第二章_酶工程-酶的发酵生产

1、第二章 酶的发酵生产第一节 酶生物合成的基本理论一、中心法则1958年 Crick：DNA RNA 蛋白质转录翻译ATCGAUCG43=64遗传密码氨基酸折叠密码 二、RNA的生物合成转录RNA的种类dsRNA:某些病毒遗传信息载体 催化活性RNA：催化作用tRNA：氨基酸载体rRNA：与蛋白质共同组成核糖体mRNA：蛋白质合成模板sRNA：分子修饰、代谢调节作用（一）RNA的种类和主a要功能以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在依赖DNA的RNA 聚合酶作用下，生成RNA的过程。（二）转录RNA+4nPPinATPnGTPnCTPnUTPDNA模板，Mg2+/Mn2+RNA聚合酶大肠杆菌RN

2、A聚合酶：MW=5x105（三）RNA聚合酶全酶：由 组成，识别转录起始位点，与DNA上的启动基因结合，使转录开始。核心酶：由 组成，进行核苷酸链的延伸。真核生物RNA聚合酶：三种聚合酶种类RNA聚合酶IRNA聚合酶IIRNA聚合酶III别名rRNA RNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶存在位置核仁核仁核之相对分子质量/103550600600催化反应产物rRNAmRNAtRNA5SrRNARNA生物合成的起始位点在DNA的启动基因（启动子)上（四）转录的起始起始阶段的重要问题是RNA聚合酶与DNA的启动基因的相互作用，起始阶段包括：全酶的形成酶与模板结合酶与启动基因结合模板DNA

3、局部变性转录开始RNA转录泡，17bpDNA5353活性中心RNA-DNA杂交体，8bp 重旋解旋酶的移动方向 （五）转录的延伸模板DNA分子上每个基因或每个操纵子都含有一个终止信号终止子。当RNA聚合酶转录到达这个信号时，合成的RNA分子以及聚合酶与模板DNA分离，RNA链的合成便被终止。 （六）转录的终止5ATPADP+PiRNA聚合酶终止子1.剪切反应2.剪接反应3.末端连接反应：（七）RNA前体的加工tRNA3-末端加上CCA-OH尾巴在mRNA的5-末端加上“帽子”结构5-m7GpppNmpNp在mRNA 的3-末端连接polyA尾巴tRNA5-末端加上甲基鸟苷酸核苷修饰反应二、蛋白

4、质的生物合成翻译以mRNA为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译。DNA aRNA 蛋白质转录翻译ATCGAUCG43=64遗传密码氨基酸遗传密码的简并性： 密码子 5-X Y Z-3反密码子 3-X Y Z-561种密码20种氨基酸遗传密码的通用性 密码子与反密码子的相互作用： mRNAtRNACrick根据立体化学原理，于1966年提出了摆动假说：密码子与反密码子的配对中，前两对严格按照碱基配对原则，而第三对碱基则可以有一定自由度地摆动，所以，某些tRNA的反密码子可以识别一个以上的密码子。1.氨基酸活化生成氨酰-tRNAaa

5、tRNA+ATP aa-tRNA+AMP+PPi 氨酰-tRAN合成酶 大肠杆菌，肽链合成的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸：MettRNAF+ATP Met-tRNAF+AMP+PPi甲酰转移酶fMet-tRNA2.肽链的合成起始30s亚基IF-3mRNAmRNAGTP-IF-2-fMet-tRNAfMRA50s亚基IF-1+IF-2+IF-3GDP+PifMet3.肽链的延伸 mRNAfMetaa2fMetfMetaa1aa1EF-TGTP*aa1EF-TGDP+Piaa1aa1aa1fMettRNA2+EF-G+GDP+Pi+EF-G+GTP+EF-T+GDP+Piaa2+EF-T+GTP+

6、EF-G+GTPtRNA1EF-GGDP+Piaa2fMetfMetaa2aa1fMet4.肽链的终止终止密码子：UAA, UAG, UGA释放因子（Release Factor）:RF-1：UAA, UAGRF-2：UAA, UGA5.翻译后加工去除甲酰基去除N-末端的氨基酸肽链折叠三、酶生物合成的调节转录水平的调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解调节组成酶：DNA酶，RNA酶， 糖酵解途径的酶调节酶：适应酶，-半乳糖苷酶（诱导酶）酶的类型酶合成的调节控制1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说调节基因：产生阻遏蛋白启动基因操纵基因：与阻遏蛋白结合结构基因：蛋

7、白多肽链产物操纵子1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点（一）操纵子学说 R P O S1 S2 DNA调节基因启动基因操纵基因结构基因与阻遏蛋白结合1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点产生阻遏蛋白mRNA操纵子原核生物中操纵子的类型1.诱导型操纵子：乳糖操纵子2.阻遏型操纵子：色氨酸操纵子（二）原核生物中酶生物合成的调节机制1.分解代谢物阻遏作用2.酶生物合成的诱导作用3.酶生物合成的反馈阻遏作用1.分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。cAMP + H2O AM

8、P磷酸二酯酶 葡萄糖过量降解ATPADP, AMPcAMP-CRP启动基因上没有 cAMP-CRP结合酶合成例：葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成2.酶生物合成的诱导作用加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。简称为诱导作用，起诱导作用的物质，称为诱导剂。举例： 乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成 R P O S1 S2 DNA无诱导物时：添加诱导物时： R P O S1 S2 DNA诱导物转录翻译mRNA酶乳糖 别乳糖3.酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻遏作用）是指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶无

9、阻遏物时：添加阻遏物时： R P O S1 S2 DNA翻译mRNA R P O S1 S2 DNA共阻遏物磷酸单酯 磷酸+醇碱性磷酸酶（三）真核生物中酶生物合成的调节机制1.细胞分化改变酶的生物合成2.基因扩增加速酶的生物合成3.增强子促进酶的生物合成4.抗原诱导抗体酶的生物合成1.细胞分化改变酶的生物合成355TTGGGGTTGGGG3CCAACCCC35端粒酶RNADNA355TTGGGGTTGGGGTTGGGG3CCAACCCC35端粒酶RNADNA355TTGGGGTTGGGGTTGGGG3CCAACCCC35端粒酶RNADNA端粒酶催化端粒的延伸（1）结合（2）延伸（3）移位2.基

10、因扩增加速酶的生物合成基因扩增：是通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式。例：CHO在含有氨甲蝶呤的培养基上培养 编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，二氢叶酸还原酶合成速度加快。增强子：又称调变子，是一段能够高效增强或促进基因转录的DNA序列。增强子的重要特性是能够促进同源或异源启动基因的转录活性，其增强效果有时可达1000倍。3.增强子促进酶的生物合成4.抗原诱导抗体酶的生物合成 1948年Pauling提出过渡态理论 1975年Kohler合Milstein发明单克隆抗体技术 1986年Lerner合Schultz分别独立获得具有催化活性的抗体第二节 酶的生物合成法生产一、基本概念 酶的

11、生物合成：所有的生物体在一定条件下都能够产生多种多样的酶。酶在生物体内的产生过程，称为酶的生物合成。 酶的生物合成法生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要的酶的过程。二、酶的生物合成法生产种类微生物发酵产酶植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶优良的产酶细胞应具备的条件 1.繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期。 2. 能在便宜的底物上良好生长。 3. 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。 4. 产生的酶容易分离纯化。 5. 不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。 1. 大肠杆

12、菌特征：细胞成杆状，0.5m*（13） m，无芽孢，G-，菌落从白色到黄色，光滑闪光，扩展。产酶种类：一般生产胞内酶谷氨酸脱羧酶，天冬氨酸酶，苄青霉素酰化酶，基因工程研究用酶等三、酶发酵生产常用的微生物 2. 枯草芽孢杆菌特征： 细胞成杆状，（0.70.8）m*（23） m，单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，G+，菌落粗糙，不透明。污白色或微带黄色。产酶种类： -淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等3. 链霉菌特征： 最高等的放线菌。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、65孢子丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。产酶种类

13、：-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等4. 黑曲霉特征： 属于半知菌亚门, 菌丝有隔,细胞多核；部分气生菌丝细胞形成特化的厚壁、膨大的足细胞，由足细胞的中间稍呈垂直地向上延长，形成分生孢子梗。 产酶种类：糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等特征：属于半知菌亚门,分生孢子梗基部无足细胞，孢子梗顶端不膨大成囊，而是多次分枝形成扫帚状，小梗末端形成分生孢子。产酶种类：葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶等 5. 青霉四、产酶菌种的筛选方法 胞内酶：含菌样品的采集菌种分离产酶性能测定复筛 固体培养法：把菌种接人固体培养基中,保温数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测定酶活力,这种方

14、法主要适用于霉菌.液体培养法：将菌种接人液体培养基后,静置或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异),再测定培养物中酶的活力,通过比较,筛选 胞外酶：五、酶的发酵生产方式 1.固体培养发酵2. 液体深层发酵3. 固定化细胞4. 固定化原生质体发酵第四节 发酵工艺的条件及控制保藏细胞细胞活化细胞扩大培养发酵分离纯化酶原生质体培养基固定化原生质体固定化细胞预培养无菌空气酶发酵生产的一般工艺流程一、细胞活化与扩大培养细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活力，这就叫细胞的活化。 种子培养基：用于细胞扩大培养的培养基。氮源丰富碳源少温度、pH、溶

15、解氧接种量：110% 二、培养基的配制培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。 碳源氮源无机盐生长因素三、pH调节1.细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH值往往不同，通常接近于该酶反应的最适pH。2.有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。3.培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往会发生变化。 四、温度的调节控制1.细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。2.有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。五、溶解氧的调节控制调节溶解氧的方法：（1）调节通气量（2）调节氧的分压（3

16、）调节气液接触时间（4）调节气液接触面积（5）改变培养基的性质六、微生物产酶的方式及特点1.固体培养发酵优点：设备简单、操作方便、麸曲中酶浓度较高、适合霉菌培养发酵缺点：劳动强度大、原料利用率低、生产周期长2.液体深层发酵3.固定化细胞4.固定化原生质体七、提高酶产量的措施1.添加诱导物酶的作用底物:酶的反应产物:酶的底物类似物: 葡萄糖：1个-半乳糖苷酶 乳糖：3000个半乳糖醛酸诱导果胶酶纤维二糖诱导纤维素酶异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍2.控制阻遏物的浓度：无机磷是碱性磷酸酶的阻遏物3.添加表面活性剂：增加细胞的通透性4.添加产酶促进剂：聚乙烯醇提

17、高糖化酶的产量机理尚不清楚 八、酶发酵动力学发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响的学科细胞浓度/（mg/mL）酶浓度/(单位/ml)细胞浓度/（mg/mL）O A B C DO-A调整期 A-B生长期B-C平衡期 C-D衰退期时间/hI-同步合成型 II-延续合成型III-中期合成型 IV-滞后合成型时间/hIIIIIIIV（一）酶生物合成模式（二）各种酶生物合成模式的特点1.同步合成型例：单宁诱导米曲霉合成单宁酶1.生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏。2.酶所对应的mRNA很不稳定。细胞浓度/（mg/mL）时间/h酶

18、浓度/（单位/mL）0 20 40 60细胞浓度 总酶浓度 胞外酶浓度 胞内酶浓度特点：2. 延续合成型例：果胶诱导黑曲霉合成聚半乳糖酸酶1.生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏。2.酶所对应的mRNA很稳定。细胞浓度 总酶浓度 细胞浓度/（mg/mL）时间/h酶浓度/（单位/mL）0 20 40 60特点：3.中期合成型例：枯草杆菌合成碱性磷酸酶1.生物合成受反馈抑制。2.酶所对应的mRNA不稳定。细胞浓度 酶浓度 细胞浓度/（mg/mL）时间/h酶浓度/（单位/mL）0 20 40 60特点：4. 滞后合成型1.酶在对数期不合成。2.酶所对应的mRNA稳定。例：黑曲霉合成酸性蛋白酶细胞浓度 酶浓度 细胞浓度/（mg/m