江南大学发酵工艺学原理讲义及思考题

1、发酵工艺学原理讲义及思考题开课背景（1）何为工艺学？原来的工艺学的特性：（2）现在：强化工艺学的基本理论背景，减小课时数，以单元操作为主线条的工艺学原理第一章绪论1-1 发酵工艺学的基本概念一、发酵工业的基本概念微生物学中的发酵的定义： 微生物发酵工业的概念：1.发酵工业生产的基本模式讲述生物工业的基本生产模式，引出生物技术、生物工程的概念，讲述两者之间的区别与2.发酵工业的分类酿酒业（啤酒、葡萄酒、白酒）。厌氧发酵调味品（酱油、醋）。酵母工业自然发酵。氨基酸发酵典型的代谢控制发酵。抗菌素发酵次级代谢控制发酵。酶制剂工业具有重要的意义，是工业发展的基础、科学研究的基础有机酸工业柠檬酸、葡萄酸、

2、乳酸、琥珀酸等。石油发酵 降低石油熔点（ 石油脱腊） 工业乙醇、丙醇等好氧发酵维生素发酵VC、VB2生理活性物质白介2环境工业废水的生物处理，废弃物的生物降解二、微生物发酵的基本特征 1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程由于微生物生理特性决定了微生物在发酵过程中需要稳定的环境、特殊的条件以及以氧作为底物的供给，这些多涉及到化工生产的一下领域：（1）（2）质量的传递氧的供给、代谢物的排泄等热量的传递微生物呼吸产热，微生物生长于代谢需要稳定的而严格的温度条件。动量的传递涉及到搅拌轴功率的计算，他与溶氧、气液混合的关系微生物的反应工程涉及到微生物的生长动力学模型的建立，产物生成动力学模型的建立。（

3、3）（4）2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵从微生物发酵的历史角度看，最早的微生物发酵是一个自然发酵过程，现代微生物工业通常是指微生物的代谢控制发酵？定义：是指利用生物的、物里的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之的过程。、积累、我们所需要的以 GA 发酵为例，建树微生物代谢控制发酵的意义。3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业有以下几个特征：（1） 反应条件温和通常由于微生物的生理特性，要求温度为 30-40 pH 值中性偏酸性酵母、霉菌、放线菌等pH 值中性偏碱性细菌的发酵（2） 无菌发酵整个反应过程要求无菌：培养基无菌、空气无菌、 补料和取样要求无菌操

4、作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。（3） 非连续性生产微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：啤酒的连续化生产1-2 微生物工业发酵的历史及发展方向一、微生物工业发酵的历史微生物发酵有着悠久的历史，几千年前的酿造实质上就是一个典型的微生物发酵过程，尽管近几十年的来微生物发酵不但在应用领域上更加广泛，更重要的是建立了许多新的微生物发酵理论体系，诸如：代谢控制发酵、 工程菌发酵等微生物发酵的发展可以分为以下几个阶段：1.自然发酵阶段传统的酿造业，目前在的地位。2.纯培养阶段经济和生活中仍然占有重要这一阶段是微生物发酵工业

5、从自然发酵发展到今天的代 谢控制发酵的转折点，由于微生物纯培养技术的建立和发展， 大大推动了发酵过程的控制，提高了发酵生产效率，更重要的是推动了微生物学科的发展，使人们从简单的发酵现象中发现了微生物的存在，进而对微生物有了进一步的认识和了解；在此基础上发展起来的菌种的分离、无菌技术、纯培养技术、菌种诱变等为后来的微生物发展奠(dian)定了基础。3.通气搅拌发酵阶段1929 年，弗莱明发现了青霉素，并证明了其在医学上的作用，但是青霉素的工业化生产却限制了他的广泛应用，特别是 20 世纪的三、四十年代广泛流行的肺结核，以及第二次期间大量的伤病员，推动了青霉素工业化生产的科学研究与开发。当时，10

6、00 个 300ml 的三角瓶连续摇动 7 天，方能生产出 80 万单位的青霉素 1 只，可见。后来美国的化学工程师参与了青霉素的工业化生产的研究，发明了一个 2 吨的通气搅拌发酵罐，4.代谢控制发酵阶段代谢控制发酵的概念的提出最早源于人在 GA 发酵上取得的成功。1956 年人“木下”，利用成功地进行了 GA 的发酵法生产，从此以后，“木下”等人致力于相关的发酵的理论研究，并正式提出了“代谢控制发酵” 的概念。利用代谢控制发酵的基本理论，目前已成功地进行了大多数的氨基酸的发酵法生产，同时也完成了诸如：肌苷酸（AMP）、干扰素等新型的开发生产。代谢控制发酵理论的建了和应用为微生物工业发酵的理论

7、和实践作出了贡献，也是未来微生物发酵工业研究和发展的方向（为何这样讲？）大多数的工业并不是微生物代谢的末端产物，而是微生物代谢的中间性物质，要必须解除他们的代谢调控机制、积累这些物质，二、微生物发酵工业的发展方向微生物发酵工业有着悠久的历史，在国名经济中占有重要的地位，21 世纪又是生物的，体现在哪里？1. 从工业领域看微生物发酵将占据越来越重要的地位，具体的讲：（1） 通过生物工程解决能源问题能源问题是全球决？的问题，生物工程如何解太阳能淀粉、纤维素 酶工程G 发酵 乙醇能源乙 烯（目前已取得性进展）生物工程作为桥梁，2000 年世界产值已达 50 亿（2） 取代部分化工工业许多化工的生产由

8、于严重的污染和生产效率问题，而为生物工程取代，例如：乙醇、甘油、乳酸等（3）农业：生物农业、农加工等方面（4）：2.从角度看，应下列领域：（1）酶制剂工业：即是生产工具，又是科学研究的工具和基础（2）新型抗菌素工业和维生素行业（3）氨基酸及多肽发酵(4)生物免疫物质：白介素-2、干扰素、抗肿瘤物质等（5）细胞工程及3.从科学技术角度看（1） 底物基质的转变以葡萄糖为底物的发酵转变为以更为广泛的基质为原料，特别是以废弃物为基质的发酵，废弃物是其发展方向。（2） 开发新化利用现物技术为基础，开发新，新的层出不穷，使得微生物发酵向经济的各个角落渗透。（3） 微生物发酵向着大型化、自动化、连续化的方向

9、发展。英国3000m2化学公司，甲烷菌发酵罐的容积已达到自动化：电子计算机的广泛应用以及发酵过程中的各种参数的自动检测，使得，发酵工业回顾？三、建国 50四、本课程的内容和任务本课程是生物工程专业本科生的专业基础必修课程，是一门以微生物、生物化学、化工原理等课程为基础，以微生物发酵过程中各种单元操作为主线条，对微生物发酵过程中的基本原理进行阐述的课程。其基本内容如下：1.发酵生产用菌种及其有关知识菌种选育包括菌种保藏生产过程中菌种的扩大培养2.培养基的及灭菌包括：工业发酵用原料的选择与处理培养基的灭菌原理和方法工业灭菌的工程计算发酵机制包括：乙醇、甘油、谷氨酸、柠檬酸、赖氨酸、抗生素等发酵过程

10、及控制包括：温度的变化及控制pH 值的变化及控制3.4.氧传递动力学的消长规律及控制：酶乐和：生化生产工艺，浙江大学参考书：1.2.3.4.姚淑华：微生物工程工艺原理，华南理工大学刘如林：微生物工程概论，南开大学张克旭：氨基酸工艺学，轻工业陈宁:代谢控制发酵，轻工业思考题：能源问题是全球遍综述。的问题，生物工程将如何解决？写出一第二章微生物发酵用菌种及其扩大培养2-1 微生物发酵工业用菌种一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA 的发酵：-以淀粉质为原料：要求

11、VH ,以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的 VH 但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点： 1.具有稳定的遗传学特性这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，、基质、溶氧等）2.微生物生长和产物的对于基质没有严格的要求换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物， 某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一， 这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。3.生长条件易于满足在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供

12、给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。pH 值:中性偏酸性，偏碱性，的状态。pH 值易改变产物和底物4. 对于细菌，希望具有抗 Phage 的能力。5. 具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。6.对于胞外，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。对于胞内，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；对于

13、工程菌，通常目的产物存在于包含体 内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。二微生物发酵工业用菌种的种类野生型从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：培养：营养缺陷型从微生物分类学的角度，分为1. 细菌类： 短杆菌：GA,Gln,lys枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温 -淀粉酶) -Amylase苏云金芽孢杆菌：BT 生物梭状芽孢杆菌：、丁酸等的发酵2. 酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵酵母：汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母：scp 生产，石油发酵3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-

14、11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红素的生产；豆腐乳的生产等赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等2-2 微生物用菌种的扩大培养一、菌种扩大培养的目的 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。目的就是：a、缩短发酵周期降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌， 抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势

15、也是酵法，往往是一种行之有效的方法。例如：啤酒的发2.让菌种从固试管、液体试管，逐步适应， 例如：啤酒发酵3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐” 现象。许多生产菌种往往都是“溶原性”的？通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。二、扩大培养的方法通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲液体法：液体1. 液体扩培流程培养，适合于众多发酵行业固体试管三角瓶大三角瓶一级二级三级发酵罐2. 固体扩培流程固体试管制曲）三角瓶种曲麸曲（机械通风两者的优缺点比较：固体培养（1

16、）酶活力高。（因为菌丝体密度大）（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低缺点：分离成本。（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。（2）周期长。（3）培养过程境条件控制较难。（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。液体培养（1）生产效率高，便于自动化管理。（2）生产过程中温度、溶氧、pH 值等参数可以实现全面控制。（3）通常生产液体缺点：，整个生产周期较短。（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。现物技术的发展是以工程菌为主导

17、的微生物发酵领域，其菌种的培养要求无菌程度高，而且培养过程中的条件要求也非常严格（否则易发生变异导致质粒丢失），从这种意义上讲，固体菌种的养为主导方式。应该指出的是：是难以实现的，因此，应以液体培随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了。例如：的生产原生产工艺流程为：其中以酵母为线条的生产工艺为： 以霉菌为线条的生产工艺为：现在：（1）酵母使用粉末酵母母细胞鲜压榨酵母固定化酵（2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代三、菌种扩大培养的条件：菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。1.培养基：

18、培养不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。例如：啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下：固体试管（无酒花）液体试管（有酒花）三角瓶（有酒花）大三角汉逊罐罐用的培养基也通常，对于用的培养基，摇瓶与不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。例如：HASS（高温淀粉酶）三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖3m3罐：液化淀粉2.温度扩大培养的温度，从试管到三角瓶到罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。例如：

19、啤酒酵母扩大培养固体28液体25三角瓶20大三角瓶15汉逊罐10-15需要指出的是：（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异 的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物温度为 32-34（2）扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。3.氧的供给菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等，后述。4.pH

20、 值菌种扩大培养的 pH 值很重要，直接影响到菌体的正常生长， 需要注意以下两点：（1） 扩培选择的 pH 值是菌体的最适生长 pH 值，往往与发酵最适 pH 值不同。（2） 培养基灭菌后，通常其 pH 值要下降 0.51.0 个单位，因此，（三角瓶灭菌后，不能够调整 pH 值，不宜无菌操作）思考题：1.比较固体培养与液体培养的优缺点。2.说明菌种扩大培养的条件。3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？4.工业生产用菌种的基本要求有什么？第三章微生物用培养基及灭菌本章的主要内容：1.培养基的2.starch 的水解3.培养基的灭菌约4 学时3-1 培养基的及要求一、培养基用原材料及要求微生物发酵领

21、域其本质，也可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物，在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：（1）产物的效益，（2）物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等对于特定的已知产物，在选择培养基原料时，则应注意以下几个原则：1、培养基原材料的要求（1）价格低廉，易得到（价格低，但不一定易得到，例如：地瓜干）（2）对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质（3）微生物的代谢产物无有害物质。2、培养基用原材料的种类碳源starch 及其水解糖液含有 starch 及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等化工石油：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等氨水、

22、尿素（有脲酶的微生物），以流加形式使用(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL 等氮源豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白？、 玉米蛋白粉等二、培养基的种类固体发酵生产培养基厌氧发酵需氧发酵按用途可分为培养基摇瓶培养基（优化工艺）检查培养基：HASS 发酵用的检查培养基：营养琼脂 0.5%0.55%、SarchGlucose 0.5%2%，平板培养，根据透明圈的大小本章涉及到的培养基为：生产使用的培养基三、培养基的1.培养基配制的原则培养基是发酵成功与否的第一个要点，一个完整而科学的培养基是很重要的，也是非常艰巨的任务。通常需要考虑以下几个方面的问题：培养基（1）合适的 C/N

23、，不同的微生物、同一种微生物不同的菌株，其对培养基中的C/N 要求是不一样的，同一菌株在不同的发酵阶段，其对 C/N 的要求也不一样。例如：黄源胶（Xanthan Gum 发酵）：前期，较低的 C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：但是，在黄源胶的生物期，则需要较高的 C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。在大多数情况下，C/N 要求在 0.22.0。对于一些特殊的情况，例如谷氨酸发酵，在谷氨酸生物期，则要求 C/N 为：100/15-21。（2）在确定了 C/N 的前提下，需要研究的是不同的氮源，对发酵的影响。虽然 C/N 确定，但是氮

24、源的利用其本质就是：pr肽AA,通过 AA 而被利用，不同的氮源，其 AA 的组成与比例也不相同， 对其发酵结果的影响也不相同。有人在 HASS(高温淀粉酶)的发酵过程中，向培养基中添加某些 AA（亮，异亮）则有利于高温淀粉酶的的表达，发酵液中的酶活力则明显得到提高。（3）大多数的工业培养基都使用玉米浆。玉米浆内含有 VH，它是菌体生长和代谢的所必需的一种辅酶， 通常玉米浆与：a.b.c.菌体的增殖速度有关与菌体细胞膜的有关，从而影响到细胞膜的通透性对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。（4）生长因子：大多数菌体的生长因子如下：a.维生素：大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，150g

25、/L。b.AA，凡是微生物自身不能的 AA 则必须以游离的 AA 或者小的肽提供，通常，以小的肽提供，微生物更易通过细胞膜进入菌体内部 ?，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。嘌呤及其衍生物c.2.培养基的优化方法一种培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。介绍一种数学方法：均匀实验设计方法旋转正交实验方法.这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于

26、多因素、多水平的一种实验设计方法。参考文献：方开泰:均匀正交实验方法雄宗贵:发酵工艺学原理3-2 培养基用材料及处理发酵培养基用原料是非常广泛的，许多原材料需要经过处理后方能够使用，特别是以淀粉质为原料的发酵工业，大多数的情况下需要将淀粉进行水解处理。本节内容：starch 的水解；糖蜜的预处理；工业用添加剂一、淀粉的水解许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使 Glucose 等单糖，主要有下列菌种：酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等大部分的细菌：GA 产生菌、Lys 产生菌、苏云金芽孢杆菌等其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。霉菌：大部分的

27、霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法，分别介绍如下：1.淀粉的水解方法（1）淀粉的酸法水解水解原理：淀粉是由葡萄糖通过-1，4 或-1，6 葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度 来表示淀粉的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉健的水解速度。链断裂，高温可葡萄糖苷水解条件：高温，120以上，H+,0.2MPa 的缺点：反应条件比较强烈，产

28、生的副产物较多.主要有下列副产物：a. 双葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖，前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。b. 一葡萄糖脱水，形成 5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。c. 一葡萄糖和NH2 反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。(美拉得反应)2.酸酶法3.酶酸法4.双酶法：使用两种淀粉水解酶：-淀粉酶淀粉 -1，4；1，6 葡萄糖苷酶。-淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉 -1，4 葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉化的含义？其水解速度随水解成短链糊着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之， 该酶不可能将淀粉完全水

29、解成葡萄糖（从水解 葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业 意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。淀粉 -1，4；1，6 葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉的 -1，4；或 -1，6 葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的水解产物为葡萄糖。链越短水解速度越快，酸法与双酶法的优缺点比较：（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。有的人会问？目前采用的耐高温-淀粉酶的作用温度也是较高，100，和酸法水解的温度相差不多。双酶法淀粉水解首先使用耐高 -淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。（2）正因为上述

30、原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高 10%以上。这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。例如：对于年产 10000 吨的小型味精厂，年增产 100 吨味精，直接经济效益可达到：0.8*100=80 万元。（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。（4）双酶法水解使用的淀浓度较高，可以达到 20Be 以上，而采用酸法水解，淀的浓度通常只有 12Be，原因？（副产物）意义？（设备利用率）介绍液体浓度Be的概念：波美度（Be）是表示液体浓度（比重）的体比重之间有下列关系：法，其和液d = /- Be式中d：液体的比重：模数

31、* 因标定的温度不同可将波美表分为：美国：15.6标定，=145合理：15标定，=144.3荷兰：12.5标定，=144标定方法：轻表：“0”Be 的位置，把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置；“10” Be 的位置，把表放在一定温度下的比重为 0.9351的溶液中的位置。重表：“0”Be 的位置，该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中；“66”Be 的位置，该位置是把表放在一定温度下的比重为1.842 的浓硫酸溶液中。表示溶液的比重的方法还可以使用 Bx(玻利克斯)：定义：某一溶液的 Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。注意： Bx 的概念不同于波美度，他与比重之间

32、是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。2.淀粉的双酶法水解工艺淀粉调浆液化糖化过滤糖液浆液浓度：2030Be,调 pH 值 6.07.0，添加 CaCL2,使用量，0.01mol/L（目的？）液化：耐高温 -淀粉酶，酶的使用量：58/g 淀粉温度：105；时间，2030 分钟降温：采用喷射冷却方法：糖化：使用淀粉 -1，4；1，6 葡萄糖苷酶；使用量：根据液化淀粉的浓度，30%的浓度，80100/g 淀粉温度：65终点判断： 时间，23 小时。二、糖蜜的处理1.糖蜜的主要成分（1）糖，4950%，因不同的原料和生产方法不同而异， 主要是蔗糖（2）胶体物质，510%，来自于原料（3）灰分，

33、1012%（4）生物素，110mg/Kg(甘蔗)，0.040.06 mg/Kg(甜菜)（5）pH 值 6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素2.用途（1） 发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，（2）使用糖蜜生产（3）使用糖蜜生产蒸馏酒姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方主要用于鸡尾酒的勾兑上。（4）作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。（5）使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究。3.处理方法处理目的：a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的性， 有利于改善发酵过程中氧的传递。b

34、.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？），对影响，对微生物的生长和代谢有影响。的质量有c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对 pH 值有影响的缓冲性物质。方法：a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥发性物质。（是为了提高 KLa 是错误的）中提到的通风b.加絮凝剂（PAM）聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。工艺过程：原溶液（稀释）40Bx调 pH 值(33.8)絮凝静置絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1 小时加热到 90C.活性炭吸附法可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽

35、，对发酵的的提出和质量有益。缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。三、工业培养基的添加剂添加剂通常是指除了培养基中的 C、N、无机盐、金属离子以外的其它物质，主要有：1.前驱物质特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的发酵生产，添加一定量的前驱物质（前体）其作用是非常明显的。基本原理：（1）S前驱物质产 物反馈抑制的存在，需要添加前驱物质不存在抑制或阻遏（2）S前驱物质的和成效很低，需要添加前驱物质（3）SX前驱物质产物存在分枝代谢，不能够很好的解决分枝代谢对 X 的反馈抑制作用，须要有添加剂注意：前驱物质的使用，因不同的菌种、不同的产物、不同的代谢机制而使用的方法不同，使用的浓度也不同，但都

36、是建立在对其代谢调节机制有从分的了解的基础上的。 2.代谢促进剂和代谢抑制剂促进剂主要是指诱导物，在酶的生产；抑制剂主要在抗菌素的生产中使用的较多。例如：（1）四环素发酵过程中，添加 NaBr,可以抑制金霉素的生物，从而提高四环素的产率。（2）头孢霉素 C，添加 LMet，可以抑制头孢霉素 N 的生物，从而提高头孢霉素 C 的产率。上述这些情况，抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链具有分枝代谢上的，如下图所示：SABC产物副产物（X） 抑制剂作用点，通常是 X 的结构类似物2-3 培养基的灭菌一、灭菌原理所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，这一概念不同于。后者是指消灭一切致病

37、微生物（病原体）灭菌的方法很多，在可以使用干热灭菌、对于环境可以使用化学试剂灭菌，但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌 ？湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。下述内容就是针对湿热灭菌的。首先讨论几个基本概念：1.微生物的热阻定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。相对热阻：两种微生物的热阻之比。例如：芽孢/大肠杆菌=

38、3000000/1；2.理论灭菌时间/大肠杆菌=15/1 等微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单 反应的速度理论，那么，则有下列方程：-dN/dt = k * N式中-dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数K：表示灭菌过程中菌体的速度常数，K=f(灭菌温度、菌种、培养基等)上式的形式为：t = 2.303/k * lnN0/NS式中N0，NS： 分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）k：意义同上 t ：表示理论灭菌时间理论灭菌时间

39、的计算需要注意以下几个问题：（1）K 值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻 越大，K 值也越大。例如：芽孢，在 121时，K=60/s营养体，在 121，k=606*1010/s(2)在计算过程中，N0，NS 如何取值？N0 = 芽孢性细菌总数 + 芽孢数灭菌时温度升高，营养体即可变成芽孢对于 NS ，如果取 NS = 0，那么，t = ，这显然是与现实情况不符。-3对于如何 NS 取值？通常取 NS = 10 ，这个数值如何理解？灭菌 1000 次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接

40、反应了该生产过程中的技术管理水平。（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因此在实际生产中，通常采用经验数值：间歇灭菌，121，2030 分钟连续灭菌，137，1530s，在维持罐中保温 820 分钟。3.灭菌温度的选择灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：a.微生物的热致死温度，应高于该温度。通常以芽孢为准。何为热致死温度？（10 分钟，全部的温度）b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 因此，灭菌温度的选择，应是在保证

41、灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：dc/dt = - K，C式中dc/dt：表示营养成分破环的速率，C：表示营养成分的浓度K，：为反应速度常数，1/s，K = f( t,)反应速度常数K，与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：A，e-E/RT=（1）K，式中K，：反应速度常数，1/SE,：反应的活化能（J/mol）R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*kT：反应的绝对温度，k同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：Aexp-E/RTK =（2）

42、（1）、（2）式可以改写成下列形式：lg(k, /k, ) = E,/R(1/T T )2112（3）lg(k2/k1) = E/R(1/T1 T2 )（4）（3）（4）的意义是指：反应的温度从 T1其反应的速度常数分别从 k, 增加到 k, ；k121升高到 T2 ，增加到 k2；培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体的两个平行性反应，如下所示：BAC对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：,lg(k2/k1)/lg(k 2/ k 1)= E /E, (5)实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能 E 的值为E, =

43、8.3683.6*103 J/mol而菌体的活化能 E芽孢：E = 418*103 J/molE =无芽孢：E = 209250*103 J/mol显然，（5）式的比值 1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。通常所说的高温短时 灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。但是高温短时灭菌是需要一定的设备条件的，通常需要连续化的

44、灭菌工艺流程？（高温后的快速冷却在大型的生物反应器内是很难实现的）这就给中小型生产企业带来了一定的，设备投资的增加，技术管理水平的提高（培养基连续灭菌后，后述设备的无菌化管理对于整系的无菌操作是必需的）高温短时灭菌 的优点还可以表现在：节省能量上，培养基的预热？二、培养基的工业灭菌方法培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念： 1.空消:意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高， 对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。2.实消：定义？优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。3.连消：定义？优点

45、营养成分破坏少，生产效率高热综合利用率高大型企业自动化程度高尽管，高温短时灭菌的优点非常明显，但不能说发酵领域采用高温短时灭菌是唯一的选择。一个生产企业灭菌方法的选择是要从生产工艺、设备、操作、技术管理、固定资产投资等多个方面整体考虑。目前，我国发酵领域仍然是以分批操作的实消为主，因此我们的后述内容主要是介绍分批操作的实消灭菌工艺。三、分批灭菌操作要点将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：1.定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。2.培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气？当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状

46、态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。讲一下，阀门的特殊性？3.培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到 100时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承， 另一方面，当培养基的温度升温到 100时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。4.注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。5.保温期间，要求罐压：0.090.10MPa，温度：118121，时间：30 分钟。6.灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。7.配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加 20

47、%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。四、分批灭菌的工程计算主要介绍一下传热计算（与毕业设计教学环节有关，与将来的实际工作关系更大）。1.升温阶段培养基在反应器内的升温有两种加热方式：（1）使用夹套、冷却排管（2）蒸汽直接加热（1）使用夹套、冷却排管t = W*C/ K*F ln (t1 t2s)/( t1 t2f)式中t：升温所需要的时间（小时）W： 培养基的重量，（Kg）F：总的传热面积，m2t1：加热蒸汽的温度，t2s：培养基加热的起始温度，t2f：培养基灭菌的温度，k：平均传热系数，KJ/m2*hr*因为在加热过程中，培养基的温度在不断升温，温差在变化，属于不稳定传热过程，其传热系数

48、k，应取平均值：夹套加热：k = 8301254 KJ/m2*hr*排管加热：k = 12541881 KJ/m2*hr*C：培养基的比热，KJ/Kg*比热 C 的计算方法：采用线性叠加法：C = 0.374.18*X +4.18（1-X）醪液中固形物的重量百分数%0.374.18：固形物的比热，KJ/Kg*任何以谷物、淀粉为原料的醪液，其比热都可以这样计算。（2）蒸汽直接加热加热的速度很快，时间不需要计算，需要计算的是蒸汽的消耗量：S = W*C(t2f t2s)+Q1 /( t2f)式中S：蒸汽的消耗量，KgQ1：发酵罐散失的热量，Q1 =Q 总 （1020）%：蒸汽的热含，KJ/kg(与

49、蒸汽的有关)t2f、t2s ：与上述相同2.保温阶段此时，打开发酵罐顶部的所有排气阀门，排蒸汽灭菌：蒸汽的消耗量 S 计算如下：S = 1.19 FT(P/)0.5式中S：蒸汽的消耗量，KgF：蒸汽排出口总面积，cm2T：排气的时间，分钟P：罐内绝对，MPa：蒸汽的比容，m3/kg3.冷却阶段需要计算的是冷却的时间，尽可能快的降温，减少培养基营养成分的损失。T = W*C1/G* C2 (A/1-A) ln（t1st2s/ t1ft2s）式中W、C1：分别表示培养基的重量和比热，Kg、KJ/Kg*G、C2：分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*t1s：培养基开始冷却的温度，即灭菌

50、温度，t1f：培养基需要冷却到的温度，即接种的温度，t2S：冷却水进口的温度，expKF/GC2A =（t1t2s/ t1t2）式中G、C2： 分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*F、K：意义同前t2S：冷却水进口的温度，t1：被冷却介质的任何一个温度，t2：与被冷却介质温度 t1 相对应的冷却水的出口温度，思考题：1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行有缺点比较？4.双酶法淀粉的水解通常使用哪 2 种酶？其作用特点分别是什么？5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符

51、合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。6.生物反应器灭菌的操作要点有什么，绘图说明操作过程。7以化学反应动力学为基础，说温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。8掌握以下几个概念：理论灭菌时间、对数残留定律、实消、空消、连消、波美度第四章发酵机制与代谢控制微生物的代谢产物很多，主要有乙醇、酶制剂、抗生素等，在这些产物中，乙醇、乳酸、氨基酸、乳酸等，微生物可以在特定的外部环境下生成，这类发酵我们称之为：自然发酵。而有些产物诸如：氨基酸、酶制剂等，正常的微生物是不能在培养基中大量的与积累，是需要通过：化学的、物理的、生物的等方法人为的改变其原来的代谢途径，使之能够累特定的产物，这类发酵称

52、之为：并积代谢控制发酵？对于前者，人们可以在简单了解其代谢机制的条件下，通过对环境的控制，来提高其产量和产率，而实现大规模的工业生产。（产量和产率？产量是指：一批次的产量；产率是指底物与 产物的转化率，产量高不一定产率高；相反，产率高不一定产量高，两者对于大规模的工业化生产都很重要）对于后者，人们不但需要严格的控制环境，通常还需要对其代谢机制有系统地了解，才能够提高其产量和产率。本章的主要内容就是研究微生物的各种代谢调节机制，有助于提高对微生物发酵的本质的认识。4-1 糖的代谢与调节本节主要介绍糖代谢的几条代谢途径，和其调节机制，并简单介绍糖代谢的直接产物：甘油、乙醇等厌氧发酵。一、糖代谢的途径糖代谢的主