第5章发酵工程

1、生物技术概论生物技术概论Corresponding E-mail: 第五章第五章 发酵工程发酵工程主讲：李继杰主讲：李继杰College of Chemical Engineering, GuiZhou University Corresponding E-mail: 发酵与发酵工程发酵与发酵工程 发酵菌种的分离与筛选发酵菌种的分离与筛选 液体深层发酵液体深层发酵 发酵过程的优化发酵过程的优化 生物反应器生物反应器 发酵产品的下游处理发酵产品的下游处理一一. . 发酵与发酵工程发酵与发酵工程 发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包

2、发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医等多种医疗保健药物，生产疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资

3、料，在化学工业上生产等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。等。 FERMENTATIONProcess ControlFermentation engineering上游工程上游工程UPSTREAM PROCESSES下游工程下游工程DOWNSTREAM PROCESSES发酵工程组成发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：从广义上讲，由三部分组成： 上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程UPSTREAM PROCESSES- genetics, cell - inoculum d

4、evelopment- media formulation- sterilization- inoculation上游工程上游工程Fermentation engineeringFERMENTATIONProcess ControlDOWNSTREAM PROCESSES- product extraction, purification & assay- waste treatment- by product recovery下游工程下游工程 The ratio of recovery to fermentation costs for L-asparaginase: 3.0 eth

5、anol: 0.16Fermentation engineeringFERMENTATIONProcess Control初级培养(5-10mL)次级培养(200-1000mL)初级发酵(10-100L)产品发酵(100L)发酵产物的收获培养的细胞破碎细胞纯化产物培养基提取产物纯化产物胞内产物胞内产物胞外产物胞外产物种子培养种子培养一级种子一级种子二级种子二级种子菌种筛选菌种筛选发酵罐试验发酵罐试验摇瓶发酵摇瓶发酵History of applied microbiologyAncient times food preservation (vinegar, cheese) flavour (b

6、read, soy sauce) brewing (beer, wine) 1861 Louis Pasteur first phase industrial biotechnology1940 penicillin (Fleming) antibiotic industry production of fine chemicals巴斯德巴斯德李斯特李斯特 1973 rec DNA technology (Boyer & Cohen) 1982 rec human insulin胰岛素胰岛素 post recombinant DNA area since 1982 rec therap

7、eutic agents治疗剂治疗剂 1990 rec bakers yeast 1992 rec chymosine 凝乳酶凝乳酶 (from yeast)History of applied microbiology狭义的发酵指利用狭义的发酵指利用微生物微生物在在有有氧或无氧氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物条件下的生命活动，来制备微生物菌体菌体或或其其代谢产物代谢产物的过程。广义的发酵指凡是利用培养细的过程。广义的发酵指凡是利用培养细胞胞( (动、植物和微生物细胞动、植物和微生物细胞) )来来制得产品制得产品的过程。的过程。研究发酵工业研究发酵工业生产过程中，生产过程中，各个单元操作

8、各个单元操作的的工艺和设备工艺和设备的一门科的一门科学。学。p发酵工业用生产菌种的选育发酵工业用生产菌种的选育( (自然选育、诱自然选育、诱变育种、基因工程育种变育种、基因工程育种) )；p发酵条件的优化与控制；发酵条件的优化与控制；p生物反应器的设计；生物反应器的设计；p发酵产物的分离、提取和精制。发酵产物的分离、提取和精制。按发酵产品的类型划分按发酵产品的类型划分；按发酵工艺是否需氧划分：按发酵工艺是否需氧划分： 厌氧发酵：厌氧发酵：发酵是在厌氧条件下进行，如酒类发发酵是在厌氧条件下进行，如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵；发酵

9、； 通风发酵：通风发酵：发酵是在通风条件下进行，如酵母菌发酵是在通风条件下进行，如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等。酶制剂生产等。按发酵工艺培养基的状态划分按发酵工艺培养基的状态划分： 固态发酵：固态发酵：发酵是在固体状态下进行，主要应用于发酵是在固体状态下进行，主要应用于传统酿造业；传统酿造业； 液态发酵：液态发酵：发酵是在液体状态下进行，是目前发酵发酵是在液体状态下进行，是目前发酵工业所采用的主要工艺工业所采用的主要工艺。二二. . 发酵菌种的分离与筛选发酵菌种的分离与筛选 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，优良的

10、微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌株。改善，首先必须选育性能优良的生产菌株。 目前工业生产上应用的优良菌种，绝大部分是目前工业生产上应用的优良菌种，绝大部分是从自然界中分离得到，经过筛选、纯化及培养条从自然界中分离得到，经过筛选、纯化及培养条件的研究而应用于工业生产的。件的研究而应用于工业生产的。( (一一) )菌种分离简介菌种分离简介1. 1. 菌种的来源菌种的来源来源一：来源一：根据资料直接向有关科研单位、高根据资料直接向有关科研单位、高 等院校、工厂或菌种保藏部门索取等院

11、校、工厂或菌种保藏部门索取 或购买。或购买。国内外著名菌种保藏机构：国内外著名菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委会中国微生物菌种保藏管理委会(CCCCM)(CCCCM)美国典型菌种保藏中心美国典型菌种保藏中心( (ATCCATCC) )：American Type American Type Culture CollectionCulture Collection，Rockville(Rockville(罗克维尔市罗克维尔市) )，Maryland(Maryland(马里兰州马里兰州) )，U.S.AU.S.A来源二：来源二：从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌

12、种。来源三：来源三：从发酵制品中分离筛选目的菌株。从发酵制品中分离筛选目的菌株。 如从酱油中分离蛋白酶产生菌。如从酱油中分离蛋白酶产生菌。更容易筛选到理想菌株。更容易筛选到理想菌株。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。理先进的设备与之配合。 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速

13、、准确地把所需要的菌种挑选出来。快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。2. 2. 菌种分离思路菌种分离思路3. 3. 新菌株分离与筛选的步骤新菌株分离与筛选的步骤 Step 1 Step 1 定方案：定方案： 首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。养特性。Step 2 Step 2 采样：采样： 有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。Step 3 Step 3 增殖：增殖： 人为地通过控制养分或培养条件，使所需人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。Step 4 Step 4 分离：分离： 利

14、用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。 Step 5 Step 5 发酵性能测定：发酵性能测定： 进行生产性能测定。这些特性包括形态、进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适长和发酵最适温度、最适pHpH值、提取工艺值、提取工艺等。等。 调查研究及查阅充分的资料调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案设计实验方案 确定采集样品的生态环境确定采集样品的生态环境 采样采样 确定特定的增殖条件确定特定的增殖条件 增殖培养增殖培养

15、确定特殊的选择培养基及可能的确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法定性或半定量快速检出法 平板分离平板分离 菌种筛选主要步骤菌种筛选主要步骤 原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件确定发酵培养基础条件 筛选筛选 初筛初筛(1 (1株株1 1瓶瓶) ) 复筛复筛(1 (1株株3 35 5瓶瓶) ) 结合初步工艺条件摸索结合初步工艺条件摸索 再复筛再复筛(1 (1株株3 35 5瓶瓶) ) 3 35 5株株 单株纯种分离单株纯种分离 生产性能试验生产性能试验 毒性试验毒性试验菌种鉴定菌种鉴定菌种保藏菌种保藏菌种筛选主要步骤菌种筛选主要步骤NN株株200200株株5050株株1010株

16、株3 35 5株株1 1株株采样对象采样对象 以采集以采集土壤土壤为主。为主。 一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。果园内。 采样的对象也可以是植物，腐败物品，某采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。些水域等。(1)(1)采样采样从自然界中采样从自然界中采样采样季节：采样季节： 以温度适中，雨量不多的以温度适中，雨量不多的初秋初秋为好。为好。采土方式：采土方式： 在选好适当地点后，用小

17、铲子除去表土，取离地在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面面5-25cm5-25cm处的土约处的土约10g10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。分离。采样的注意事项采样的注意事项1 1、采样时应尽可能、采样时应尽可能保持相对无菌保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须、所采集的样本必须具有某种代表性具有某种代

18、表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数以及采集地点的地理、生态参数等；等；4 4、应充分、应充分考虑采样的季节性和时间因素考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；菌群的出现可能是短暂的；5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于44下，下，但但贮存时间不宜过长贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就微生物群体就脱

19、离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。土样采集方法土样采集方法 森林、旱地，草地可先森林、旱地，草地可先掘洞掘洞，由土壤，由土壤下层向上层顺序采集下层向上层顺序采集； 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集插入圆筒采集。如。如果层次要求不严格，可取离地面果层次要求不严格，可取离地面5 525cm25cm处的土。将采集到处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物在采集植物根际土样时，一般

20、方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约根，在大量无菌水中浸渍约20min20min，洗去粘附在根上的土壤，洗去粘附在根上的土壤，然后再然后再用无菌水漂洗下根部残留的土用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土为根际土样。，这部分土为根际土样。有关从土壤中采样的补充：有关从土壤中采样的补充：(1)(1)根据土壤特点采样根据土壤特点采样有机质含量和通气状况有机质含量和通气状况耕种地、菜园地：耕种地、菜园地：有机质多，通气好，适合细菌和放线菌生长；有机质多，通气好，适合细菌和放线菌生长；森林地：森林地：植被厚，有机质丰富，但通气差，适合酵母菌和霉菌生长；植被厚，有机质丰富，但通气差，适合酵母菌

21、和霉菌生长；深度：深度：5 525cm25cm，酵母菌分布最浅，约为，酵母菌分布最浅，约为5 510cm10cm。霉菌在浅土中。霉菌在浅土中。pHpH值值偏碱土壤偏碱土壤(pH7.0(pH7.07.5)7.5)：细菌和放线菌细菌和放线菌偏酸土壤偏酸土壤(pH7.0)(pH7.0)：霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌地理条件地理条件南方比北方分离的菌种多。南方采土南方比北方分离的菌种多。南方采土5 525cm25cm，北方采土，北方采土101030cm30cm采样季节：采样季节：秋季最理想秋季最理想有关从土壤中采样的补充：有关从土壤中采样的补充：(2)(2)根据微生物生理特点采样根据微生物生理特点采样根据

22、微生物营养类型根据微生物营养类型 微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有很大关系。微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有很大关系。如产纤维素酶的微生物多数在枯枝和木材地采样。如产纤维素酶的微生物多数在枯枝和木材地采样。根据微生物的生理特性根据微生物的生理特性 在筛选一些具有特殊性质的微生物时，要根据该微生物独在筛选一些具有特殊性质的微生物时，要根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常要到温度较高的南方或温泉、火山附近采样。通常要到温度较高的南方或温泉、火山附近采样。植物体采集方法植物体采集方法 在采集叶面时，

23、一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并并注意不要损伤周围边缘。注意不要损伤周围边缘。 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。叶上的取样部位。 采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际采集根系时，一般与根际土样一起保存。土样一起保存。水样采集方法水样采集方法 用于细菌检测的水

24、样应收集于用于细菌检测的水样应收集于100m1100m1干净、灭菌的广口塑干净、灭菌的广口塑料瓶中。料瓶中。 由于表层水中含有泥沙，故在采样时由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中应在较深的静水层中采集水样采集水样。 方法是：握住采样瓶底浸入水中方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm30-50cm处，然后瓶口朝处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。大的弧度。水样不应装满采样瓶

25、。所有水样都应在所有水样都应在24h24h之之内迅速进行检测，或者内迅速进行检测，或者44下贮存。下贮存。(2)(2)增殖培养增殖培养( (富集培养富集培养) ) 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。性培养基，选择一定的培养条件来控制。 应遵循的原则：应遵循的原则：投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗。 如何实现？如何实现？(1)(1)控制培养基组分控制培养基组分 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或例如碳源利用的控制，可选定

26、糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。(2)(2)控制培养条件控制培养条件 例如在筛选嗜热菌时，应当在高温下进行富集培养，例如在筛选嗜热菌时，应当在高温下进行富集培养，那些不耐热的非目标菌则可能会死亡。那些不耐热的非目标菌则可能会死亡。 常见的培养条件参数：常见的培养条件参数：温度、温度、pHpH、渗透压、溶氧、渗透压、溶氧

27、等。等。投其所好：投其所好：取其所抗：取其所抗： 主要是加入抗生素，杀死或抑制非目标菌。主要是加入抗生素，杀死或抑制非目标菌。(1)(1)细菌的富集培养细菌的富集培养 加入加入50 U/mL50 U/mL的的制霉菌素制霉菌素，抑制真菌的生长。，抑制真菌的生长。(2)(2)放线菌的富集培养放线菌的富集培养 加入加入0.050.05 SDSSDS，抑制细菌的生长，激活放线菌孢子；加入，抑制细菌的生长，激活放线菌孢子；加入50 50 U/mLU/mL的的制霉菌素制霉菌素、0.8 mg/L0.8 mg/L青霉素青霉素和和5mg/L5mg/L氟哌酸氟哌酸，抑制细菌和真，抑制细菌和真菌。菌。(3)(3)真

28、菌富集培养真菌富集培养 加入加入青霉素青霉素、链霉素链霉素和和四环素四环素各各30 U/mL30 U/mL抑制细菌和放线菌。抑制细菌和放线菌。(4)(4)芽孢菌的富集培养芽孢菌的富集培养 加热杀死营养体。加热杀死营养体。(3)(3)培养分离培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法：纯种分离的方法：稀释平

29、皿分离法、划线分离法、稀释平皿分离法、划线分离法、透明圈法透明圈法( (水解圈水解圈) )、变色圈法、生长圈法、抑菌圈、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法、单细胞挑取法、选择培养基分离法。法、单细胞挑取法、选择培养基分离法。稀释平皿分离法稀释平皿分离法 把土壤样品以把土壤样品以十倍的级差十倍的级差，用无菌用无菌水进行稀释水进行稀释，取一定量的某一稀释度的，取一定量的某一稀释度的悬液，涂抹于分离培养基的平板上，经悬液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，根据菌落形态，过培养，长出单个菌落，根据菌落形态，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。1.稀释平皿分

30、离法稀释平皿分离法稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/10010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml10-3倾注平皿分离法倾注平皿分离法涂布平皿分离法涂布平皿分离法划线分离法划线分离法 用接种环取部分样品或菌体，在事先已用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。后备用。 本方法操作简便、快捷，效果较好。本方法操作简便、快捷，效果较好。Inoculating an agar plate to

31、obtain single coloniesMixed culturePure culture平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法透明圈透明圈( (水解圈水解圈) )分离法分离法 在平板培养基中在平板培养基中加入溶解性较差的底物加入溶解性较差的底物，使培，使培养基浑浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产养基浑浊。能分解底物的微生物会在菌落周围产生透明圈生透明圈( (浑浊的底物被利用后就变透明了浑浊的底物被利用后就变透明了) )，圈的圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力大小初步反应该菌株利用底物的能力。 该法适用于该法适用于分离水解酶产生菌分离水解酶产生菌，如蛋白酶、脂，如蛋白酶

32、、脂肪酶产生菌；另外也适用于肪酶产生菌；另外也适用于有机酸产生菌株有机酸产生菌株的分的分离。离。变色圈分离法变色圈分离法 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物培养基中加入可在底物培养基中加入指示剂指示剂或或显色剂显色剂，使，使所需微生物能被快速鉴别出来。所需微生物能被快速鉴别出来。 例如：在筛选果胶酶产生菌时，可在底物例如：在筛选果胶酶产生菌时，可在底物培养基中加入培养基中加入0.20.2的的刚果红刚果红溶液染色溶液染色4h4h，具有分解果胶能力的菌落周围会出现绛红色具有分解果胶能力的菌落周围会出现绛红色水解圈。水解圈。用刚果红染色法鉴定筛用刚果红染

33、色法鉴定筛 选降解纤维素的菌株选降解纤维素的菌株 抗生素产生菌筛选抗生素产生菌筛选羧甲基纤维素钠作培养物羧甲基纤维素钠作培养物检定菌培养，加上检定菌培养，加上发酵液发酵液变色圈分离法变色圈分离法生长圈分离法生长圈分离法 生长圈分离法生长圈分离法通常用于分离筛选氨基酸、通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。核苷酸和维生素的产生菌。 工程菌工程菌一般是一般是营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株，将待检，将待检菌涂布于高浓度的工具菌并缺少所需营养物菌涂布于高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株周围就能形成一个浑

34、需的营养物，在该菌株周围就能形成一个浑浊的生长圈。浊的生长圈。嘌呤营养缺陷型大肠杆菌嘌呤营养缺陷型大肠杆菌+ +不含嘌呤的底物培养基不含嘌呤的底物培养基 将待检将待检测菌涂布测菌涂布嘌呤产生菌嘌呤产生菌嘌呤产生菌的筛选嘌呤产生菌的筛选抑菌圈分离法抑菌圈分离法 常用于抗生素产生菌常用于抗生素产生菌的分离筛选。的分离筛选。工具工具菌采用抗生素的敏感菌。菌采用抗生素的敏感菌。若被检测菌能分若被检测菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，变会在该菌周围形成工具菌不能生长的抑变会在该菌周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。菌圈，很容易被鉴别出来。抗生素敏

35、感菌抗生素敏感菌+ +不含抗生素的底物培养基不含抗生素的底物培养基 将待检将待检测菌涂布测菌涂布抗生素产生菌抗生素产生菌抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选单细胞挑取分离法单细胞挑取分离法 将待分离菌株涂布在完全培养基上，待将待分离菌株涂布在完全培养基上，待菌落长出后，根据菌落形态等外观不同，挑菌落长出后，根据菌落形态等外观不同，挑选出所需的菌株。选出所需的菌株。Mixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEach colony was examined microscopically选择培养基分离法选择培养基分离法 将待分离菌涂布在不同的培养基上，

36、根将待分离菌涂布在不同的培养基上，根据要求选出目的菌株。据要求选出目的菌株。细菌采用细菌采用牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基；培养基；放线菌采用放线菌采用高氏高氏培养基；培养基；酵母菌采用酵母菌采用麦芽汁麦芽汁培养基；培养基；霉菌采用霉菌采用查氏查氏培养基；培养基；1.dilute sample1 ml9 ml101 102 103 104 105 106 107牛肉膏培养基牛肉膏培养基土豆培养基土豆培养基高氏培养基高氏培养基(4)(4) 扩大培养与复筛扩大培养与复筛 这一步是采用这一步是采用与生产相近的培养与生产相近的培养基和培养条件，通基和培养条件，通过三角瓶的容量进过三角瓶的容量进行小型发

37、酵试验，行小型发酵试验，以求得适合于工业以求得适合于工业生产用菌种。生产用菌种。(4)(4) 扩大培养与复筛扩大培养与复筛 操作方法：操作方法： 培养基：培养基：液体培养基液体培养基( (组成接近工业化生产组成接近工业化生产) ) 培养方法：培养方法：摇瓶振荡培养摇瓶振荡培养( (每株每株3 35 5瓶瓶) ) 鉴定方法：鉴定方法：先在先在161626cm26cm或或181828cm28cm的玻璃板上，制备的玻璃板上，制备含有工具菌或底物的平板，平板厚度为含有工具菌或底物的平板，平板厚度为3mm3mm，用内径，用内径5m5mmm的钢圈打孔。取过滤后的发酵液的钢圈打孔。取过滤后的发酵液10uL1

38、0uL置于孔内，于最适置于孔内，于最适条件下培养一段时间，则在孔的周围就会有水解圈、生长条件下培养一段时间，则在孔的周围就会有水解圈、生长圈、抑菌圈等，再圈、抑菌圈等，再根据圈的大小取舍菌种根据圈的大小取舍菌种。 注意：若产量很高或菌活性很强时，则可以用注意：若产量很高或菌活性很强时，则可以用滤纸片法滤纸片法。(5)(5)发酵性能测定与毒性实验发酵性能测定与毒性实验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微业有关的菌种，更应慎重。

39、据有的国家规定，微生物中除生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。(6)(6)菌种的保藏菌种的保藏(1)(1)斜面斜面【短期：短期：1 13 3个月个月】；(2)(2)沙土管沙土管【适合放线菌或霉菌的孢子适合放线菌或霉菌的孢子, ,保藏几年保藏几年】；(3)(3)冷冻冷冻【液氮超低温，液氮超低温，196196度，保藏度，保藏2020年年】。三三. . 液体深层发酵液体深层发酵液体深层发酵主要有

40、三种类型液体深层发酵主要有三种类型 分批发酵分批发酵(batch-fermentation)(batch-fermentation) 补料分批发酵补料分批发酵(fed-batch fermentation)(fed-batch fermentation) 连续发酵连续发酵 (continuous fermentation)(continuous fermentation)在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。是目是目前传统发酵工业所采

41、用的主要发酵形式。前传统发酵工业所采用的主要发酵形式。主要步骤包括培养基制作、发酵过程和产品分离主要步骤包括培养基制作、发酵过程和产品分离, ,生产间断，生产间断，时间较长，成本较高。时间较长，成本较高。在由于细胞的生长状态、细胞代谢和养分的消耗等因素影响，在由于细胞的生长状态、细胞代谢和养分的消耗等因素影响，培养基的成分、微生物的密度、微生物内部的化学组成和目培养基的成分、微生物的密度、微生物内部的化学组成和目的蛋白或代谢产物的含量都在不断的发生变化；的蛋白或代谢产物的含量都在不断的发生变化；分批发酵分批发酵(batch-fermentation)(batch-fermentation)分批

42、发酵的特点：分批发酵的特点： 微生物所处的环境是不断变化的。微生物所处的环境是不断变化的。 可进行少量多品种的发酵生产。可进行少量多品种的发酵生产。 发生杂菌污染能够很容易终止操作。发生杂菌污染能够很容易终止操作。 当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策。改变处理对策。 对原料组成要求较粗放。对原料组成要求较粗放。分批发酵的特点：分批发酵的特点： 分批培养过程中细菌生长曲线：可分为分批培养过程中细菌生长曲线：可分为调整期、对数生调整期、对数生长期、平衡期和衰亡期长期、平衡期和衰亡期四个阶段。四个阶段。 研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的

43、对数生长期研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数生长期细胞。细胞。 在发酵工业生产中，在发酵工业生产中，使用的种子应处于对数生长期使用的种子应处于对数生长期，把，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。短生产周期。 在研究和生产中，时常需要延长细胞对数生长阶段在研究和生产中，时常需要延长细胞对数生长阶段。 发酵过程中细胞数量与时间的关系发酵过程中细胞数量与时间的关系1 1延迟期延迟期2 2加速期加速期3 3对数期对数期4 4减

44、速期减速期6 6死亡期死亡期5 5停滞期停滞期分批发酵分批发酵(batch-fermentation)(batch-fermentation)分批发酵产物形成的动力学分批发酵产物形成的动力学 ( (一一) )生产连动型产物形成生产连动型产物形成 (I (I型发酵型发酵) ) 生产连动型产物通常都生产连动型产物通常都直接涉及微生物的产能降解代直接涉及微生物的产能降解代谢途径，或是正常的中间代谢产物。谢途径，或是正常的中间代谢产物。 酵母发酵生成酵母发酵生成酒精酒精，以及，以及葡萄糖酸葡萄糖酸和和大部分氨基酸大部分氨基酸、单细胞蛋白单细胞蛋白都属于这种类型。都属于这种类型。 在这种类型的发酵中，在

45、这种类型的发酵中，微生物的生长、碳水化合物的微生物的生长、碳水化合物的降解代谢和产物的形成几乎是平行进行的，营养期和降解代谢和产物的形成几乎是平行进行的，营养期和分化期彼此不分开。分化期彼此不分开。 分批生物工艺中各种比速率分批生物工艺中各种比速率( (生长速率生长速率、基质消耗、基质消耗qkqk和产物形成和产物形成qp)qp)之间关系的图示之间关系的图示(a)(a)生长连动型生长连动型生产连动型产物的生成反应可表示如下：生产连动型产物的生成反应可表示如下：生产连动型产物的合成速率与微生物的比生长速率以及培养基中的菌生产连动型产物的合成速率与微生物的比生长速率以及培养基中的菌体浓度呈正比。体浓

46、度呈正比。产物形成的比速率则与微生物的比生长速率呈正比。产物形成的比速率则与微生物的比生长速率呈正比。所以，所以，对于这种类型的产物来说，调整发酵工艺参数，使微生物保持对于这种类型的产物来说，调整发酵工艺参数，使微生物保持高的比生长速率，对于快速获得产物、缩短发酵周期十分有利。高的比生长速率，对于快速获得产物、缩短发酵周期十分有利。 部分生长连动型产物又称混合型产物，它们通常都间部分生长连动型产物又称混合型产物，它们通常都间接地与微生物的初级产能代谢途径相关，接地与微生物的初级产能代谢途径相关，是由产能代是由产能代谢派生的代谢途径产生的谢派生的代谢途径产生的。 产物的形成只与发酵被中的菌体浓度

47、有关，而微生物产物的形成只与发酵被中的菌体浓度有关，而微生物的生长速率对它无直接影响。的生长速率对它无直接影响。 对于这一类型发酵，对于这一类型发酵，只要能保证获得足够高浓度的生只要能保证获得足够高浓度的生物量，就可以获得高速率的产物合成。物量，就可以获得高速率的产物合成。 ( (二二) )部分生长连动型产物形成部分生长连动型产物形成 (II(II型发酵型发酵) ) 分批生物工艺中各种比速率分批生物工艺中各种比速率( (生长速率生长速率、基质消耗、基质消耗qkqk和产物形成和产物形成qp)qp)之间关系的图示之间关系的图示(b)(b)部分生长连动型部分生长连动型其生成反应可表示为：其生成反应可

48、表示为： 柠檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸柠檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸为这种类型产物的典型代为这种类型产物的典型代表。表。 在分批发酵中，这种类型产物的形成分成两个极限：在分批发酵中，这种类型产物的形成分成两个极限：起初起初，微，微生物消耗大量底物用于产能代谢和生长，而产物形成很缓馒，生物消耗大量底物用于产能代谢和生长，而产物形成很缓馒，甚至根本不形成；甚至根本不形成； 此后此后，当微生物的生长速率开始减慢后，细胞开始大量消耗底，当微生物的生长速率开始减慢后，细胞开始大量消耗底物以合成产物。物以合成产物。 对这类产物来说，对这类产物来说，营养期和分化期在时间上是彼此分开营养期和分化期在时间

49、上是彼此分开的。的。 ( (三三) )非生长连动型产物形成非生长连动型产物形成 (型发酵型发酵) )非生长连动型的产物一般不是直接或间接来自微生物的产能非生长连动型的产物一般不是直接或间接来自微生物的产能降解代谢，而是降解代谢，而是通过两用代谢途径合成通过两用代谢途径合成的。的。在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级代谢和菌体生长，在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级代谢和菌体生长，而没有产物的合成。此时，营养物质的消耗非常大。而没有产物的合成。此时，营养物质的消耗非常大。当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生长停止以后，产当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生长停止以后，产物才开始通过中间

50、代谢大量合成。即产生该类产物的微生物，物才开始通过中间代谢大量合成。即产生该类产物的微生物，其营养期和分化期在时间上是完全分开的。其营养期和分化期在时间上是完全分开的。 非生产连动型的非生产连动型的产物大多数是微生物的次级代谢产物产物大多数是微生物的次级代谢产物，大多，大多数的数的抗生素抗生素和和生物毒素生物毒素，以及，以及维生素维生素类。类。 分批生物工艺中各种比速率分批生物工艺中各种比速率( (生长速率生长速率、基质消耗、基质消耗qkqk和产物形成和产物形成qp)qp)之间关系的图示之间关系的图示(c)(c)非生长连动型非生长连动型 在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发在传统的分

51、批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。酵开始前加入反应器中的。 一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓度并不十一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓度并不十分高。即使营养物质浓度再进一步提高，比生长速率分高。即使营养物质浓度再进一步提高，比生长速率也不会再增加了。也不会再增加了。 然而，然而，在分批发酵工艺中低浓度培养基中的营养物在分批发酵工艺中低浓度培养基中的营养物质会迅速耗尽，引起微生物过早地从指数生长期向稳质会迅速耗尽，引起微生物过早地从指数生长期向稳定期转变，定期转变，这样，设备的利用率和产物的积累浓度都这样，设备的利用率和产物的积累浓度都不高。不高。高底物浓度的

52、缺点：高底物浓度的缺点： 提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期，从而提，从而提高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度；高发酵的设备利用率、容积产量和产物的积累浓度； 但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响但过高的底物浓度往往会引起一系列的不利影响，如，如底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。底物抑制、粘度升高引起的传质效率降低等。 尤为严重的是，尤为严重的是，微生物的许多次级代谢产物的产生，微生物的许多次级代谢产物的产生，都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的都受高浓度的葡萄糖、碳水化合物以及含氮化合物的降解产物的抑制。降解产物的抑制

53、。 指发酵开始时投入一定量的培养基，在发酵过程的适当指发酵开始时投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或时期，开始连续补加碳或( (和和) )氮源或氮源或( (和和) )其他必需基质，其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次放出；一次放出； 这种发酵方式可以延长对数期与静止期的持续时间，增这种发酵方式可以延长对数期与静止期的持续时间，增加生物量的积累，保持较高的活菌体浓度，也能增加静加生物量的积累，保持较高的活菌体浓度，也能增加静止期细胞代谢产物的积累；止期细胞代谢产物的积累； 目前工业上应用最广的发酵

54、方式。目前工业上应用最广的发酵方式。 分批补料培养技术是介于分批培养相连续培养之间的分批补料培养技术是介于分批培养相连续培养之间的一种发酵技术。一种发酵技术。 由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料由于在发酵过程中向发酵罐中补加了物料，分批补料系统不再是一个封闭的系统。系统不再是一个封闭的系统。 分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。料流速而变化的变量。分批补料培养特点：分批补料培养特点： 与传统分批发酵相比，其优点在于使

55、发酵系统中维持与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。很低的基质浓度。 低基质浓度的优点为：可以除去快速利用碳源的阻低基质浓度的优点为：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾。避免培养基积累有毒代谢物。的矛盾。避免培养基积累有毒代谢物。 适用范围：补料分批发酵适用范围：补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。等的生产。 指指在向反应器中添加培养基的同时，从容器中放出等体积在向反应器中添加培养基的同

56、时，从容器中放出等体积的培养液，就可以形成一个生产细胞的连续过程，即在培的培养液，就可以形成一个生产细胞的连续过程，即在培养器中所形成的新细胞数量与从容器中流失的细胞数目相养器中所形成的新细胞数量与从容器中流失的细胞数目相等，反应体系达到稳态；等，反应体系达到稳态；连续发酵存在的问题连续发酵存在的问题 特别是特别是以中间代谢产物为发酵产品的发酵，在理论和实践以中间代谢产物为发酵产品的发酵，在理论和实践上都没有完全解决上都没有完全解决，如发酵过程中微生物生理生化特性变，如发酵过程中微生物生理生化特性变化，发酵动力学等并未充分了解。化，发酵动力学等并未充分了解。在生产上要保持在连续发酵的整个过程中

57、，生产菌株不发在生产上要保持在连续发酵的整个过程中，生产菌株不发生退化也十分不容易。生退化也十分不容易。长时间的连续发酵中长时间的连续发酵中对发酵设备和空气净化系统的无菌要对发酵设备和空气净化系统的无菌要求更高。求更高。不能保持长时间的无菌操作是导致连续发酵失败不能保持长时间的无菌操作是导致连续发酵失败的主要原因。的主要原因。对于某些原材料价格昂贵的产品，由于对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利连续发酵对基质利用率较低用率较低，往往造成生产成本的增加。，往往造成生产成本的增加。 不论哪种发酵方式，都需要对发酵的各种参数不论哪种发酵方式，都需要对发酵的各种参数进行监控分析，如溶解氧

58、浓度、温度、进行监控分析，如溶解氧浓度、温度、pHpH、种、种龄与接种量等。龄与接种量等。 温度是发酵成功最基本的参数之一；基本准则是温度是发酵成功最基本的参数之一；基本准则是防防止低温和高温休克止低温和高温休克(heat shock);(heat shock); 通常在生物学范围内每升高通常在生物学范围内每升高1010，生长速度就加快，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。温度直接影响其生长和合成酶。 机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着

59、温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。 微生物可生长的温度范围较广微生物可生长的温度范围较广, ,总体说在总体说在-1095-1095。 任何微生物的生长都需要有最适的生长温度，在此温任何微生物的生长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。度范围内微生物生长繁殖最快。 如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐培养耐高

60、温的菌种高温的菌种有一定的生产现实意义。有一定的生产现实意义。 绝大多数微生物的最适绝大多数微生物的最适pHpH是是5.5-8.55.5-8.5，在发酵过程中，在发酵过程中，由于代谢物的不断释放，反应器中的由于代谢物的不断释放，反应器中的pHpH可能发生变化，可能发生变化，因而须对其进行检测，并根据结果调整；因而须对其进行检测，并根据结果调整； 培养基中的培养基中的pHpH值与微生物生命活动有着密切关系，各值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的种微生物有其可以生长的和最适生长的pHpH范围。范围。 微生物通过其活动也能改变环境的微生物通过其活动也能改变环境的pHpH值。值。 发