农杆菌介导法

1、第一页，共57页。农杆菌农杆菌感染柳树感染柳树产生产生冠瘿瘤冠瘿瘤第二页，共57页。原理：原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有TiTi质粒和质粒和RiRi质粒质粒，其上有一段，其上有一段T-DNAT-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将后，可将T-DNAT-DNA插入到植物基因组中。插入到植物基因组中。第三页，共57页。 因此，农杆菌是一种因此，农杆菌是一种天然天然的植物遗传转化体系。人们将的植物遗传转化体系。人们将目目的基因的基因插入到经过改造的插入到经过改造的T-DNAT-DNA区，借助农杆菌的感染实现区

2、，借助农杆菌的感染实现外外源基因源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。到了广泛应用。第四页，共57页。第五页，共57页。第六页，共57页。Story冠瘿瘤病冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形似帽状而得名。1907年， Smith & Town

3、sent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不 致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。60s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)第七页，共57页。1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒

4、(tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。第八页，共57页。Ti质粒第九页，共57页。Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.175 .4 um，分子质量为（90

5、150）106 Da。在温度低亍28的 条件下，Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。第十页，共57页。Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤 外，还具有以下几种重要功能：1赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力；2赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3根癌农杆菌的寄主植物范围；4决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分；5参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素 的代谢活.第十一页，共57页。1) Ti质粒的结构来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。Ti质粒携

6、带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。第十二页，共57页。第十三页，共57页。长度：160-250 kb6大功能区：1)致癌区，这个区主要合成植物 生长素和细胞分裂素；2)冠瘿碱合成区；3)冠瘿碱分解区；4)Ti质粒接合转移区(tra)；5)毒性区（Vir）；6)DNA复制区（Rep）。第十四页，共57页。T-DNA第十五页，共57页。在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24 bp直接重复序列，由这三部分所构成的DNA区域叫做T-

7、DNA，插入植物染色体中的Ti质粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物细胞染色体中的位置不相同的，因此植物染色体上可能并没有可供T-DNA插入的专一性DNA序列。第十六页，共57页。脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA的左右两侧是一段24bp的重复序列,构成T-DNA的边界序列(border sequence),分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中T-DNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。研究表明，插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染

8、色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。第十七页，共57页。T-DNA 区域中的这些基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才能激活表达.Tms1、Tms2、Tmr这3 个基因表达产物催化生成的植物生长素（ Tms1、Tms2 ）和细胞分裂素（ Tmr ）,可调节植物细胞的生长和发育,它们的过量表达刺激植物细胞大量快速增长而形成冠瘿.冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,构成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源.第十八页，共57页。Vir区区第十九页，共57页。Vir区（Vir-region），即毒性区，又称致瘤区域，其长度约为35kb。它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位

9、，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、vir、virC、 vir、vir和virG）。vir基因的控制着的转移。virvirvirC virG virvirA第二十页，共57页。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和-羟基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。第二十一页，共57页。目前已经发现9种信号因子，

10、均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子，而使T- DNA可以成功的转入；而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的基因，达到转基因的目的。第二十二页，共57页。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而

11、激活vir区其他基因表达。virA基因virG基因第二十三页，共57页。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。第二十四页，共57页。第二十五页，共57页。植物细胞受伤后，细胞壁破裂，分泌物中含有高浓度的创伤诱导分子。它们是一些酚类化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和-羟

12、基酰丁香酮（-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌农杆菌对这一类物质具有趋化性，在植物细胞表面附着后，受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒vir区毒性基因被激活和表达。第二十六页，共57页。最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接受环境中的信号分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状态，进而激活vir区其他基因表达。其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使单链T-DNA得

13、以释放。VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终整合进入植物核基因组。T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。第二十七页，共57页。Table1 Summary of vir Gene Products Locus Size(kb) ORFsa Proteins Size(kDa) Locationb FunctionvirA2.

14、0190Mplant signal sensor, protein kinaseVirG1.0130Ctranscriptional activatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein?nuclear localization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processing of T-DNA(VirC1)VirE2.027, 60.5C/M?single-strand DNA-binding protein (VirE2) virB9.51126,

15、12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNA transfer apparatus?第二十八页，共57页。T-DNA加工和转移加工和转移 Vir基因表达调控的问题，知道基因表达调控的问题，知道VirA和和VirG基因诱导其它基因诱导其它Vir基因的基因的表达，当表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和和VirD2蛋白质蛋白质具有核酸内切酶的活性具有核酸内切酶的活性(Yanofsky MF. 1986)，能够在，能够在T-DN A边界边界重复序列的特异位点切开重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此单链，因此T-DNA往往

16、以单链形式往往以单链形式进入植物细胞。但是在植物细胞中也发现双链进入植物细胞。但是在植物细胞中也发现双链T-DNA分子。分子。第二十九页，共57页。切刻位点切刻位点(nick site)可作为可作为DNA从从5向向3合成的起始位点，新合成的起始位点，新的的DNA链合成后，链合成后，T-DNA单链即被替换单链即被替换(displacement)释放释放出来出来(图图2)。当然这种缺刻也可通过重组系统把。当然这种缺刻也可通过重组系统把T-DNA双链从双链从Ti质粒上解离下来。质粒上解离下来。第三十页，共57页。缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移，而左边界重复序列的缺失会稍稍降

17、低T-DNA转移频率(Timmerman B1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右边界到左边界5向3替换合成中释放出来的。第三十一页，共57页。右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。第三十二页，共57页。可见T-DNA左边界序列作为合成DNA的起始位点的效率比右边界序列低。这种不同不是由于左右边界的24bp重复序列核苷酸不同，而是由于靠近右边界位置有一个转移增强子(transfer enhancer；overdri

18、verPeralta EG1986)存在。这个T-DNA转移增强序列能极其明显的增加农杆菌中T-DNA链形成，并且这种作用与它的位置、方向及距离均无关系。增强子的缺失能够使农杆菌对宿主植物的毒性降低。Toro等人发现VirC1蛋白能特异性的结合这个增强子，VirC操纵元的突变也能导致农杆菌的毒性减弱。第三十三页，共57页。当T-DNA单链进入植物细胞后，植物细胞如何处理这些单链DNA？Paul等 人利用电转移法把单链DNA转化到烟草原生质体中，结果表明，在植物细胞中， 单链DNA迅速转变成双链DNA分子。此外单链DNA比双链DNA的转化效率更 高。然而T-DNA分子并非以裸露的单链DNA形式进

19、入植物细胞的。T-DNA单链 的5端共价的结合着VirD2蛋白质，从而保护T-DNA分子免受外切核酸酶的降 解，此外VirD2蛋白质上含有核定位的序列，所以结合在T-DNA 5端的VirD2 蛋白质象一个“导向仪”(pilot)指引并保护T-DNA进入植物细胞核中。VirE2蛋白 质是一种单链结合蛋白质，能够包裹T-DNA单链，和其它T-DNA结合蛋白质共 同构成了T-复合体。第三十四页，共57页。冠瘿碱分解区第三十五页，共57页。冠瘿也是在冠瘿碱胞内合并成分泌出来的,被冠瘿碱分解基因分解成根癌农杆菌生长所须的碳源和氮源。第三十六页，共57页。载体第三十七页，共57页。植物是人类和所有动物赖以

20、生存的基础，因此开展植物基因工程的研究，建立起转基因植物新材料是十分重要的。象其它生物一样，植物的克隆载体对于开展植物基因工程是必须，然而十分遗憾的是，至今仍未建立起植物的自主复制型载体。第三十八页，共57页。Ti质粒载体 利用Ti质粒构建的植物载体种类很多，常用的是双元载体(binary vector)， 这是一类能在大肠杆菌和根癌农杆菌中进行复制的广谱宿主载体。这类载体所使用的复制起点来自细胞质粒RK2，携带着两个T-DNA 边界顺序和各种标记基因。当外源基因插入后，重组质粒可在辅助质粒的帮助下从大肠杆菌转移到根癌农杆菌。这种农杆菌内存在着一种T-DNA已全部丢失的Ti 质粒(pAL440

21、4)，它可以帮助重组双元质粒上的T-DNA转移到植物细胞中。由于大肠杆菌和根癌农杆菌之间的DNA转移频率可达100%，因而整个基因组文库或cDNA文库可以全部转移到农杆菌中。 第三十九页，共57页。 在这个载体中，有来自Ti质粒的T-DNA两个末端的片段TL和TR，其中有适合于植物细胞的标记基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位点区（MCS）。用于植物转化细胞的选择标记基因主要是来自细菌的某些抗药性基因，因为植物细胞对某些抗生素十分敏悉，比如卡那霉素、潮霉素、新霉素等。由于这些基因不能直接在植物细胞中表达，因此就把这些基因的编码区DNA 插入某些植物基因的启动子后面，编码区后面则

22、是来自植物基因的3-端DNA顺序，其中包括终止子序列。第四十页，共57页。第四十一页，共57页。早在上世纪初Smith 等人就发现作为自然存在的遗传工程，土壤中生存的根癌农杆菌可以将外源基因转入植物而导致根肿瘤的生成。农杆菌的致病基因在酸性条件和酚类诱导物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中。这类酚类诱导物是大多数双子叶植物在受到伤害时产生的。在植物转基因早期阶段，由于农杆菌转化系统即简单又不需要很多仪器设备，就成为很多科学工作者首先研究的热点。1977年Chilton等人证明根癌农杆菌的Ti质粒的一部分转入植物细胞，整合进植物基因组使植物产生

23、肿瘤。农杆菌转入植物的DNA片段称为转移DNA（T- DNA）。Ti质粒可以将外源基因转入植物的能力引起人们的广泛兴趣，早期的植物转基因工作既是用它作为植物转基因的载体，进行大量转基因研究。第四十二页，共57页。农杆菌介导法目前以根癌农杆菌使用的较多，尤其在早期的双子叶植物的遗传转化研究中上发挥了重要作用。近年来人们对农杆菌介导法机理作了深入研究，发现了酚类化合物在外源基因导入植物细胞的作用。尤其是日本烟草公司的Hiei等人在水稻遗传转化上应用农杆菌介导法获得了明显的进展，使这一转化方法在单子叶植物中也有了成功的应用。农杆菌介导法与其它方法比较，具有转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高并可以

24、转入大的DNA片段（可达150 kb）、不需贵重仪器等优点。第四十三页，共57页。在双子叶植物的转化研究中，可以用植物的叶片、幼茎、悬浮培养物、及发芽的种子等作为外植体进行农杆菌转化试验。在进行农杆菌转化试验中常常要对不同的农杆菌菌株、农杆菌和植物外植体共培养的时间和温度及选择压力进行优化，以获得更高的转化效率。根据Escudero等人研究结果，在自然条件下农杆菌可以渗入植物细胞，因而在作农杆菌转化时，没有必要对植物组织制造伤口。超声波予处理植物组织，可以提高转化效率。在用农杆菌进行葡萄转化试验时，用抗氧化剂如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫苏糖醇处理可以提高转化效率。第四十四页，共57页。Ag

25、robacterium-mediated transformation Advantages:1. Cleaner inserts2. Higher co-expression3. More flexible in tissue types(in planta transformation) almost any type of tissues or cells 4. Mostly widely used system ,both monocot and dicot5. Easy in manipulation ,Disadvantages 1. Only good for nuclear t

26、ransformation2. Limited in host range,genotype-dependent3. Detrimental to some tissues第四十五页，共57页。Introduction to AgrobacteriumMoloecular mechanisms of T-DNA transfer into the plant genome Factors influencing the T-DNA delivery Regeneration and selection of transgenic plants第四十六页，共57页。TypesA.tumefaci

27、ens : the causative agent of plant disease crowng gall.rhizogenes : provokes hair roots. Both crown gall and root hair are neoplastic diseases (plant tumors), both gram-negative soil bacterium. Based on the opines produced in the tumors,Ti plasmids are divided in four groups,while the Ri plasmids fa

28、ll in three groups.Ti plasmidsu Octopine: pTiAch5,pTiAg57,or pTi19955 Nopaline: pTiC58,pTi1D135,pTi223 Leucinnopine: pTi542,pTiAT4D,L-succinamopine: pTiEU6,pTiAT181 Ri plasmidsu Mannopine: pRi8196,pRiTR7 Agropine: pRi1855,pRi15834,pRiA4 Cucumopine: pRi1659 第四十七页，共57页。Strains: Agrobacterium Strains a

29、nd the origins of Agrobacterium strains(see attached table 1 and 2)refernce plasmid1:238-253(1978)Examples:C58 (C58 chromosome,pTi C58)ABI (C58 chromosome,pTiMp90RK,disarmed TiC58)GV3850 (C58 chromosome,pTiGV3850,disarmed TiC58)A281 (C58 chromosome,pTiBo542)EHA101 (C58 chromosome,pTiEHA101,disarmed

30、pTiBo542 EHA105 (C58 chromosome,pTiEHA105,disardisarmed pTiBo542)T37 (T37 chromosome,pTi37)A208 (C58 chromosome,Pti37)Ach5 (Ach5 chromosome,pTiAch5)LBA4404 (Ach5 chromosome,TiAL4404,disarmed pTiAch5)第四十八页，共57页。 Strains: Agrobacterium Strains and the origins of Agrobacterium strains(see attached tabl

31、e 1 and 2)refernce plasmid1:238-253(1978)Examples:C58 (C58 chromosome,pTi C58)ABI (C58 chromosome,pTiMp90RK,disarmed TiC58)GV3850 (C58 chromosome,pTiGV3850,disarmed TiC58)A281 (C58 chromosome,pTiBo542)EHA101 (C58 chromosome,pTiEHA101,disarmed pTiBo542 EHA105 (C58 chromosome,pTiEHA105,disardisarmed p

32、TiBo542)T37 (T37 chromosome,pTi37)A208 (C58 chromosome,Pti37)Ach5 (Ach5 chromosome,pTiAch5)LBA4404 (Ach5 chromosome,TiAL4404,disarmed pTiAch5)第四十九页，共57页。Molecular mechanisms of T-DNA transfer into plant genome Steps in T-DNA delivery1) host perception2) pre-infection attachment 3) induction and init

33、iation of virulence genes 4) synthesis and assembly of the promiscuous pilus 5) processing and delivery of the T-DNA 6) T-DNA integration第五十页，共57页。1)host perception: chemical signals produced naturally by plant roots serve chemoattractants such as sucrose,glucose and fructose as well as amino acids

34、like valine and arginine are good chemoattractants.plant isofolavomoids such as formoneton and coumestrol initiating the transcription of chromosomal genes of Agrobacterium involved in facilitating root colonization.most of the Vir genes except for genes of the virb and vire operons are required for

35、 Agrobacterium motility.第五十一页，共57页。2).pre-infection attachment a) Agrobacterium must attach to its host cells before the T-DNA is processed and readied for transfer,following chemotaxis to the host plant .b) attachment is independent of Ti or Ri plasmid.c) A.tumefaciens adherence to plant cells is s

36、aturable .d) The attachment sites are thought to be specific receptors (2,000 such receptors on carrot suspension culture cells)where only live bacterium binds.e) Each plant cell has enough attachment sites for several bacterlum,but plant cells are transformed by only one or a few bacterium .No loss

37、 of competence of plant cell causes by the firsrt agrobacterum infection.f) Chromosomal genes involved in attachment chva,chcb,exoc:synthesis of a cyclic -1,2-glucan, implicated in plant cell binding. cel:cellulose synthesizing genes.agrobacterium cells forms large aggregates microscopically, seen a

38、s clumps tetheted by cellulose fibrils. pscA:exopolisaccharide systhesis and secretion leading to the systhesis of cellulose fibrils. att: root colonization第五十二页，共57页。3) induction and initiation of virulence genes a)virA: autophosphorilating protein respond to the environmental signals by transferri

39、ng a phosphate group to VirG protein.The induction of vir genes expression is sensitive to temperature(28).Three types of signals are recognized by virA : u phenols:acetosyringone(stronger inducer) u sugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose) and sugar derivatives (galacturonic acid) u low p

40、H (optimum,approximately5.3)b) VirG : transcriptional activator. Rate-limiting protein for vir gene induction, and its transcription increases in response to the presence of : u inducing phenolics u acidic environment u phosphate starvationc)chvE: sugar-binding protein 第五十三页，共57页。4)synthesis and ass

41、embly of the promiscuous pilus upon induction of the vir genes ,a systematic set of molecular events leading to the synthesis and assembly of the conjugative pilus take place (see table or figure shown location and function of VirB proteins) low temperature at 19is optimal第五十四页，共57页。5) processing and delivery of the T-DNA uT-DNA u left and right borders uimperfect di