连接产物的转化ppt课件

1、衔接产物的转化1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化；3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,衔接； 一 实验目的 掌握细菌转化的普通技术和原理。 二 实验原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研讨领域的根本实验技术之一。使受体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。 通常所用的受体是大肠杆菌。 用于转化的细菌被称为感受态细胞。 所谓的感受态，即指受体或者宿主最易接受外源DNA

2、片段并实现其转化的一种生理形状，它是由受体菌的遗传性状所决议的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态普通出如今对数生长期，新颖幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进展胜利转化的关键。 Ca2+处置的感受态细胞，其转化率普通能到达5x1062x107 转化子/ug质粒DNA，可以满足普通的基因克隆实验。如在Ca2+ 的根底上，结合其它的二价金属离子如Mn2+ 、Co2+ 、DMSO或复原剂等物质处置细菌，那么可使转化率提高1001000倍。 大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由Cohen于于1972年发现的。其原理是细菌处于年发现的。其原理是细菌处于0，

3、CaCl2的低渗溶的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA构成抗构成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞外表，经钙磷酸复合物粘附于细胞外表，经42短短时间热冲击处置，促使细胞吸收时间热冲击处置，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培复合物，在丰富培育基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转育基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培育基化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培育基平板上，可选出所需的转化子。平板上，可选出所需的转化子。 除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不

4、除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需求预先诱导细菌的感受态，依托短暂的电击，促使需求预先诱导细菌的感受态，依托短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能到达进入细菌，转化率最高能到达1091010转化子转化子/ug闭闭环环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。因操作简便，愈来愈为人们所接受。DNA分子转化分以下几步:1. 吸附双链DNA分子吸附于受体菌外表；2. 转入双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；3. 自稳外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；4. 表达一供体基因伴随复制子同时复制，分裂， 转录翻译重组子的挑选重组子的挑选 抗生素标志法：菌株为某种抗生缺陷型，

5、抗生素标志法：菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因而质粒上带有该抗性基因如氨苄青霉素，如氨苄青霉素， 卡那霉素等这样只需转化子才干在含该抗生素卡那霉素等这样只需转化子才干在含该抗生素的培育基上长出。的培育基上长出。 互补法：如今运用的许多载体如互补法：如今运用的许多载体如PUC系列有含有一个大肠杆菌系列有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因半乳糖苷酸基因lacZ的调控序的调控序列和头列和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌那么含编码受体菌那么含编码半乳糖苷酶端半乳糖苷酶端aa的序

6、列。的序列。半乳糖苷酶表半乳糖苷酶表达，达， 在底物在底物5溴溴4氯氯3吲哚吲哚D半乳糖苷半乳糖苷x-gal培培育基中构成兰色菌落。育基中构成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而呵斥插入失活，而使而当有外源基因插入到多克隆原点，从而呵斥插入失活，而使lacZ基因不表达而构成白色菌斑。基因不表达而构成白色菌斑。 经过颜色不同而区分重组子和非重组经过颜色不同而区分重组子和非重组子。子。 实验步骤： 1将将2l衔接产物与衔接产物与100l感受态细胞在冰上混匀，并静置感受态细胞在冰上混匀，并静置30min，42下处置下处置60sec，然后参与，然后参与600l的的LBA-液体液体培育基，在摇床上培育基，在摇床上37摇动培育摇动培育1hr。 2