发酵工程知识点

1、绪论1.传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。” 2.生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严 格 地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。3.工业上的发酵：在微生物工业中，把所有通过微生物或其他生物细胞（动、植物细胞）的培养，统称为 发 酵。包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素

2、、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶以及转化产物等。现代生物技术分子生物学与发酵工程氨基酸发酵工业谷氨酸、赖氨酸核酸发酵工业肌苷酸、乌苷酸微生物变异株通过代谢调节代谢控制发酵技术 切断支路代谢转折点: 酶的活力调控, 酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏) 解除菌体自身的反馈调节,提高终产物水平。细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量；酒曲是我国酿酒技术的重大发明，也是世界上最早的一种复合酶制剂。3、 发酵工程的组成从广义上讲，由三部分组成：上游工

3、程、发酵控制、下游工程4、 微生物发酵产品的类型:1,菌体、酶，2 初级代谢产物，3 次级代谢产物，4 外源物质转化产物。5、 发酵方法的类别与流程（1）类别：根据对氧的需要区分： 厌氧和好氧发酵 根据培养基物理性状区分： 液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分： 分批发酵和连续发酵 按发酵原料来区分: 糖类物质发酵, 石油发酵, 废水发酵 按发酵产物区分：氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵、酶制剂发酵 (2) 发酵流程：保藏菌种-活化-扩大培养-种子罐-主发酵-产物分离纯化-成品第2章 菌种选育理论与技术微生物的特点有些微生物能在厌氧的条件下生长有些微生物能够利用简单

4、的有机物和无机物满足自身的生长有些微生物能进行复杂的代谢有些微生物能利用较复杂的化合物有些微生物能在极端的环境下生长常见的工业微生物（1） 抗生素生产有关的微生物（二）氨基酸生产有关的微生物（三）食品酶制剂生产有关的微生物 a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、 枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌工业化菌种的要求1生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）2能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物3有关合成产物的途径尽能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强4遗传性能要相对稳定5不易感染它种微生物或噬菌体6生产特性要符合工艺要求1、 育种的目的（一）科研方面1获得有遗传标记的

5、菌株；2得到生物合成阻断变株，以研究抗生素生物合成途径。3了解菌种的遗传学背景。4提供分子生物学的研究材料。（二）生产方面1.提高产量；2.去除色素；3.去除多余组分，如黑暗链霉菌产生15个组分（氨甲酰妥布霉素，氨普霉素，氨甲酰卡那霉素B等）。4对不良环境产生抗性 如抗噬菌体、抗氨水、抗消沫剂等。工业菌种改良方法(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力

6、。(4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。2、 菌种选育的基本理论育种的方法自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、染色体重建(Genome shuffling)第1节 自然选育菌种分离的一般过程 eg 碱性纤维素酶产生菌的筛选一、采样时要注意的问题 结合产品的特点 来源要广气候、水分、空气标签：地点、时间、气候等2、 富集培养富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。富集的三种方案：定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。 当不可能采用定向

7、培养时，则可设计在一个分类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法 定向培养的富集方法 一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。1,底物 2，ph条件 3，培养时间 4，培养温度案例分析工业乳酸发酵的菌种选育符合工业生产的菌种的标准：经济性能好，能高效生产乳酸；同型发酵，即只生产单一的一种乳酸分子而无其他有机酸副产物；具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力；具有较高的耐热性；菌种的营养要求相对简单；选择抗噬菌体菌株。 小节：工业微生物的要求； 基本概念； 菌种选育的一般步骤；第4章 灭菌与除菌培养基灭菌

8、的目的在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。 第一节 灭菌和除菌的基本原理、方法灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物(营养体及其孢子)永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。一、灭

9、菌方法 化学物质灭菌 辐射灭菌 干热灭菌 火焰灭菌 湿热灭菌 过滤除菌一、热灭菌的原理 高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。湿热灭菌要比干热灭菌更有效，一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。热灭菌方法：常压法，加压法2、 湿热灭菌中的相关定义杀死微生物的极限温度称为致死温度 (lethal temperature)。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指

10、微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。3、 灭菌动力学1. 对数残留定律实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即： t：灭菌时间 s k：比死亡速率 s-1， dNt/dt 代表？(菌的瞬时变化速率) N0：开始灭菌时原有菌体数 Nt：残留菌体数，个/ml dNt/dt 代表？(菌的瞬时变化速率) 实验证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽

11、孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。2. 非对数死亡规律培养基灭菌需解决的工程问题* 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N(10-3)，需要多高的温度、多长的时间为合理。* 灭菌温度和时间的确定取决于：杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式* 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解第2节 培养基和发酵设备的灭菌在一定温度下，比死亡速率k随微生物种类不同而不同。 营养细胞VS芽孢(spore, endospore )同一种微生物来

12、说，比死亡速率k值随着温度的变化而变化。 阿仑尼乌斯定律 A：系数E：活化能 活化能E的大小对k值有重大影响。 其它条件相同时， E越高，k越低，热死速率越慢。 不同菌的孢子的热死灭反应E可能各不相同。 可得出结论： 反应的E越高，lnk对T的变化率越大，即：T的变化对k的影响很大培养基成分的破坏将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的E很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。二、培养基的灭菌方法（一）分批灭菌 1. 预热（前期）2. 预热（后期）3. 保温阶段 4. 冷却阶段（一）分批灭菌 在发酵罐中进行实

13、罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程（二）连续灭菌 1、定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132 ）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进

14、行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50 后，输送到预先已经灭菌过的罐内。 连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌优点：1不需附加设备2 蒸汽利用率高3 节约劳动力 缺点1 培养基质量比较差2  罐的利用率低 3. 冷却水用量大连续灭菌优点：1 采用高温快速灭菌法2可以把培养基按其性质分开灭菌3 有利于自动控制4 节省冷却水缺点1     投资费用高2      对物料要求高3   &

15、#160;  蒸汽用量大选择原则：1培养基成份（易降解成分、液化情况等）2设备状况（冷却面积、传动装置等）3. 动力条件  发酵设备的灭菌发酵罐空消之后不能立即冷却，先用无菌空气保压，待灭菌的培养基输入罐内后，才可以开冷却系统进行冷却。 分空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌，灭菌后用空气吹干备用。 补料罐的灭菌温度视物料性质而定，如糖水，灭菌时蒸汽压力为0.1MPa(121)，保温30分钟。油罐(消沫剂罐)灭菌时，其蒸汽压力为0.15-0.18MPa，保温60分钟。补料管路、消沫剂管路可与补料罐、消沫剂罐同时举行灭菌，保温时间为1小时。 移种管路灭菌一般要求蒸汽压

16、力为0.30.45MPa，保温1小时。 补料液的灭菌在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。第3节 空气灭菌无菌空气(Aseptic air)的概念发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。发酵用空气质量标准 连续提供一定量的压缩空气。 VVM来

17、表述：单位时间(min)、单位体积(m3)培养基中通入标准状况下空气的体积(m3)进入过滤器之前，空气的相对湿度70%进入发酵罐的空气温度可比培养基温度高出10-30空气除菌的方法（一） 辐射杀菌（二） 热杀菌 （三） 静电除菌（四） 过滤除菌 过滤除菌原理和介质一、定义过滤除菌 ：利用有孔介质从气体中除去微生物过 滤 机 理 直接拦截 惯性撞击 扩散拦截 重力沉降 静电吸附1） 直接拦截 流体中的基本过滤机制本质是一种筛分效应，机械拦截颗粒例如：一种简单的筛网可以拦截尺寸大于其孔径的颗粒通过搭桥作用，尺寸小于滤孔的颗粒也可被拦截：不规则形状的颗粒 / 方向性；多个颗粒同时撞击到同一

18、个滤孔空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。2）惯性撞击空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面，这种作用亦称惯性碰撞截留。截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，气流速度愈大，惯性力大，截留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。对大于 0.5 - 1.0 微米的颗粒很有效。3） 扩散拦

19、截气体分子 (作随机运动) 碰撞小颗粒或雾滴布朗运动(Brownian motion)碰撞的结果， 增加了颗粒碰撞过滤介质的机会仅在气体中有效对小细颗粒 (0.1 - 0.3微米)非常有效4）重力沉降作用重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。 5）静电吸附作用干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。悬浮在空

20、气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子有的带正电荷，有的带负电荷，也有中性， 这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附的作用。小结过滤介质的过滤 / 分离效率由于直接拦截 惯性撞击 扩散拦截 的共同作用而增强 空气过滤除菌流程流程的特点：两次冷却，两次分离，适当加热。空气过滤介质要求：除菌效率高 耐受高温高压 不易被油水污染 阻力小 成本低 易更换 常用的介质：棉花，棒状活性炭，玻璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、多孔陶瓷滤器烧结金属棒等。深层过滤所用的过滤介质棉花的纤维直径一般为16-20微米。 提高过滤效

21、率的措施 1、减少进口空气的含菌数。可以从以下几个方面着手：(1)加强生产环境的卫生管理，减少环境空气中的含菌量；(2)提高空气进口位置（高空采风），减少空气进口含量；(3)加强压缩前的空气预过滤。 2.设计和安装合理的空气过滤器。  3.降低进入总过滤器空气的相对湿度。主要从以下几个方面入手：(1)采用无油润滑空压机；(2)加强空气的冷却，去油水；(3)提高进入总过滤器的空气温度，降低其相对湿度。第5章 生产菌种的制备与保藏种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数

22、量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的 ： 接种量的需要 ， 菌种的驯化（缩短发酵时间、保证生产水平）种子的要求：总量及浓度能满足要求，生理状况稳定，个体与群体，活力强，移种至发酵后，能够迅速生长，无杂菌污染。第一节 生产菌种的制备过程一、种子制备的过程实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物-获得一定数量和质量的孢子，获得一定数量和质量的菌丝体。2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面

23、，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。3、 起始接种物的传代问题细菌：保藏斜面 活化斜面 产孢子：保藏 母斜面 子斜面要求：使菌种的传代次数尽可能的少。孢子培养母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月3、 生产车间阶段1、 培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间，有利于获得好的发

24、酵结果。2、 培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化3、 种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。第3节 种子制备过程举例制备过程斜面菌种-一级种子培养-二级种子培养-发酵1、 谷氨酸生产的种子制备1、斜面 (AS1.299)培养条件：32，生长18-24小时2

25、. 一级种子（摇瓶）培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培养12小时。3. 二级种子(种子罐)培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时4、种子的质量要求：108-109个/ml ，大小均匀，呈单个或八字排列，pH 7.0-7.2时结束，6.88活力旺盛二、青霉素生产的种子制备安培管-斜面孢子-大米孢子-一级种子-二级种子-发酵6） 种子级数的确定一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时工厂从第一级种子罐开

26、始计算发酵级数谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵 移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积 接种方法：单种法1个种子罐的种子接入1个发酵罐双种法2个种子罐的种子接入1个发酵罐倒种法以一个发酵罐部分发酵液给另一发酵罐作 为种子。 混种法以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子 第6章 发酵过程中的通气与搅拌 一、 氧在液体中的溶解1、溶解氧（DO; Dissolved Oxygen) 作为环境因素对微生物反应有直接影响； 被好氧性微生物吸收消耗，并直接参与生长代谢过程，可视为一种营养性底物。 难溶：25°C、一个

27、大气压，空气中的O2在纯水中的溶解度仅0.25mol/m3。发酵液中含有各种成分，其溶解度更低。 对于菌体浓度为1015个/m3的发酵液，假定每个菌体的体积为10-16 m3，细胞的呼吸强度为2.6×10-3 molO2/(kg)，菌体密度为1000 kg/m3，含水量80%，则每立方米培养液的需氧量为： 10-16×1015×1000×0.2 × 2.6×10-3 =0.052 molO2/(m3·s) 0.25 ÷ 0.052 = 4.8 (s) 培养液中的溶解氧最多可用4.8秒，因此必须连续通气。相关概念饱和

28、浓度：气体和溶液接触一定时间后，气体分子在气-液二相中的浓度，就会达到动态平衡，此时溶解到溶液中的气体分子数等于逸出溶液的气体分子数。若外界条件不变，气体在溶液中的浓度就不再随时间而变化，此浓度为饱和浓度或平衡浓度氧的饱和浓度单位：mmol O2/L, mg O2/L, ppm 或大气压摄氧率：单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量。记作 rO2 (mmol/L·h) rO2因微生物种类、代谢途径、菌体浓度、温度、培养液成分及浓度的不同而异。 rO2值的范围一般在 25100 mmol/L·h 比耗氧速率-相对于单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量。也称呼吸强度；用

29、QO2表示 (mmol O2 /g ·h)二者关系 X每升培养液中菌体量(干重)，g。 因菌种和反应条件而异，一般在1.515 mmol /g · h呼吸临界氧浓度（C临界 or CCr）：在溶氧浓度低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增加而变化，此时的溶氧浓度称为呼吸临界氧浓度。临界氧浓度与培养液的理化性质，发酵罐的结构有关。CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。氧在液体中的溶解特性：温度，溶液性质，氧分压 影响微生物需氧量的因素1、微生物种类2、培养基的组成与浓度3、菌龄4、培养条件5、有毒产物

30、的形成及积累第2节 氧的传质理论对于需氧的微生物反应，还存在一个氧从气相通过扩散进入液相，进而又经扩散进入絮凝体内部供给细胞进行呼吸的传递过程。一、氧传递的阻力 在好氧发酵中，对微生物的供氧过程，首先是气相中的氧溶解在发酵液中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上而被利用。氧传递可分供氧和耗氧两个方面：供氧方面 包括通过气膜、气-液界面、液膜及液体主流的扩散耗氧方面 包括氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜及细胞内的扩散。氧分子在一系列的扩散中，各步均有一推动力（氧的分压或浓度差）来克服各自的阻力。1、供氧方面的阻力1）气膜阻力（ 1/k1 ; 1/KG）：为气体主流及气-液界面的气膜阻力，与空

31、气情况有关。2） 气液界面阻力（1/k2；1/KI）：与空气情况有关，只有具备高能量的氧分子才能透到液相中去，而其余的则返回气相。3）液膜阻力（1/k3; 1/KL ）：为从气-液界面至液体主流间的液膜阻力，与发酵液的成分和浓度有关。4）液流阻力（1/k4; 1/KLB）：液体主流中传递的阻力；也与发酵液的成分和浓度有关。2、耗氧方面的阻力1）细胞周围液膜阻力（1/k5; 1/KLC） 与发酵液的成分和浓度有关。2）菌丝丛或团内的扩散阻力（1/k6; 1/KA）与微生物的种类、生理特性状态有关，单细胞的细菌和酵母菌不存在这种阻力；对于菌丝，这种阻力最为突出。3）细胞膜的阻力（1/k7; 1/K

32、W）：与微生物的生理特性有关。4）细胞内反应阻力（1/k8; 1/KR） 氧分子与细胞内呼吸酶系反 应时的阻力；与微生物的种类、生理特性有关。二、气液相间的氧传递和氧传质方程式供氧方面 由于氧很难溶于水，所以供氧方面的液膜阻力（1/k3 or 1/kL ）是氧溶于水时的限制因素。耗氧方面 实验和计算证实，细胞壁上与液体主流中氧的浓度差很小，即1/k5很小；而或菌丝团的阻力(1/k6)对菌丝体的摄氧能力影响显著。 在耗氧方面的主要阻力是1/k6、1/k7、1/k8。 在搅拌和合理的 工艺条件下，结团现象减少，因而能降低1/k6。 1/k8与微生物生长及代谢的条件有关，若生长条件合适，代谢产物能及

33、时移去，则1/k8就会减少，否则就会增大。氧传递的主要阻力存在于气膜和液膜中气体吸收是气相成分单向往液相扩散溶解的物质传递过程。 第4节 影响氧传递速率的因素据氧传质方程OTR = KL a · (C* - CL) 影响供氧的主要因素是推动力(C* - CL) 和体积氧传递系数KLa。一、 影响氧传递推动力的因素要提高推动力，只能设法提高C*或减少CL1、提高氧饱和浓度（ C*）要提高C*，可降低培养温度、提高氧分压和降低培养基浓度等。（但这几方面局限性都很大）2、 降低溶氧浓度 （CL） 降低CL可通过减少空气流量等方法来达到，但溶氧浓度不能低于临解氧浓度。另外，减少空气流量本身会

34、使KLa下降。二、影响体积吸收系数KLa的因素1、搅拌搅拌转速对KLa的影响很大，对微生物的摄氧率也有影响，但对C*无影响。 但过高的搅拌速度不但浪费动力，还会损伤菌体，引起菌体自溶及减产等。2、空气流速KLa随空气速度的增加而增大。一般而言，通气时，会降低发酵液粘度，降低搅拌功率，增加KLa在特定的条件下，通人发酵罐的空气流速增加时，搅拌功率会下降， KLa会增加；当空气流速达某一值时，增加空气流速，搅拌功率不再下降， KLa不再增加，此时的空气流速称为气泛点（Flooding piont）经验得出，对KLa的影响，搅拌功率远远大于空气流速3、发酵液理化性质的影响KLa与发酵液的粘度成反比关

35、系，在发酵过程中，微生物不断改变发酵液基质浓度，菌丝形态，菌体浓度及产物浓度，进而改变发酵液粘度，使KLa处于动态变化之中，尤其是放线菌，霉菌的发酵液4、空气分布器和发酵液高度对通气效率的影响生产实践证明，多孔环状鼓泡器的效果并不比单孔鼓泡器好。但多孔鼓泡器易堵。高位发酵罐，增加发酵罐的高度(D:H=1:7) ；增加了气-液接触时间，提高了氧的利用率。5、其它因素1）搅拌器形式、组数和间距对溶氧的影响2）有机物质和表面活性剂对KLa 影响3）压力的影响第5节 液相体积氧传递系数KLa的测定一、发酵液中溶解氧浓度的测定 亚硫酸盐氧化法 溶氧电极法 氧的物料衡算法 二、摄氧率的测定 用复膜氧电极停

36、气法测定。三、 液相体积氧传递系数KLa的测定方法：亚硫酸盐氧化法 直接测定-氧的物料衡算法 动态测定-溶氧电极法动态测定-溶氧电极法：优点：耐高温 连续测量原理：把溶解氧转化为电流信号。阳极：Pb阴极：Ag/Pt 电流直接指示溶解氧浓度。 4、 测定KLa的三个用途 1对生物反应器的传氧性能进行测定，以便选择最佳条件进行操作，并对其进行评价。2对发酵过程传氧情况进行了解，以便判断发酵过程的供氧情况。3为通风罐的研究过程找出设备参数(如D/T、Ni )，操作变数(如N，Q)与KLa的关系，以便进行通用发酵罐的放大和合理设计。五、提高溶氧的措施进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧的接触面积或提

37、高氧分压来提供溶氧速率：浅层液体培养；利用往复式或旋转式摇床（shaker）对三角瓶培养物作振荡培养；在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置。控制溶氧的工艺手段改变通气速率（通气量的改变）：在低通气量的条件下，增大通气量对提高Kla效果明显改变搅拌速度，较明显的增加Kla改变气体组成中的氧分压：即改变了空气中的氧浓度，因而提高了C*值，从而提高了供氧能力。该法在动植物培养体系中，已用于短时间提高溶氧。改变罐压改变发酵液的理化性质加入传氧中间介质：传氧中间介质是不溶于培养液的液体，对微生物无毒，本身具有较高溶

38、氧能力的有机体。传氧中间介质有血红蛋白、 烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）。 含氟碳化物小节：了解微生物对氧的需求并掌握其中的基本概念;掌握反应器氧的传递方程，及其参数的测定;深入理解KLa的意义;影响体积吸收系数KLa的因素第7章 发酵过程的控制发酵过程的代谢变化规律代谢变化就是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。代谢曲线：代谢变化是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。把它们随时间变化的过程绘制成图，就成为所说的代谢曲线。第一节 微生物发酵类型发酵过程按进行过程有三种方式：分批发酵，补料分

39、批发酵，连续发酵1、 分批发酵定义：是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。2、 分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。3、 分批发酵的优缺点优点：操作简单；操作引起染菌的概率低。不会产生菌种老化和变异等问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低。5、分批发酵的类型按照菌体生长，碳源利用和产物生成的变化）第一类型，第二类型，第三类型Piret's fermentation classificatio

40、n （按照产物生成与菌体生长是否同步）：生长关联型 (第一类型），生长无关联型（第二，三类型）第一类型（生长关联型）：产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开。例如单细胞蛋白和葡萄糖酸的发酵第二类型（部分生长关联型）：产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。第三类型（非生长关联型）：产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的。如抗生素发酵。生长关联型：产物形成与生长有关，如酒精、某些酶等。非

41、生长关联型：产物的形成速度与生长无关，只与细胞积累量有关。如，抗生素。从上述分批发酵类型可以分析：如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。2、 补料分批发酵1、定义 :补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2、补料分批发酵的优缺点优点:使发酵系统中维持很低的基质浓度；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。缺点:存在

42、一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。3、 补料分批发酵的类型(补料方式):连续流加，不连续流加，多周期流加补料成分：单一组分流加，多组分流加控制方式：反馈控制，无反馈控制4、 连续发酵1、 定义 培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。2、 连续发酵的优缺点优点:能维持低基质浓度；可以提高设备利用率和单位时间的产量；便于自动控制。缺点:菌种发生变异的可能性较大；要求严格的无菌条件。3、 连续发酵的

43、类型恒化培养: 使培养基中限制性基质的浓度保持恒定恒浊培养: 使培养基中菌体的浓度保持恒定第二节 工艺参数代谢参数按性质分可分三类：物理参数：化学参数：生物参数：从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。1、 物理参数:温度，压力，搅拌转速，搅拌功率，粘度，浊度，空气流量，料液流量二

44、、化学参数:1、pH(酸碱度) 2、基质浓度3、溶解氧浓度4、产物的浓度(mg(u)m1) 5、废气中的氧浓度(Pa) 6、废气中的CO2浓度()7、DNA含量8、关键酶三、生物参数:1、菌丝形态：以产黄青霉为例2、菌体浓度 第四节 菌体浓度的影响及其控制与菌浓相关的参数（1） 培养时间 （2） 补料量（3）培养温度 （4） 接种量比生长速率（µ）：单位时间单位重量菌体所生长出新菌体的数量（g/g·h)。比生产速率Qp：单位时间单位重量菌体所合成的产物量。比消耗速率：单位时间单位重量菌体所消耗碳源的数量。一、影响菌体浓度的因素（1）微生物的种类和自身的遗传特性的影响。（2）

45、营养物质和环境条件有密切关系。营养物质均存在一个上限浓度，在此限度以内，菌体比生长速率则随浓度增加而增加，但超过此上限，浓度继续增加，反而会引起生长速率下降。这种效应通常称为基质抑制作用。有机氮源有利于菌体生长。 （3）培养条件：温度，通气量，pH二、菌浓对发酵的影响 1、在一定的条件下，发酵产物的产量与菌体浓度呈正相关。2、菌体浓度过高时，则降低代谢产物的产量。三、最适菌浓的确定与控制 (一) 最适菌体浓度的概念 在一定的发酵条件下，使微生物的呼吸不受抑制时的最大菌体浓度。比生产速率(QP)：单位时间内单位质量的菌体所合成的产物的重量(g)。比生产速率(RP)：单位时间内单位体积的发酵液所合

46、成的产物的重量(g)。(三) 最适菌体浓度的控制：调整发酵培养基的成分和浓度;通过补料控制菌体浓度；通过补水控制菌体浓度通过培养温度控制菌体浓度第五节 营养基质的影响及其控制一、碳源1、碳源的浓度与代谢产物的产量关系 （1）碳源浓度低时，菌体生长缓慢，菌体容易衰老，产量降低。 （2）碳源浓度高时，菌体生长过快，产物合成量降低。2、碳源的种类及其对发酵的影响 （1）速效碳源：促进菌体生长，缩短菌体生长周期。抑制或阻遏代谢产物的合成。 （2）迟效碳源：逐渐被菌体利用，不抑制次级代谢产物的合成。2、 氮源1）速效氮源：促进菌体的快速生长抑制次级代谢产物的合成（2）迟效氮源：能持续释放出含氮物质，不抑

47、制次级代谢产物。有时可加入NH4+捕获剂，以解除NH4+对次级代谢产物抑制。三、磷酸盐的影响及控制磷酸盐的影响（1）有利菌体生长（0.32300mmol/l）（2）有利于次级代谢产物的合成（<1mmol/l）（3）对产物合成产生阻遏作用（10mmol/l）四、前体的影响及控制前体的影响（1）促进产物合成（2）浓度过大，对菌体产生毒性前体浓度的控制（1）采用多次补加前体的方式（2）将前体制备成毒性低的化合物第6节 温度的影响及其控制嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长 每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高

48、温度、最低温度来表征。发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。二、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热Q发酵所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。净热量：在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的

49、形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射四、最适温度的选择1、根据菌种及生长阶段选择。微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。2、根据生长阶段选择. 发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合

50、成到放罐。3. 根据培养条件选择通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。4, 根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。温度对发酵的影响：反应速率, 发酵方向第7节 pH的影响及其控制 一、发酵过程pH变化的原因 1、基质代谢 2、产物形成 3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。二 pH对菌体生长影响比产物合成影响小pH对发酵的

51、影响 （1）pH影响酶的活性。（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 (4)-pH影响代谢方向 pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响四、pH的控制方式1、调节好基础料的pH。2、在基础料中加入维持pH的物质3、通过补料调节pH, 当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH .选择合适的pH调节剂 发酵的不同阶段采取不同的pH值第八节 溶氧的影响及其控制溶氧对发酵的影响（1）溶氧对菌体生长的影响（好氧菌，厌氧菌）（2）影响代谢产物的合成，包括影响组分的变化和产量3、发酵过程的溶氧变化发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过

52、供氧，溶氧明显下降 发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等 发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升 溶氧的控制：搅拌、通气量/ 补料控制营养物质的供给，降低摄氧率/ 调节温度/ 补水/ 液化培养基第九节 二氧化碳的影响及其控制二氧化碳的影响（1）CO2是微生物在生长繁殖过程中的代谢产物，也是某些合成代谢的基质，对微生物生长和发酵具有刺激作用。2）CO2对菌体生长还具有抑制作用，（3）CO2对微生物发酵也有影响。（4）酸碱平衡第十节 补料的作用和控制 一、FBC的作用 补料分批培养(Fed-Batch Culture, FBC)可以控制抑制性底物的浓度 ,可以解除或减弱分解产物阻遏, 可以使发酵过程最佳化FBC的补料方式 有连续流加、不连续流加或多周期流加。每次流加又可分为快速流加，恒速流加，指数速率流加和变速流加。从反应器中发酵体积来分，又有变体积和恒体积之分。从反应器数目分类又有单级和多级之分。从补加培养基的成分来分，又可分为单组分补料和多组分补料。第十一节 泡沫的影响及其控制一、泡沫形成的基本理论泡沫的定义：一般来说：泡沫