细胞培养标准流程

1、细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30min）和房间大紫外（30min）。显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37C的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2. 弃旧

2、：细胞生长融合达90%时，吸出培养基3. 漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次4. 消化：加入1ml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时C02放置40s-1min,轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。5. 终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。6. 吹悬：轻轻吹打混匀，（倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形），吹打成单细胞悬液后按1：2或1：3比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30%，慢40%-50%;其余细胞可提取蛋白或RNA）7. 培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融

3、合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。PS:六孔板一般加培养基2300L孔。2、细胞转染TurboFect转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24h后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。以6孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。取1.5ml离心管，加入400卩L无血清无双抗DMEM培养液，加入质粒2卩,混匀后静置5min,再转染试剂4H混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置1520min。（转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁；静置时间不可超过20min）无血清无双抗DMEM量二全培体积的10%。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血

4、清无双抗DMEM。缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。2448h后收集细胞用于后续实验。Note:如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。HiPerFect转染试剂转染（用于siRNA勺转染，说明书附后）FortransfectionofeukaryoticcellswithsiRNAandmiRNA5以6孔板为例，转染之前，以2mL全培接种1.5-6X10细胞于6孔板每孔。将细胞放置在培养箱中培养，直至转染。（前50%

5、-染90%）取1.5ml离心管，加入100卩L无血清无双抗DMEM培养液，加入siRNA（20uM浓度，相当于0.25ug/卩L）5i转染试剂12讥轻轻混匀，室温静置5-10min。siRNA:转染试剂：无血清无双抗DMEM5uL:12ul:100ul°（比例待定）将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。2448h后收集细胞用于后续实验3、细胞冻存（慢冻快融）1）配冻存液：全培+10%DMSO或者90%胎牛+10%DMSO。（保护细胞膜不被冻坏）2）提前准备好程序性降温盒。3）标记冻存管：帽子：细胞系名称冻存者侧面：细胞系名称冻存者冻存时间级别（按照细胞状态标

6、记A+,A,B）,太差的别冻4）细胞经过换液消化后，离心，弃上清加入2ml的预先配好的冻存液，快速吹打混匀。若不离心，则在冻存管中加100yLMSO+900yL田胞悬液。5）冻存顺序：用冻存仪（程序性降温盒）80°C过夜f液氮。或者4°C半小时一20C2小时80C存储。冻存仪的使用方法1、确认冻存仪内的异丙醇是否已经使用5次，准备细胞，放入冻存盒（最多18管）。2、将冻存盒放入-80C冰箱，并登记信息（冻存者，冻存细胞名称，异丙醇使用次数）3、至少三个小时后（过夜），将细胞取出放置于自己的细胞盒内或液氮中。4、将冻存盒取出放回原处。冻存盒内需放置250ml的异丙醇，异丙醇使

7、用4-5次后需要更新4、细胞复苏（DMEM培养液+10%FBS+1%双抗）1）准备37C水浴箱，10mL离心管，配制相应培养基，标记好培养皿。（离心管和培养皿可提前加好约5ml培养基）2）将取出的细胞冻存管快速投入到温水中，同时手握冻存管快速搅动，让细胞以最快的速度融解。3）吸取所有融化的细胞悬液至加有5倍体积培养基的离心管中。4）离心800rpm,3min。5）弃上清，加全培重悬细胞。6）依次加2ml细胞悬液和10ml全培入新培养皿。（6cm小圆盘上加入2ml的全培;10cm大圆盘上加入10ml的全培）。7）混匀（十字混匀），CO培养。标准程序:3）离心lOOOrpm,2-3分钟；弃上清，加入1ml全培重悬后转入10ml管，再加入4-5ml全培重悬4）离心1000rpm，2-3