第2章细胞生物学技术

1、第二章细胞生物学技术第二章细胞生物学技术细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术1 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术 电子显微镜技术电子显微镜技术 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜光学显微镜光学显微镜：以可见光可见光（或紫外线紫外线）为光源。电子显微镜电子显微镜：以电子束电子束为光源。1. 构成：构成： 照明系统照明系统 光学放大系统光学放大系统 机械装置机械装置2. 原理：原理： 经物镜形成倒立实像，经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。经目镜进一

2、步放大成像。（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜1.物镜转换器 2.接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6.彩虹光阑 7.光源 8.镜座 9.电源开关 10.光源滑动变阻器 11.粗调螺12.微调螺旋 13.镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋3. 分辨率分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 分辨距离越小，则分辨能力越高。分辨距离越小，则分辨能力越高。R=0.61/NA为入射光线波长；为入射光线波长；NA（镜口率）（镜口率） sin/2，n=介质折射率；=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。思考：如何提高显微镜的分辨能力？如何提高显微镜的分辨能力？NA：显微镜物镜

3、的镜口率镜口率光学性能指标，每个物镜上都标有其镜口率的数值）。几种介质的折射率几种介质的折射率物镜镜口率受入射镜口角入射镜口角和介质折射率介质折射率的限制，不可能有更大提高。所以科学家们从另外两个途径来改进改进显微镜：换用短波长的换用短波长的“照明光源照明光源”，来提高分辨能力。如：紫外光显微镜，电子显微镜。应用特殊光学效应，应用特殊光学效应，增强反差，来提高分辨能力。（二）荧光显微镜（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope特点：光源为紫外线光源为紫外线，波长较短，分辨能力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式落射式。（二）荧光显微镜（

4、二）荧光显微镜 Fluorescence microscope原理：原理：以紫外光为光源，使被检材料中的荧光物质激发出荧光，从而对细胞内某些物质进行定性和定位分析。荧光现象有两种：（）自发荧光：（）自发荧光：细胞内某些天然荧光物质天然荧光物质被紫外光照射所激发的荧光，例如叶绿素叶绿素（血红色自发荧光）；（）诱发荧光：（）诱发荧光：在细胞中加入荧光染料（荧荧光染料（荧光素）光素），与细胞内某种特定成分结合在一起，经紫外光照射激发出荧光。 例：荧光染料例：荧光染料吖啶橙吖啶橙，可使RNA发出红色荧光，而使DNA发出绿色荧光。荧光显微镜与普通光镜在结构上不同之处：荧光显微镜与普通光镜在结构上不同之处

5、：（1）紫外光发生装置紫外光发生装置：高压汞灯：高压汞灯+激发装置激发装置+滤光滤光装置；装置；（2）透镜由石英玻璃制成透镜由石英玻璃制成，以便减少光通路上的紫，以便减少光通路上的紫外光损耗；外光损耗；（3）目镜中要装压紫滤片目镜中要装压紫滤片Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）相差显微镜（三）相差显微镜原理：原理：光波的三个光学特性：光波的三个光学特性：（1）波长波长：对于光波波长变化，肉眼觉察为颜色变化

6、颜色变化;（2）振幅振幅：对于光波振幅变化（即振幅差），肉眼觉察为明暗变化明暗变化；（3）相位：相位：指某一时刻，光在其前进路线上的位置。对于光相位的变化（即相位差），肉眼不能觉察肉眼不能觉察。当光线穿过当光线穿过无色透明无色透明且且非匀质非匀质的活细胞，其波的活细胞，其波长和振幅都无明显变化，长和振幅都无明显变化，仅光相位出现一定程仅光相位出现一定程度变化度变化。观察时感觉观察时感觉反差较小反差较小，物体内部的结构难分辨。，物体内部的结构难分辨。为何普通光镜不适宜用于观察活细胞？为何普通光镜不适宜用于观察活细胞？把透过标本的可见光的光程差光程差变成变成振幅差振幅差，从而提高了各种结构间的对比

7、度。在构造上，相差显微镜的两个特殊之处。 环形光阑环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。作用：作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。1.相差板相差板（annular phaseplate）：物镜后加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。相相 差差 显显 微微 镜镜 原原 理理相差显微镜却是运用一些特殊装置，使通过被检物体的光线分离成两组光波，并人为地使人为地使这这两组两组光波之间微弱的相位差加大，光波之间微弱的相位差加大，再经过光波光波干涉干涉作用，使看不见的相位差转变成可见的振相位

8、差转变成可见的振幅差幅差，从而反差增强反差增强，便能够清晰看到被检物体及其内部细微结构了。相差显微镜下的样品不需染色，相差显微镜下的样品不需染色，可以清晰观察活细胞及其内部结构的变化。相相 差差 显显 微微 镜用途：观察未经染色的玻片标本镜用途：观察未经染色的玻片标本二、电子显微镜二、电子显微镜（一）透射电子显微镜一）透射电子显微镜transmission electron microscope, TEM不同光线的波长不同光线的波长以电子束作光源电子束作光源，电磁场作透镜电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。由电子束照明系统电子束照明系统、电磁透

9、镜成像系统电磁透镜成像系统、真空系统真空系统、记录记录系统系统等部分构成。分辨率分辨率0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学 显 微 镜 下 无 法 看 清 的 结 构 ， 又 称 亚 显 微 结 构（submicroscopic structures）。（1）照明光源不同。照明光源不同。（2）放大倍数的调节方式不同。放大倍数的调节方式不同。 依靠改变磁透镜的激磁电流强度来调节放大倍数。电流强度的变化引起了磁场强度的改电流强度的变化引起了磁场强度的改变变，而磁场强度的变化又使电子射线的折射程使电子射线的折射程度发生改变

10、度发生改变，放大倍数随之出现变化放大倍数随之出现变化。（3）具有高压稳压系统。具有高压稳压系统。 电子流的发射速度及波长皆取决于电压的高低。透射电子显微镜特点透射电子显微镜特点（4）高度真空的工作系统。高度真空的工作系统。 高速运动的电子流如果与空气中的微粒和分子碰撞，就会改变它的发射方改变它的发射方向，导致成像模糊向，导致成像模糊。 要求电镜内的工作系统（包括样品室）都必须保持高度真空状态，并且样品都必须脱水。 因此说，透射电镜不能用来观察活透射电镜不能用来观察活的样品。的样品。透射电子显微镜特点透射电子显微镜特点（5）样品厚度必须样品厚度必须 25kr/min。第二节第二节 细胞组分的分析

11、方法细胞组分的分析方法（一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugation特点特点：介质密度均一介质密度均一；速度由低向高速度由低向高，逐级离心。用途用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序沉降顺序 细胞核细胞核线粒体线粒体溶酶体溶酶体、过氧化物酶体过氧化物酶体微微体、高尔基体、囊泡体、高尔基体、囊泡核蛋白体核蛋白体。细胞器初步分离后，再通过密度梯度离心纯化。细胞器初步分离后，再通过密度梯度离心纯化。（一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugation（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一用介质在离心管内

12、形成一连续连续或或不连续不连续的的密度梯密度梯度度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。离心力场的作用使细胞分层、分离。类型类型：速度沉降、等密度沉降。：速度沉降、等密度沉降。常用介质常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降、速度沉降 velocity sedimentation 用途用途：分离密度相近密度相近而大小不等大小不等的细胞或细胞器。特点特点：介质密度较低。原理原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数沉降系数以不同的速度沉降。2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic s

13、edimentation用途用途：分离分离密度不等密度不等的颗粒。的颗粒。特点特点：介质密度较高，陡度大。原理原理：样品各成分各成分在连续梯度的介质中，经过离心，沉降到与自身密度相等的介质沉降到与自身密度相等的介质处处，并停留在那里达到平衡。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、细胞成分的细胞化学显示方法二、细胞成分的细胞化学显示方法显色剂显色剂能与待测物质中一些特殊基团特异性结合。通过显色剂在细胞中的定位定位及颜色的深浅颜色的深浅，判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。孚尔根反应孚尔根反应：特异显示DNAPAS反应反应：多糖多糖米伦反

14、应米伦反应：蛋白质蛋白质四氧化锇四氧化锇、苏丹红苏丹红：不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸、脂滴脂滴格莫瑞法（Gomori）：碱性磷酸酶碱性磷酸酶三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性免疫荧光技术免疫荧光技术：将将免疫学方法免疫学方法（抗原（抗原抗体抗体特异结合）与特异结合）与荧光标记技术荧光标记技术相结合，用于研相结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交原位杂交（in situ hybridization）：用）：用标记标记的的核酸探核酸探针针，通过分子杂交，确定特异核苷酸序列

15、在染色体，通过分子杂交，确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。上或在细胞中的位置的方法。标记探针方法标记探针方法1、放射性同位素标记（显微放射自显影）、放射性同位素标记（显微放射自显影）2、荧光素标记（荧光显微镜观察）、荧光素标记（荧光显微镜观察）3、生物素标记、生物素标记五、流式细胞术五、流式细胞术用途用途：对：对单个细胞单个细胞进行快速进行快速定量分析与分选定量分析与分选。原理原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴；单个细胞的液滴；激光束的照射下，细胞发出散射光和荧光，经探测器检激光束的照射下，细胞

16、发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果。测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果。第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程（一）群体培养和克隆培养（一）群体培养和克隆培养群体培养群体培养（mass culture）：将含有）：将含有一定数量细胞的悬液一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞置于培养瓶中，让细胞贴壁生长贴壁生长，汇合后形成均匀的，汇合后形成均匀的单细单细胞层胞层；克隆培养克隆培养（clonal culture）：培养）：培养高度稀释的细胞悬液高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每个细胞形成一个细胞贴壁生长，每个细胞形成一个细胞集落细

17、胞集落（克隆克隆）。）。一、细胞培养一、细胞培养（一）群体培养（左）和克隆培养（右）（一）群体培养（左）和克隆培养（右）原代培养原代培养（primary culture）：培养直接来自）：培养直接来自动物机体的细胞群。动物机体的细胞群。传代培养传代培养（Passage）：将细胞从一个培养瓶转）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶。移到另外一个培养瓶。 传代细胞传代细胞：适应在体外培养条件下，持续传代培：适应在体外培养条件下，持续传代培养的细胞。养的细胞。（二）动物细胞培养（二）动物细胞培养Hela 细胞（细胞（a) 和和 CHO （b) 细胞的培养细胞的培养细胞株细胞株（cell stra

18、in）：从原代培养细胞群原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质特定性质或标志的细胞群标志的细胞群。细胞系细胞系（cell line）：从肿瘤组织肿瘤组织培养培养建立的细胞群或培养过程中发生突变突变或转化的细胞转化的细胞，可无限繁殖。 克隆克隆（clone）：由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致遗传性状一致的的细胞群细胞群。（三）植物细胞培养（三）植物细胞培养外植体培养外植体培养：诱导产生愈伤组织。研究：诱导产生愈伤组织。研究植物的植物的生长发育、分化生长发育、分化和变异；和变异；无性繁无性繁殖殖；制取代谢产物。；制取代谢产物。悬浮细胞培养悬浮细胞培养：产业化产业化大规模细胞培养，大规模细胞培养，制取植物代谢产物。制取植物代谢产物。（三）植物细胞培养（三）植物细胞培养原生质体培养原生质体培养：培养脱壁后的细胞。：培养脱壁后的细胞。 特点：特点：比较容易比较容易摄取外来的遗传物质摄取外来的遗传物质，如，如DNA；便于进行便于进行细胞融合细胞融合，形成杂交细胞；，形成杂交细胞；细胞壁可再生，经诱导分化成完整植株。细胞壁可再生，经诱导分化成完整植株。