；2）控制有机或无机）控制有机或无机杂质的指标：杂质的指标：3 ） 与临床安全性密切相关的指标；与临床安全性密切相关的指标；4）其他指标）其他指标（三）含量测定或效价测定（三）含量测定或效价测定1 、微生物检定法微生物检定法 原理原理：以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量其效价。：以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量其效价。特点特点：1）灵敏度高；）灵敏度高；2）测定原理与临床应用的要求一致，更）测定原理与临床应用的要求一致，更能体现其医疗价值；能体现其

4、医疗价值；3）适用范围广（纯品、粗制品、混合品）适用范围广（纯品、粗制品、混合品等）；等）；4）操作烦琐、误差大，表现出逐渐被理化方法所代替的）操作烦琐、误差大，表现出逐渐被理化方法所代替的趋势。趋势。2 、理化方法理化方法：各国药典主要采用：各国药典主要采用HPLC法测定提纯的产品以及药法测定提纯的产品以及药学结构已明确的抗生素。学结构已明确的抗生素。 3 、抗生素活性表示方法抗生素活性表示方法： 以效价单位即以效价单位即“单位单位(u)”或或“微克微克( g）”表示，其效价单位的基准对于各种抗生素的规定各异。表示，其效价单位的基准对于各种抗生素的规定各异。 例例：青霉素钠：青霉素钠1mg=

5、1670u, 庆在霉素庆在霉素1mg=590u三、抗生素的分类三、抗生素的分类在工业生产和质量控制分析中，常用化学结构进行分类，可分为：在工业生产和质量控制分析中，常用化学结构进行分类，可分为：1） -内酰胺环（青霉素、头孢菌素类）；内酰胺环（青霉素、头孢菌素类）；2） 氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素、卡那霉素等）；氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素、卡那霉素等）；3） 四环素类（四环素、金霉素、土霉素等）；四环素类（四环素、金霉素、土霉素等）；4） 大环内酯类（红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等）；大环内酯类（红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等）；5） 多烯大环类（制霉菌素、两性霉素多烯大环类（制霉菌素、两性霉

6、素B等）；等）；6） 多肽类（多粘菌素、放线菌素等）；多肽类（多粘菌素、放线菌素等）；7） 苯烃胺类（氯霉素等）；苯烃胺类（氯霉素等）；8） 蒽环类（阿霉素、紫红霉素等）。蒽环类（阿霉素、紫红霉素等）。9）其它抗生素）其它抗生素第二节第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素主要包括主要包括：青霉素族（：青霉素族（PC）、）、头孢菌素族（头孢菌素族（CEP）两大类两大类一、化学结构与性质一、化学结构与性质1、化学结构、化学结构化学结构的特点化学结构的特点1）分子结构由母核与侧链（）分子结构由母核与侧链（RCO-)构成构成母核：由母核：由A环（环（ 内酰胺环）与内酰胺环）与B环（氢化噻唑环或氢化噻环（

7、氢化噻唑环或氢化噻嗪环）骈合而成。嗪环）骈合而成。 青霉素族（青霉素族（PC）的母核的母核： 6-氨基青霉烷酸（氨基青霉烷酸（i.e. 6-APA） 头孢菌素（头孢菌素（CEP）族的母核族的母核： 7-氨基头孢菌烷酸氨基头孢菌烷酸(i.e. 7-ACA）2）含有一个游离羧基和一个酰胺侧链。含有一个游离羧基和一个酰胺侧链。3）具有手性碳原子：）具有手性碳原子：PC有三个有三个(C3、C5、C6)；CEP为两个为两个(C6、C7)。2、 性性 质质（1）酸性与溶解度酸性与溶解度；游离羧基有较强的酸性、易于成盐。碱金属游离羧基有较强的酸性、易于成盐。碱金属盐易溶于水，青霉素有机碱盐难溶于水，易溶于有

8、机溶剂。盐易溶于水，青霉素有机碱盐难溶于水，易溶于有机溶剂。 （2）旋光性旋光性；青霉素、头孢菌素类分子中均含有手性碳原子，它们青霉素、头孢菌素类分子中均含有手性碳原子，它们均具有旋光性，据此可以进行定性定量分析。均具有旋光性，据此可以进行定性定量分析。 （3）紫外吸收光谱紫外吸收光谱青霉素类青霉素类分子中母核无离域共轭体系，侧链分子中母核无离域共轭体系，侧链R中若存在紫外活性中若存在紫外活性的共轭系统，则青霉素即表现出特征光谱。的共轭系统，则青霉素即表现出特征光谱。例：青霉素钾（钠），例：青霉素钾（钠），R为苄基，其水溶液在为苄基，其水溶液在264nm处存在较强吸收。处存在较强吸收。头孢菌素

9、类头孢菌素类分子的母核中存在分子的母核中存在O=C-N-C=C紫外光谱活性基困，故紫外光谱活性基困，故该类抗菌素均表现为光谱活性。该类抗菌素均表现为光谱活性。例：头孢氨苄，水溶液在例：头孢氨苄，水溶液在262nm处有紫外吸收。处有紫外吸收。 （4） 内酰胺环的不稳定性内酰胺环的不稳定性 内酰胺环是该类药物结构最不稳定的部分，其稳定性与含水量和纯内酰胺环是该类药物结构最不稳定的部分，其稳定性与含水量和纯度相关。度相关。在水溶液中在水溶液中： 内酰胺环易受亲核或亲电试剂进攻（例：酸、内酰胺环易受亲核或亲电试剂进攻（例：酸、碱、青霉素酶、金属离子等），使该环分解或发生分子重排，从而失碱、青霉素酶、金

10、属离子等），使该环分解或发生分子重排，从而失去抗菌活性。去抗菌活性。在干燥纯净的固体中在干燥纯净的固体中：它们却表现出较强的稳定性，这正是该类：它们却表现出较强的稳定性，这正是该类制剂保存的有利因素。制剂保存的有利因素。两类的比较两类的比较：在相同条件下，头孢菌素类将表现出比青霉素类较：在相同条件下，头孢菌素类将表现出比青霉素类较强的稳定性。但酸、碱、强的稳定性。但酸、碱、 内酰胺酶、胺类均能加速头孢菌素族分子内酰胺酶、胺类均能加速头孢菌素族分子的降解。的降解。 二、鉴别试验二、鉴别试验（一）呈色反应（一）呈色反应 1羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应 原理青霉素或头孢菌素在碱性介质中，分子中的酰胺基与

11、盐酸原理青霉素或头孢菌素在碱性介质中，分子中的酰胺基与盐酸羟胺作用产生羟肟酸，该产物再与酸性硫酸铁胺的羟胺作用产生羟肟酸，该产物再与酸性硫酸铁胺的Fe3+络合产生红色络合产生红色络合物而呈色。络合物而呈色。例：头孢哌酮呈红棕色，其反应式为例：头孢哌酮呈红棕色，其反应式为 2类似肽键的反应（茚三酮反应）：类似肽键的反应（茚三酮反应）：有些侧链取代基有些侧链取代基RCONH结构中存在结构中存在 氨基酸结构（如氨基酸结构（如R为氨苄基的氨苄西为氨苄基的氨苄西林、头孢氨苄）的药物可发生林、头孢氨苄）的药物可发生茚三酮反应。茚三酮反应。 3其他呈色反应其他呈色反应：硫酸硫酸硝酸反应硝酸反应：头孢菌素能与

12、硫酸：头孢菌素能与硫酸硝酸发生呈色反应。如：硝酸发生呈色反应。如：头孢噻吩钠呈红棕色，头孢氨苄呈黄色。头孢噻吩钠呈红棕色，头孢氨苄呈黄色。硫酸硫酸甲醛呈色反应甲醛呈色反应：先后分别在冷和热硫酸甲醛中观察：先后分别在冷和热硫酸甲醛中观察药物溶液的颜色变化（见下表）。药物溶液的颜色变化（见下表）。 （二）各种盐的反应（二）各种盐的反应1钾盐、钠盐的火焰反应钾盐、钠盐的火焰反应2重氮化偶合反应重氮化偶合反应：在青霉素类及其盐中，若能产生在青霉素类及其盐中，若能产生芳胺或芳烃胺，则能利用重氮化偶合反应生成偶氮染料红芳胺或芳烃胺，则能利用重氮化偶合反应生成偶氮染料红色沉淀。色沉淀。例例：青霉素的有机盐：

13、普鲁卡因青霉素、苄星青霉素的水：青霉素的有机盐：普鲁卡因青霉素、苄星青霉素的水溶液经酸化后，分别显出芳胺、芳烃胺的重氮化溶液经酸化后，分别显出芳胺、芳烃胺的重氮化偶合反偶合反应。应。普鲁卡因青霉素：普鲁卡因青霉素：H2N-C6H5-COOCH2CH2-N(C2H5)2 PG-COOHH2O（三）光谱法（三）光谱法 1红外（红外（IR）吸收光谱。吸收光谱。 波数cm-1归属波数cm-1归属3470，3180酚羟基和酰胺O-H，N-H1585，1400羧基离子COO-31002600胺盐N+-H1620苯环C=C1780-内酰胺C=O1250酚羟基C-O1690仲酰胺C=O2紫外（紫外（UV）分光

14、光度法分光光度法 、利用、利用最大吸收波长最大吸收波长或或最大吸收波长吸收度最大吸收波长吸收度鉴定法；鉴定法； 、水解产物的最大吸收波长鉴定法。、水解产物的最大吸收波长鉴定法。（四）色谱法（四）色谱法适用性适用性：各国药典广泛采用色谱法对本类药物进行鉴别。：各国药典广泛采用色谱法对本类药物进行鉴别。1、薄层色谱（、薄层色谱（TLC）：）：对照品比较法，对照品比较法，主斑点主斑点的比移值的比移值（Rf）是否一致进行鉴别是否一致进行鉴别；2、高效液相色谱（、高效液相色谱（HPLC）：在含量测定项下，按标准品：在含量测定项下，按标准品对照法，对照法，HPLC中采用中采用主峰主峰保留时间（保留时间（t

15、R）对照是否一致进对照是否一致进行鉴别。行鉴别。 三、特殊杂质的检查三、特殊杂质的检查（一）聚合物（一）聚合物 示例：头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定示例：头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定色谱条件色谱条件色谱柱色谱柱: 用葡聚糖凝胶用葡聚糖凝胶G-10为填充剂，玻璃柱内径为填充剂，玻璃柱内径1.3-1.6cm，柱高度柱高度30-40cm；流动相流动相：A含含3.5%硫酸铵的硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.0)，B水；水；流速流速: 0.8ml/min;检检测波长：测波长：254nm；系统适用性试验系统适用性试验：分别以流动相：分别以流动相A和和B，以蓝色葡聚糖以蓝色葡聚

16、糖2000峰为标准，峰为标准，理论塔板数均不低于理论塔板数均不低于900，拖尾因子均小于，拖尾因子均小于2.0，两流动相时的保留时，两流动相时的保留时间比为间比为0.93-1.07；以；以B为流动相，重复进样，峰面积相对标准偏差应为流动相，重复进样，峰面积相对标准偏差应小于小于5.0%。方法方法：外标法：外标法（二）有关物质和异构体（二）有关物质和异构体示例：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查示例：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查异构体制备：头孢呋辛酯在加热、光照下分别制备含异构体制备：头孢呋辛酯在加热、光照下分别制备含3、E异构体。异构体。色谱条件色谱条件：分析柱：分析柱：ODS；流动相：

17、流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵磷酸二氢铵-甲醇（甲醇（62：38）；流速：）；流速：1ml/min；检测波长检测波长278nm。系统适用系统试验系统适用系统试验：要求头孢呋辛酯：要求头孢呋辛酯A、B异构体之间，异构体之间，A异构体与异构体与3-异构体之间的分离度大于异构体之间的分离度大于1.5；理论塔板数按头孢呋辛酯；理论塔板数按头孢呋辛酯A异构体异构体峰计算，应不低于峰计算，应不低于1500。方法方法：异构体：异构体A与与AB的峰面积之比应为的峰面积之比应为0.480.55有关物质高低浓度对照法，高浓度供试品中杂质峰面积有关物质高低浓度对照法，高浓度供试品中杂质峰面积之和不得大于低浓度供

18、试品中主峰的面积。之和不得大于低浓度供试品中主峰的面积。（三）吸收度（三）吸收度Ch.P中常用测定杂质的吸收度的方法来控制本类抗生素中常用测定杂质的吸收度的方法来控制本类抗生素的杂质含量。的杂质含量。 示例示例：青霉素钠（钾）的吸收度检查：青霉素钠（钾）的吸收度检查供试品的供试品的1.80mg/ml水溶液水溶液1）280nm处（杂质）：吸收度不得大于处（杂质）：吸收度不得大于0.102）264nm处（青霉素钠（钾）：有最大吸收，吸收处（青霉素钠（钾）：有最大吸收，吸收度应在度应在0.80-0.88。四、含量测定四、含量测定大多数采用理化方法，极少数使用微生物检定法大多数采用理化方法，极少数使用

19、微生物检定法Ch.P：HPLC、UV、碘量法、电位配位滴定法碘量法、电位配位滴定法（一）碘量法（一）碘量法1、原理：青霉素族或头孢菌素族分子本身不与碘发生反应，、原理：青霉素族或头孢菌素族分子本身不与碘发生反应，不消耗碘。但是，它们的降解产物将与碘发生氧化还原反应，不消耗碘。但是，它们的降解产物将与碘发生氧化还原反应，根据消耗的碘量可以定量分析相应的根据消耗的碘量可以定量分析相应的 内酰胺类抗生素。反应内酰胺类抗生素。反应分为两步进行。分为两步进行。2、讨论、讨论（1）CEP族药物与族药物与PC族一样，也按两步进行。族一样，也按两步进行。（2）反应第一步的水解反应按化学计量完全反应。）反应第一

20、步的水解反应按化学计量完全反应。（3）第二步反应的摩尔比关系易受温度、）第二步反应的摩尔比关系易受温度、pH值、反应时间等因素影响：值、反应时间等因素影响： 一般情况下，温度一般情况下，温度2426C，pH4.5，加碘液后避光放置加碘液后避光放置1520min。（4）通常需要作标准品平行对照实验：消除因条件控制差异而导致的）通常需要作标准品平行对照实验：消除因条件控制差异而导致的实验误差。实验误差。（5）用未经水解的供试品溶液作空白实验：校正）用未经水解的供试品溶液作空白实验：校正PC族的降解产物族的降解产物等杂质消耗碘而对测定结果的影响。等杂质消耗碘而对测定结果的影响。（6）近终点近终点加淀

21、粉指示剂，在强烈振摇下漫速滴定至蓝色消失：若消加淀粉指示剂，在强烈振摇下漫速滴定至蓝色消失：若消失的蓝色在振摇后又出现，说明还未到终点。失的蓝色在振摇后又出现，说明还未到终点。3测定方法测定方法示例：注射用普鲁卡因青霉素示例：注射用普鲁卡因青霉素1）方方 法法： 精密量取供试品水溶液置碘瓶加精密量取供试品水溶液置碘瓶加NaOH溶液，溶液，放置放置20min加加1mol/L盐酸溶液盐酸溶液1ml与醋酸与醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml精密加入碘滴定液精密加入碘滴定液15ml密塞、摇匀、密塞、摇匀、20-25暗处放置暗处放置20minNa2S2O3滴定液滴定滴定液滴定近终点近终点

22、加淀粉指示剂，继续滴定，至蓝色消失。加淀粉指示剂，继续滴定，至蓝色消失。2）空白试验空白试验：用供试品溶液在不加：用供试品溶液在不加NaOH溶液水解的情况下，溶液水解的情况下，作平行实验，消除供试品中能被碘氧化的杂质干扰。作平行实验，消除供试品中能被碘氧化的杂质干扰。3）对照实验对照实验：用青霉素标准品作平行实验，消除因条件控制：用青霉素标准品作平行实验，消除因条件控制的差异所导致的碘氧化反应的摩尔比的差异。的差异所导致的碘氧化反应的摩尔比的差异。（二）电位配位滴定法（二）电位配位滴定法基本原理基本原理：青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产：青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物如青霉噻唑

23、酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如铜物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如铜离子、汞离子形成稳定配位化合物，其可能结构为：离子、汞离子形成稳定配位化合物，其可能结构为：（1）（2）（3）电位配位滴定法电位配位滴定法：供试品碱水解硝酸汞滴定电位法指示：供试品碱水解硝酸汞滴定电位法指示终点（指示电极：铂；参比电极：汞硫酸亚汞）。终点（指示电极：铂；参比电极：汞硫酸亚汞）。讨论讨论：1水解必须完全水解必须完全：溶液：溶液pH值（值（4.6）与反应时间）与反应时间(放置放置15min)为关键参为关键参数。数。2用空白实验消除供试品中可能存在的降解产物而消耗滴定液的干扰用空白实验消除供试品中

24、可能存在的降解产物而消耗滴定液的干扰：用供试品作空白实验，仅仅是不经氢氧化钠水解，其它操作完全相同。用供试品作空白实验，仅仅是不经氢氧化钠水解，其它操作完全相同。3方法优势方法优势：与碘量法比较，汞量法测定青霉素不需要青霉素标准品作：与碘量法比较，汞量法测定青霉素不需要青霉素标准品作对照，汞盐滴定液用对照，汞盐滴定液用EDTA标定即可。标定即可。4、适用范围适用范围：普鲁卡因青霉素、苯唑西林钠、青霉素钠、青霉素钾、青：普鲁卡因青霉素、苯唑西林钠、青霉素钠、青霉素钾、青霉素霉素V钾等的含量测定。钾等的含量测定。（三）可见（三）可见-紫外分光光度法紫外分光光度法基本原理：青霉素类药物的降解产物青霉

25、烯酸具有紫外吸收性质，基本原理：青霉素类药物的降解产物青霉烯酸具有紫外吸收性质，在在320nm-360nm处有强烈吸收，但此水解产物不稳定，可加入处有强烈吸收，但此水解产物不稳定，可加入Cu2+或或Hg2+等与其生成稳定的配位化合物，再进行紫外分光光度等与其生成稳定的配位化合物，再进行紫外分光光度法测定。法测定。1硫醇汞盐法硫醇汞盐法原理：在咪唑的催化下，青霉素族抗生素与二氯化汞定量地反原理：在咪唑的催化下，青霉素族抗生素与二氯化汞定量地反应生成相应的应生成相应的青霉烯酸硫醇汞盐青霉烯酸硫醇汞盐，在，在324nm345nm波长范围内波长范围内有最大吸收。有最大吸收。方法：对照品比较法方法：对照

26、品比较法特点特点1）若青霉素侧链取代基上存在氨基，必须进行乙酰化保护。）若青霉素侧链取代基上存在氨基，必须进行乙酰化保护。2）方法的专属性强。）方法的专属性强。3）生成的光度法测定产物较为稳定，可稳定）生成的光度法测定产物较为稳定，可稳定3h以上。以上。4）重现性良好：相对标准差在）重现性良好：相对标准差在1%以内。以内。2、酸水解酸水解-铜盐法铜盐法青霉素族抗生素在弱酸性下水解，与青霉素族抗生素在弱酸性下水解，与Cu2+作用，形成较稳定的螯合作用，形成较稳定的螯合物，在物，在320nm处有最大吸收。处有最大吸收。3羟肟酸比色法羟肟酸比色法青霉素族和头孢菌素族抗生素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物

27、，在青霉素族和头孢菌素族抗生素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物，在稀酸中与高铁离子生成红色配位化合物，可在一定波长下测定吸收度而稀酸中与高铁离子生成红色配位化合物，可在一定波长下测定吸收度而进行定量。进行定量。（四）（四）HPLC法法HPLC法对本类药物的测定法对本类药物的测定：在各国药典中，：在各国药典中，HPLC法对其测定的种法对其测定的种类和数量越来越多。在类和数量越来越多。在ChP中收载本类抗生素原料及制剂共约中收载本类抗生素原料及制剂共约70种，其种，其中中HPLC法测定约占法测定约占78%，通常采用，通常采用RP-HPLC的外标法测定含量。的外标法测定含量。示例示例 头孢克洛头孢克洛H

28、PLC测定法测定法1）系统适用性试验：头孢克洛与头孢克洛）系统适用性试验：头孢克洛与头孢克洛-3-异构体的分离度应大于异构体的分离度应大于1.5。理论塔板数按头孢克洛峰计算应不低于。理论塔板数按头孢克洛峰计算应不低于1500。2）色谱条件：色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶；流动相）色谱条件：色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶；流动相KH2PO4溶液（溶液（pH3.4）-乙腈（乙腈（92：8）；流速）；流速1ml/min；检测波长检测波长254nm。3）方法：按外标法以峰面积计算其含量。）方法：按外标法以峰面积计算其含量。（五）生物样品中（五）生物样品中-内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析 分析方法分析

29、方法：色谱法、微生物法、放射免疫法：色谱法、微生物法、放射免疫法等，其中等，其中HPLC法应用较广，其特点表现为专属、法应用较广，其特点表现为专属、性强、灵敏度高、检测手段多元化。性强、灵敏度高、检测手段多元化。第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素（aminoglycosides antibiotics）本类抗生素的结构特点本类抗生素的结构特点： 化学结构都是以碱性环已多元化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷醇为苷元，与氨基缩合而成的苷。常见的本类抗生素常见的本类抗生素：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西

30、索米星、硫酸新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。依替米星等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。一、化学结构与性质一、化学结构与性质以链霉素、巴龙霉素、庆大霉素、奈替米星为例讲解其结构与性质以链霉素、巴龙霉素、庆大霉素、奈替米星为例讲解其结构与性质1化学结构化学结构链霉素的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的链霉素的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷碱性苷(两个强碱性的胍基与一个较弱碱性的甲基氨）两个强碱性的胍基与一个较弱碱性的甲基氨）。庆大霉素是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的庆大霉素是由绛红

31、糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷，表现为碱性苷（苷，表现为碱性苷（5个弱碱性氨基，其强度相似）。个弱碱性氨基，其强度相似）。庆大霉素药物庆大霉素药物：是庆大霉素：是庆大霉素C的复合物的复合物, 其主要成分为其主要成分为C1，C2、C1a, C2a，它们的结构表现在取代基它们的结构表现在取代基R1, R2和和R3的差异上。的差异上。 2性质性质（1）溶解度与碱性：碱性、水溶性抗生素，常为硫酸盐形式。）溶解度与碱性：碱性、水溶性抗生素，常为硫酸盐形式。 （2）旋光性：本类抗生素分子结构中含有多个氨基糖，具有）旋光性：本类抗生素分子结构中含有多个氨基糖，具有旋光性。旋光性。（3）苷的水解与稳定

32、性：一般在过酸或过碱条件下易水解失效。）苷的水解与稳定性：一般在过酸或过碱条件下易水解失效。（4）紫外吸收光谱：链霉素在）紫外吸收光谱：链霉素在230nm处有紫外吸收。其他无处有紫外吸收。其他无紫外吸收。紫外吸收。二、鉴别试验二、鉴别试验（一）茚三酮反应（一）茚三酮反应原理：在氨基糖苷结构中的羟基氨具有原理：在氨基糖苷结构中的羟基氨具有a氨基酸的性质，可与茚三氨基酸的性质，可与茚三酮显色。酮显色。Ch.P：硫酸核糖霉素、硫酸庆大霉素硫酸核糖霉素、硫酸庆大霉素（二）（二）Molisch试验试验基本原理基本原理：具有五碳或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸：具有五碳或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸

33、水解后，在盐酸或硫酸作用下脱水，生成糠醛（五碳糖）或羟水解后，在盐酸或硫酸作用下脱水，生成糠醛（五碳糖）或羟甲基糠醛（六碳糖），此类产物将与甲基糠醛（六碳糖），此类产物将与a-萘酚或蒽酮显色。萘酚或蒽酮显色。1-萘酚呈色萘酚呈色2蒽酮呈色（三）（三）N-甲基葡萄糖胺反应（甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）反应）基本原理基本原理：氨基糖苷类抗生素药物经（酸）水解，产生葡萄糖胺衍生：氨基糖苷类抗生素药物经（酸）水解，产生葡萄糖胺衍生物，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合生成吡咯衍生物（物，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合生成吡咯衍生物（），再与对二甲），再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（氨基苯甲醛

34、的酸性醇溶液（Ehrlich试剂）反应，吡咯衍生物的多羟基试剂）反应，吡咯衍生物的多羟基断开，生成红色缩合物（断开，生成红色缩合物（）。）。v例例：链霉素水解为：链霉素水解为N-甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素水解为甲基葡萄糖胺，硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素水解为D-葡萄糖胺，它们均有此反应。葡萄糖胺，它们均有此反应。（四）麦牙酚（四）麦牙酚（Maltol）反应反应基本原理基本原理：麦牙酚与高铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位：麦牙酚与高铁离子在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物而呈色，此为链霉素的特征反应。化合物而呈色，此为链霉素的特征反应。麦牙酚的生成麦牙酚的生成：在碱性溶液中，链霉素结构

35、中的链霉糖经分子：在碱性溶液中，链霉素结构中的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍而生成麦牙酚（霉胍而生成麦牙酚（-甲基甲基-羟基羟基-吡喃酮）。吡喃酮）。（五）坂口反应（五）坂口反应基本原理基本原理：此为链霉素的水解产物：此为链霉素的水解产物链霉胍的特有反应链霉胍的特有反应。链霉素溶液经。链霉素溶液经氢氧化钠水解生成链霉胍，链霉胍和氢氧化钠水解生成链霉胍，链霉胍和8-羟基喹啉（或羟基喹啉（或-萘酚）萘酚）分别分别与与次溴酸钠反应，其各自产物再相互作用生成橙红色化合物而呈色。次溴酸钠反应，其各自产物再相

36、互作用生成橙红色化合物而呈色。（六）其它方法（六）其它方法硫酸盐反应（因本类药物多为硫酸盐）硫酸盐反应（因本类药物多为硫酸盐）色谱法：薄层色谱法、色谱法：薄层色谱法、HPLC法法光谱法：光谱法：IR、UV注注：BP对庆大霉素的对庆大霉素的UV法鉴别：庆大霉素无共轭双键系统，法鉴别：庆大霉素无共轭双键系统，故在紫外区无紫外吸收。基于此，测定故在紫外区无紫外吸收。基于此，测定240-330nm范围范围内应内应无无UV吸收。吸收。三、特殊杂质检查及组分分析三、特殊杂质检查及组分分析（一）链霉素中链霉素（一）链霉素中链霉素B的检查的检查薄层板：硅胶薄层板：硅胶G薄层。薄层。展开剂：甲苯展开剂：甲苯-冰

37、醋酸冰醋酸-甲醇（甲醇（50：25：25）方法：以甘露糖为对照品进行标准对照法比较斑点的颜色。方法：以甘露糖为对照品进行标准对照法比较斑点的颜色。（二）奈替米星中有关物质检查（二）奈替米星中有关物质检查各国药典已对该类部分抗生素采用色谱法各国药典已对该类部分抗生素采用色谱法（HPLC或或TLC法）进法）进行有关物质的检查，行有关物质的检查，Ch.P主要采用主要采用TLC法。如硫酸奈替米星中有法。如硫酸奈替米星中有关物质检查采用标准品对照法，比较斑点颜色的深浅。关物质检查采用标准品对照法，比较斑点颜色的深浅。（三）组分测定（三）组分测定 本类药物多以同系物的混合物形式存在，而同系物的效价和毒性各

38、本类药物多以同系物的混合物形式存在，而同系物的效价和毒性各不相同，必须控制其相对含量，以保证药物质量。不相同，必须控制其相对含量，以保证药物质量。庆大霉素庆大霉素C组分测定组分测定1）中、英、美、日等国药典均规定控制庆大霉素中）中、英、美、日等国药典均规定控制庆大霉素中C1、C2、C1a、C2a各组分的相对百分含量。均采用各组分的相对百分含量。均采用HPLC法测定。法测定。2）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水剂；以水-冰醋酸冰醋酸-甲醇（甲醇（25：5：70）配制的）配制的0.02mol/L庚烷磺庚烷磺酸钠酸

39、钠溶液为流动相；检测波长为溶液为流动相；检测波长为330nm；理论塔板数按理论塔板数按C2组分组分计算应不低于计算应不低于2000。C2a和和C2峰的分离度应符合要求。重复进样，峰的分离度应符合要求。重复进样，其相对标准差（其相对标准差（RSD）应小于应小于2.0%。以内标。以内标-峰面积归一化法峰面积归一化法计算各组分的相对含量计算各组分的相对含量 。图谱图谱讨论讨论：（1）柱效：以）柱效：以C2峰计算，理论塔板数不得低于峰计算，理论塔板数不得低于2000。（。（2）流动相：流动相极性应适当控制（适当）流动相：流动相极性应适当控制（适当调节甲醇比例）：极性过强，出峰快，分离不佳；流调节甲醇比

40、例）：极性过强，出峰快，分离不佳；流动相极性过弱，出峰太慢。动相极性过弱，出峰太慢。（3）衍生化试剂（邻苯二醛、巯基醋酸）与）衍生化试剂（邻苯二醛、巯基醋酸）与330nm处有强吸收的吲哚衍生物的稳定性；处有强吸收的吲哚衍生物的稳定性；（4）离子对试剂浓度影响）离子对试剂浓度影响(注：庆大霉素常为硫酸盐注：庆大霉素常为硫酸盐形式形式）四、含量测定四、含量测定法定方法法定方法：目前各国药典对其效价的测定主要采用微生物检定：目前各国药典对其效价的测定主要采用微生物检定法。法。主要的研究方法主要的研究方法：多数研究者特别关注微生物法、免疫法、：多数研究者特别关注微生物法、免疫法、色谱法等定量分析方法。

41、色谱法等定量分析方法。测定中的检测方式测定中的检测方式：本类抗生素多数无紫外吸收，：本类抗生素多数无紫外吸收，不能直不能直接用紫外或荧光检测器接用紫外或荧光检测器，需进行柱前或柱后衍生化。采用的衍，需进行柱前或柱后衍生化。采用的衍生化试剂有邻苯二醛、生化试剂有邻苯二醛、1,2-萘醌萘醌-4-磺酸、磺酸、2,4,6-三硝基磺酸、三硝基磺酸、1-氟氟-2,4-二硝基苯、二硝基苯、9-芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。示例示例： 猪组织中庆大霉素和新霉素的猪组织中庆大霉素和新霉素的HPLC法法色谱条件色谱条件：Hypersil BDS C18分析柱；乙腈分析柱；乙腈-水（水（85：

42、15）为流）为流动相；流速动相；流速1.0ml/min；荧光检测器，荧光检测器，e x=260nm，em=315nm。样品处理样品处理：取样品（肝、肾、肌肉）适量，加磷酸盐缓冲液：取样品（肝、肾、肌肉）适量，加磷酸盐缓冲液（Ph=7.4），），室温孵育室温孵育1h，然后加然后加 三氯乙酸，匀浆三氯乙酸，匀浆30s，于于4下离心（下离心（3500r/min）15min，将上清液移置另一试管中，将上清液移置另一试管中，加离子对试剂（已烷磺酸钠溶液加离子对试剂（已烷磺酸钠溶液）。）。再经固相柱提取纯化，用乙再经固相柱提取纯化，用乙腈腈-0.02mol/L已烷磺酸钠（已烷磺酸钠（55：45）洗脱。洗脱

43、液与）洗脱。洗脱液与9-芴甲基芴甲基氯甲酸酯（氯甲酸酯（FMOC-Cl）混合，进行衍生化反应，混合，进行衍生化反应，15min后加甘后加甘氨酸中止反应，取适量进样测定。氨酸中止反应，取适量进样测定。图谱图谱结果与讨论结果与讨论：1）用）用FMOC-Cl衍生化可获得强荧光的衍生物，在衍生化可获得强荧光的衍生物，在pH8.0的条件下反应，衍生物可稳定在的条件下反应，衍生物可稳定在12h。见图见图11-7。2）测得庆大霉素各组分和新霉素的提取回收率在）测得庆大霉素各组分和新霉素的提取回收率在75%-86%之间；日内、日间之间；日内、日间RSD小于小于10%；检测限分别；检测限分别为为0.05g/g和

44、和0.1g/g（S/N=5）；）；定量限为检测定量限为检测限限2倍。在倍。在0.1g/g-1.0g/g范围内，被测组分浓度范围内，被测组分浓度与响应值之间呈良好的线性关系，与响应值之间呈良好的线性关系，r0.999。第四节第四节 四环素类抗生素四环素类抗生素（tetracyclines antibiotics ）这类抗生素有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。这类抗生素有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。一、化学结构与性质一、化学结构与性质结构中各取代基结构中各取代基R、R、R及及R的不同构成各种四环素类抗生素。的不同构成各种四环素类抗生素。常见结构如下：常见结构如下：(Z)(Z)RRRRN（CH3）2HOHCONH2OOHOHOOHABC2性质性质（1）酸碱性与溶解度：显弱碱性和显弱酸性，是两性化合物。）酸碱性与溶解度：显弱碱性和显弱酸性，是两性化合物。 （2）旋光性：具有不对称碳原子，因此有旋光性；）旋光性：具有不对称碳原子，因此有旋光性；（3）紫外吸收和荧光性质：）紫外吸收和荧光性质：（4）与金属离子形成配位化合物：）与金属离子形成