微生物知识概况及污染菌库建立(陈莹)

1、OneBio Multimedia CoursesOneBio Multimedia Courses微生物知识概况及微生物知识概况及污染菌库的建立污染菌库的建立报告人：陈莹 Telmail：长春百克生物科技股份公司长春百克生物科技股份公司主要内容微生物知识概况微生物知识概况 什么是微生物？ 微生物学与人类的关系 微生物的特点污染菌库的建立污染菌库的建立 收集分离纯化保藏鉴定数据处理与应用2/92内容一：微生物知识概况内容一：微生物知识概况一、什么是微生物？一、什么是微生物？ 微生物的定义 微生物的种类 微生物的形态 微生物的特点二、微生物学与人类的关系二、微生物学与人

2、类的关系3/9214一、什么是微生物？一、什么是微生物？ 1 1、微生物的定义、微生物的定义 一切肉眼看不见或看不清的微小生物 的总称。它们都是一些体积微小，结构简单的低等生物。4/922、微生物的种类微生物的种类 按其结构、化学组成及分化程度可分为按其结构、化学组成及分化程度可分为: :原核类原核类: : 仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善。器很不完善。真核类真核类: : 细胞核的分化程度较高，有核膜、核细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。仁和染色体，细胞器完整。非细胞类非细胞类: : 体积微小，能通过除菌过滤器。体积微小，能通过除

3、菌过滤器。5/922 2、微生物的种类、微生物的种类支原体、衣原体、立克次氏体6/923 3、微生物的形态、微生物的形态3.1 微生物的菌落形态7/9214四大类微生物菌落比较表四大类微生物菌落比较表类别类别细菌细菌放线菌放线菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌培养基牛肉膏高氏一号马铃薯马铃薯菌落形状 小点状，多为圆形，个别呈根状，辐射状圆形辐射状多为原形疏松的绒毛状、絮状、蜘蛛网状，有的无固定大小大小一般较小较小比细菌大而厚大颜色多样（乳白、灰白、灰、红、荧光等）正反面颜色相同多样（灰白、白、红、粉红、蓝、紫、橙等）正反面颜色不同多为乳白色多样（白，灰蓝、绿黑、粉红等）正反面一般颜色不同表面状态光滑或粗糙

4、，湿润或干燥，较粘初期似细菌菌落，晚期为粉状干燥表面湿润粘稠绒毛状，粉状，棉絮状，蜘蛛网状，菌丝疏松生长速度一般较快慢较快快与基质结合程度不牢牢固，不易挑取不牢较牢生长范围有限有限有限多为无限气味往往有臭味有泥腥味常有酒香味往往有霉味8/92把细胞个体形态与菌落特征一块比较：四大类微生物的比较四大类微生物的比较99/923.2 微生物的显微形态类别类别形态形态举例举例细菌直径为0.8-1.2m，呈球形、类球形。双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。一般长2-5m，宽0.5-1.0m。各种杆菌的长短宽窄不一。炭疽杆菌、结核杆菌、大肠杆菌等。螺形菌菌体呈弯曲状，弧菌有数个弯曲，呈香蕉状，

5、螺菌有数个弯曲。弧菌和螺菌。真菌酵母菌大小比细菌大得多，为葡萄球菌的数倍至几十倍，小的肉眼看不见，大的如木耳、蘑菇、灵芝。酿酒酵母菌、路德类酵母菌等。霉菌青霉菌、曲霉菌等。常见微生物显微结构比较表常见微生物显微结构比较表10/92葡萄球菌葡萄球菌酵母菌酵母菌(芽痕芽痕)棒状杆菌棒状杆菌大肠杆菌大肠杆菌弧状菌弧状菌链球菌链球菌11/92青霉菌青霉菌犁头霉犁头霉12/92沙门菌铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌 生孢梭菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 13/924 4、微生物的特点、微生物的特点个体小个体小,面积大：面积大：小于小于0.1mm。肉眼不可见。肉眼不可见。分布广分布广,种类多（种类多（10万多

6、种）万多种） ：自然界中到处都有，如水、空：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等气、土壤等, 土壤中的数量最多。土壤中的数量最多。代谢强，转化快：代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重小时内可分解其自重100010000倍的乳糖；产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比食用倍的乳糖；产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比食用公牛强公牛强10万倍。万倍。生长旺，繁殖快：生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代。十分钟内就可以繁殖一代。适应性强，易变异适应性强，易变异（耐药性产生的原因）（耐药性产生的原因）14/

7、92二、微生物与人类的关系二、微生物与人类的关系微生物无处不在，我们无时不生微生物无处不在，我们无时不生活在活在“微生物的海洋微生物的海洋”中。中。15/92二、微生物与人类的关系二、微生物与人类的关系 微生物在哪里?16/9217/92细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034 10 12 吨；每张纸币带细菌：900万人体体表及体内存在大量的微生物： 皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米； 口腔：细菌种类超过500种； 肠道：微生物总量达100万亿， 粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万。

8、18/92时时刻刻与微生物时时刻刻与微生物“共舞共舞” 是是 祸祸？是是 福福？微生物既是人类的敌人，也是人类的朋友！1919/92t 微生物是自然界物质循环的关键环节；微生物是自然界物质循环的关键环节；微生物是人类的朋友！微生物是人类的朋友！t 体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证； 帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障t 微生物可以为我们提供很多有用的物质；微生物可以为我们提供很多有用的物质； 醋、酶、各种药物、疫苗、面包、奶酪、啤酒、酱油等t 基因工程为代表的现代生物技术；基因工程为代表的现代生物技术；2020/92微生物是人类的敌人微生物

9、是人类的敌人！鼠疫鼠疫天花天花艾滋病艾滋病狂犬病狂犬病埃博拉病毒埃博拉病毒天花天花病毒病毒康康熙熙爱德爱德华华詹詹纳纳2121/92二、微生物与人类的关系二、微生物与人类的关系 可以说，微生物与人类关系的重要性，怎么强调都不过分. 微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。 它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。22/92内容二：污染菌库的建立内容二：污染菌库的建立污染菌库建立的目的和应用污染菌库建立的步骤23/92一、污染菌库建立的目的和应用一、污染菌库建立的目的和应用 目的目的： 应新版GMP要求，需对环境、原辅料及不同阶段产品监

10、控或检测到的微生物进行鉴定，并建立污染菌种库。便于对日常监测中出现异常菌株与菌种库进行比对，查找其来源，并针对菌种特性对相应的监控环境采取有效措施进行消毒。124/92目的：目的： 长期有规律地对环境、检品中的微生物进行监控，了解环境中的微生物污染种类和变化趋势，并作为质量控制文件加以保存，对企业日常生产质量管理和监管机构的监督检查都是有益的补充。225/92应用：应用：对实验室洁净环境、各种检品进行监控，构建环对实验室洁净环境、各种检品进行监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力境微生物分布图，提高检测结果公信力1建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染

11、趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。26/92应用：应用：2增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据认可，为执法、仲裁提供依据在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复核和监控。通过对比监测的微生物种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增加检验报告的含金量。27/92应用：应用：3与国际标准接轨，监控药品生产环境，构与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系建药品生产微生物风险评估体系美国FDA要求

12、药厂将微生物鉴定到“种”一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控。28/92二、污染菌库建立步骤污染菌的收集3.2.1.污染菌库数据的处理与应用污染菌的分离纯化4.菌种的保藏菌种的鉴定5.29/92一、污染菌的收集污染菌收集分类污染菌收集分类污染菌采集污染菌采集地点地点环境监控污染菌收集环境监控污染菌收集化验室化验室生产生产-有毒区有毒区生产生产-无毒区无毒区分包装车间分包装车间原辅料、不同阶段样品监控污原辅料、不同阶段样品监控污染菌染菌收集收集成品组成品组原辅料组原辅料组生产生产-有毒区有毒区生产生产-无毒区无毒区30/92一、污

13、染菌的收集31/92二、污染菌的分离纯化 定义：定义：样品或环境监控到的微生物有的呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。 目的：目的：使样品或环境中监控到的微生物长成单菌落后，便于后续的鉴定和保藏工作。32/92 方法：方法：稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离 平板划线分离法平板划线分离法33/92各浓度做各浓度做三个平皿三个平皿挑选单菌落挑选单菌落接种斜面接种斜面稀释涂板法稀释涂板法 从土壤分离微生物操作过程从土壤分离微生物操作过程34/92三、污染菌的保藏一、菌种保藏 （

14、一）保藏目的及原理 （二）菌种保藏的方法 （三）菌种保藏注意事项二35/92（一）菌种保藏目的及原理（一）菌种保藏目的及原理目的原理创造不利于菌种生长的一切条件，使其代谢处于休眠状态。不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间3636/92低温干燥无氧缺营养不利条件3737/92（二）菌种保藏的方法生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥3838/92常用保藏法简介常用保藏法简介特点简便保藏时间短易污染及退化1.斜面低温法斜面低温法斜面菌种置46冰箱中（36个月）39/9240/922.矿油保藏法矿油保藏法无菌检验 ？注入种管淹

15、没斜面约1cm矿油处理灭菌：152kpa、30min去水：4050烘至无色透明 口堵胶塞用时转管再转管方法简便的优点适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存。某些细菌不宜采用此法进行保存。特点特点41/9242/923. 超低温冷冻保藏超低温冷冻保藏 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在 -60-80以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。 43/92 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可

16、用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。44/924.磁珠保藏法磁珠保藏法45/925. 液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法 液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。 原理原理: 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（130），所以此时菌种的代谢活动已基本停止，化学作用亦随之消失。 46/92常用保藏方法比较47/92（三）菌种保藏的注意事项1菌种在保藏前所处的状态 一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。 2菌种保藏所

17、用的基质 碳源 、砂土 、保护剂 3操作过程对细胞结构的损害 冻结速度 48/92四、菌种的鉴定四、菌种的鉴定49/921、菌种鉴定技术对细菌各种生物学性状进行分类，选用多项生理、生化指标逐一进行比较，通过查表或计算机分析各菌间相似度，完成细菌分类。细胞形状、菌落形态、G氏染色等形态学特征初步判定。遗传特征：核酸序列 蛋白质比较 核酸碱基组成50/9251/92用于鉴定的形态学特征52/92用于鉴定的生理生化特征53/92用于鉴定的遗传学特征细菌酵母菌霉菌54/922、细菌的鉴定55/92分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16S rDNA 序列

18、16S rDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色形态鉴定生理生化鉴定细菌鉴定仪细菌的鉴定流程图细菌的鉴定流程图 56/92形态学形态学- -革兰氏染色革兰氏染色 细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法能将细菌分为G+菌和G-菌。原理：原理：由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁较多易被乙醇溶解的类脂质、肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初

19、染时的颜色。57/92G+菌和G-菌细胞壁结构和成分比较类型类型 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 强度强度 较坚韧较坚韧 较疏松较疏松 厚度厚度 厚，厚，202080nm 80nm 薄，薄，5 510nm 10nm 肽聚糖层数肽聚糖层数 多，多，15501550层，每层厚层，每层厚1nm 1nm 少，少，1 13 3层层 肽聚糖含量肽聚糖含量 多，可占胞壁干重多，可占胞壁干重505080% 80% 少，占胞壁干重少，占胞壁干重101020% 20% 磷壁酸磷壁酸 + + - - 外膜外膜 - - + + 结构结构 三维空间（立体结构）三维空间（立体结构） 二维空间（平面结构

20、）二维空间（平面结构） 58/92革兰氏染色步骤59/92革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌60/92 革兰氏阳性球菌： 产品样本、水、环境监测中发现的大多数阳性球菌来自人，有些可能来源于天然来源的原料。 药品生产中包括无菌工艺，最常见的污染物是革兰氏阳性球菌，有葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属。 人源污染的细菌经常与不规范的无菌行为和操作、裸露的皮肤或头发(人类脱落)有关。常见革兰氏菌污染来源61/92 革兰氏阳性杆菌 污染物通常来自于环境，特别是土壤或尘埃，也会来自原料，如聚乙二醇(PEG)。 生物工艺最常见的革兰氏阳性杆菌污染，是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，它们产生的内生芽孢对环境压力有高耐受性。 芽

21、孢杆菌属污染与缺乏无菌操作意识，材料和表面的消毒不彻底，无效SIP循环，违反无菌原则，以及污染的原料有关。常见革兰氏菌污染来源62/92 革兰氏阴性杆菌 污染通常来自水源、土壤、植被、原料。 革兰氏阴性杆菌包括大肠杆菌属，假单胞菌属，伯霍尔德杆菌属，劳尔氏菌属、狭长平胞属等。 事实上， 水和液体系统中通常发现存在这些属的微生物污染。 所以，在生物工艺操作样品中通常不会发现革兰氏阴性杆菌。产品污染革兰氏阴性杆菌经常与积水、设备的清洁维护保养护操作不彻底相关。革兰氏阴性菌污染的主要问题之一是内毒素常见革兰氏菌污染来源63/92 革兰氏阴性球菌 在医学上是与人类有关的。 它们包括引起性传播疾病(淋病

22、奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌)和呼吸道感染(卡他莫拉菌)的微生物。 这类的污染很少出现在生物工艺中。 如果结果显示有革兰氏阴性球菌污染，很有可能是检验错误。常见革兰氏菌污染来源64/92 革兰氏阴性螺旋菌 在制药用水系统或洁净室环境很少发现。 这些细菌与排泄物污染有关,包括被污染的水源。 当检测到该类菌时，应该全面调查找到它的潜在来源。常见革兰氏菌污染来源65/92分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16S rDNA 序列16S rDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色形态鉴定生理生化鉴定细菌鉴定仪细菌的鉴定流程图细菌的鉴定流程图 66/92生理生

23、化-半自动细菌鉴定仪（ATB New）检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。67/92分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16S rDNA 序列16S rDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色形态鉴定生化鉴定ATB细菌鉴定仪鉴定细菌的鉴定流程图细菌的鉴定流程图 68/92分子生物学分子生物学-具体流程具体流程基因组的制备PCR克隆16sRNA阳性克隆鉴定，测序同源性分析，系统进化树建立69/92系统发育树 Zo

24、bellia galactanovora.AF208293 A*.AF468422 Psychroserpens mesophilus.DQ001321 Mucus bacterium.AY654753 Cytophaga baltica.AJ005972 Cytophaga fucicola.AJ005973 QY201 Cellulophaga lytica.AB032513 Cellulophaga sp.AB180390 F*.AJ936938 Cytophaga marinoflava.D126681001009972100859661根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为Ce

25、llulophaga属细菌,命名Cellulophaga sp.QY201。7070/923、真菌的鉴定71/92真菌的鉴定流程图真菌的鉴定流程图分离纯化得到真菌样品的单菌落真菌菌落形态观察真菌DNA的提取构建系统发育树分子生物学评价通用引物扩增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中进行Blast分析鉴定结论72/92真菌形态观察真菌形态观察 通常把真菌分为酵母菌和丝状真菌(霉菌)。 霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基质菌丝和气生菌丝。气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子。孢子着生部位、排列方式以及孢子形态是真菌鉴定的重要依据。7373/92 酵母菌 是微小的单细胞真菌

26、。 可能在非专业人员看来，平皿上的酵母菌落像细菌。然而，在显微镜下，这些细胞大得多，看起来像葡萄干，因此可以很容易地区别于细菌。 生物工艺中典型的酵母污染是生物工艺中的人员、植物和原材料。常见酵母菌污染来源74/92 霉菌 是多细胞真菌，其产生的细丝称为菌丝。因此其学名为“丝状真菌”。 这类微生物在土壤、尘埃(粉尘)和植被中非常常见。 霉菌污染是这些微生物在生殖周期中会产生的孢子。因此霉菌污染很容易传播。 另一个问题是大多数物种产生的真菌毒素对人类有害。常见霉菌污染来源75/92黑曲霉可引起烧伤病人皮肤感染或真菌性肺部感染3.2 微生物的显微形态微生物的显微形态76/92曲霉曲霉青霉青霉777

27、7/92分生孢子梗分生孢子梗青霉：分生孢子梗青霉：分生孢子梗7878/92足细胞足细胞曲霉：分生孢子头曲霉：分生孢子头79/92根霉：孢子囊、匍匐枝和假根根霉：孢子囊、匍匐枝和假根8080/92犁头霉：接合孢子犁头霉：接合孢子81/92 酵母菌是单细胞构造，个体形态多为卵圆形、圆柱形，但有时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母菌无性繁殖以出芽方式生殖。酵母菌：出芽酵母菌：出芽酿酒酵母白色念珠菌（假丝酵母）8282/92真菌的鉴定流程图真菌的鉴定流程图分离纯化得到真菌样品的单菌落真菌菌落形态观察真菌DNA的提取构建系统发育树分子生物学评价通用引物扩增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中进行Bla

28、st分析鉴定结论83/92分子生物学在真菌鉴定中的应用 现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几个种属的霉菌进行鉴定。 我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌的鉴定需要在分离纯化后培养12-14天，再对其孢子及菌丝进行形态学观察。 真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境和检验人员安全具有潜在污染风险。分子生物学鉴定技术不需要使用选择性培养基，纯分子生物学鉴定技术不需要使用选择性培养基，纯化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进行能够进行DNADNA的提取，避免霉菌产生的大量孢子的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验室工作环境带来的潜在污染危害。对实验室工作环境带来的潜在污染危害。84/92五、污染菌库数据的处理与应用五、污染菌库数据的处理与应用 目的：目的： 建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。并将污染信息与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。85/92企业自查企业自查政府监管政府监管微生物样本的采集微生物样本的采集微生物菌株鉴定微生物菌株鉴定企业环境控制及污企业环境控制及污染溯源能力染溯源能力新型监管模式的建立新型监管模式的建立构建微生物分布图构建微生物分布图建立菌种信息库建立菌种信息库A类企业：分子水平类企业：