专题-序列分析和引物设计

1、序列分析及引物设计专题序列分析及引物设计专题 郭志富郭志富2012年年11月月21日日测序序列测序序列如何确定是否为目的序列？如何去除载体序列？如何转换成有义链？如何找到序列起始和终止位置？一、序列分析部分一、序列分析部分第一步：第一步：BLASTBLAST输入测序序列输入测序序列选择物种选择比对类型去除去除序列中此数字之前的序列，序列中此数字之前的序列，一般前一般前50-80bp要么是载体序列，要么是载体序列，要么是测序不准确的端部要么是测序不准确的端部一般序列较短时，开始比出来一般序列较短时，开始比出来的有可能是载体序列，此时需的有可能是载体序列，此时需在测序序列中去掉比对数字之在测序序列

2、中去掉比对数字之后的序列，也就是去除和载体后的序列，也就是去除和载体序列一致的序列。把目的序列序列一致的序列。把目的序列重新输入进行比对。重新输入进行比对。去除序列中此数字之后的序列，一般为载体序列根据目标序列的方向判定检测序列是否为有义链：根据目标序列的方向判定检测序列是否为有义链：如果检测序列（Query）顺序与目标序列（Sbjct）顺序相反（上边的序列从左到右是递增，下边的目标序列是递减），则检测序列需要进行反转。如顺序相同则可能为有义链，再根据氨基酸翻译情况具体确定。第二步：序列整理与分析第二步：序列整理与分析-DNAman软件的应用软件的应用点击粘贴待分析序列输入”ORIGIN”选择

3、序列后点击载入序列的不同显示类型（互补、反向、反向互补等）去除此部分后保存，即得到反转后的有义链翻译为氨基酸序列有义链翻译后，三个可能的读码框中有义链翻译后，三个可能的读码框中其中有一个为连续的氨基酸序列，即其中有一个为连续的氨基酸序列，即不总出现终止密码子（不总出现终止密码子（*）。这条氨基）。这条氨基酸序列可保存后进行序列分析。酸序列可保存后进行序列分析。如是全长编码区，需要找到起始密码如是全长编码区，需要找到起始密码子子ATG(M)，和终止密码子，和终止密码子TAGTGATAA（*）此图对于设计体外表达引物或此图对于设计体外表达引物或转基因载体构建引物十分重要。转基因载体构建引物十分重要

4、。原则为：设计引物添加酶切位原则为：设计引物添加酶切位点必须是目的基因中没有的酶点必须是目的基因中没有的酶切位点。切位点。多序列比对多序列比对应用：简并引物设计差异位点分析（SNP或氨基酸差异等）进化树的构建保守区保守区DNAMAN1形式形式DNAMAN2形式形式GCG形式形式GDE形式形式选择某区段 57Ux 57Ax1 57Ax2 52Bx7 57Cx 60Dx5 57Kx 57RxConsensusMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASGQLQCERELQE.RELKACQQVMDQQLRDISPKMTKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCERELQE.

5、HSLKACRQVVDQQLRDVSPEMTKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCERELQE.HSLKACRQVVDQQLRDVSPEMAKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCEHELEA.CQQVVDQQLRDVSPGMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASGQLQCERELQE.RELKACQQVMDQQLRDISPKMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASEQLQCERELQELQERELKACQQVMDQQLRDISPEMAKRLVLFAAVVVALVALTIAEGEASGQLQCERELQE.RSLKACRQVMDQQ

6、LRDVSPEMAKRLVLFAAVVVALVALTVAEGEASGQLHCERELQE.RELEACRQIVDQQLRDTSPGmMMMMMMMMAAAAAAkKKKKKKKKrRRRRRRRRlLLLLLLLLvVVVVVVVVlLLLLLLLLfFFFFFFFFAAAAAaAAAAAAAAvVVVVVVVVvVVVVVVVVvVVVVVVVVaAAAAAAAAlLLLLLLLLvVVVVVVVVaAAAAAAAAlLLLLLLLLtTTTTTTTTVVVIVaAAAAAAAAeEEEEEEEEgGGGGGGGGeEEEEEEEEaAAAAAAAAsSSSSSSSSGGGGGEGGqQQQ

7、QQQQQlLLLLLLLLQQQQQQQHcCCCCCCCCeEEEEEEEERRRHRRRReEEEEEEEElLLLLLLLLQQQEQQQQEEEEEEERHHRRRREEEELLLLLLLKKKKKKAAAAAAAcCCCCCCCCQQQQqQQQQQQQQVVVVVVVIMVVVMMMVdDDDDDDDDqQQQQQQQQqQQQQQQQQlLLLLLLLLrRRRRRRRRdDDDDDDDDIVVVIIVsSSSSSSSSpPPPPPPPPEEGEEG 117Ux 117Ax1 117Ax2 112Bx7 117Cx 120Dx5 117Kx 117RxConsensusCHPV

8、VVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSIFWGIPALLKRYYPSVTSPQCQPVGGGPVARQYEQQVVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSILWGIPALLRRYYLSVTSPQCQPVGGGPVARQYEQQVVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSILWGIPALLRRYYLSVTSPQCRPITVSPGTRQYEQQPVVPSKAGSFYPSETTPSQQLQQMIFWGIPALLRRYYPSVTSSQCHPVVVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSIFWGIPALLKRYYPSVTSPQCHPV

9、VVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQRIFWGIPALLKRYYPSVTCPQCHPVVISPIARQYEQQIVVPPKGGSLYPGETTPPQQLQQSIFWGIPTLLRRYYPSVTSSQCRPVAVSPGTGQHEQQTVVPLKGGSFYPDETSPPQQLEQRILWGIPTLLKRYYPSVTSPHcCCCCCCCCHQQRHHHRpPPPPPPPPVVVIVVVVVVVVVVVVIVSGGSSSSSpPPPPPPPPVVVVVIAAAAAAGGGGqQQQQQQQQYYYYYYYeEEEEEEEEqQQQQQQQQqQQQQQQQQIVVI

10、IIvVVVVVVVVvVVVVVVVVpPPPPPPPPPPPPPPkKKKKKKKKGGGAGGGGgGGGGGGGGsSSSSSSSSFFFFFFLFyYYYYYYYYpPPPPPPPPGGGSGGGDeEEEEEEEEtTTTTTTTTTTTTTTTpPPPPPPPPPPPPPPPqQQQQQQQQqQQQQQQQQlLLLLLLLLQQQQQQQEqQQQQQQQQSSSSSiIIIIIIIIFLLFFFFLwWWWWWWWWgGGGGGGGGiIIIIIIIIpPPPPPPPPAAAAAAlLLLLLLLLlLLLLLLLLKRRRKKRKrRRRRRRRRyYYYYYYYYyYY

11、YYYYYYPPPPPPsSSSSSSSSvVVVVVVVVtTTTTTTTTSSSSSSSPPPPPPQQQQQQQH 162Ux 171Ax1 165Ax2 145Bx7 162Cx 159Dx5 141Kx 159RxConsensusQVSYYPGQASPQWSGQGQQPGQGQQSVQGQQGYYSTSPQQ.PGQWQ.QVSYYPGQASSQRPGQGQQPGQGQ.QEYYLTSPQQSGQWQQPGQGQAGYYPTSPQQVSYYPGQASSQRPGQGQQ.EYYLTSPQQSGQWQQPGQGQSGYYPTSPQQGSYYPGQASPQQSGQGQQPGQ.EQQ.P

12、GQGQQD.QQVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQQSVQEQQGYYSTSPQQ.PGQWQ.QVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQ.QGYYPTSPQQ.PGQWQ.QASYYPGQASPQRPGQGQQ.PGQGQ.QGSYYLGQTSLRQPGQAQQPGQGQQPG.QAQQPGQGQQ.PGQRQ.qQQQQQQQQVVVVVsSSSSSSSSyYYYYYYYYyYYYYYYYYPPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQAAAAAAAsSSSSSSSSPPPPPQQQQQQQWRRRRRPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQGGGGGGGA

13、qQQQQQQQQqQQQQQQQQPPPPPPGGGGGGQQQQQQGGGGGQQQQQQQQQQYYYYYYYYYYTTTTTSSSSSPPPPPQQQQQQQQQQQQQQpPPPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQGGGGqQQQQQQQQ 183Ux 192Ax1 186Ax2 166Bx7 183Cx 180Dx5 159Kx 180RxConsensusQPEQGQPEYYPTSLQQPGQLQQSGQEQPGYYPTSPWQPEQLQQSGQKQPGYYPTSPWQPEQLQQPGQRQQGYYPTSPQQPGQGQQPEQGQPGYYPTSLQQPGQLQQPEQ

14、GQQGYYPTSPQQPGQLQQPGPEQQGYYPISPQQPE.QPEKGQQGYYPTTPQQPGQVQqQQQQQQQQPPPPPPEGGGEEGEQQQQQQGEGGEGqQQQQQQQQPPPPEGGGGGGGyYYYYYYYYyYYYYYYYYpPPPPPPPPTTTTTTTSSSSSSSPPPPPPQQQQQQqQQQQQQQQpPPPPPPPPGEEGGGEGQQQQQQQLLLLLVQQQQQQQ 引物设计专题引物设计专题分子生物学实验基础之分子生物学实验基础之生物科学技术学院生物科学技术学院 郭志富郭志富 2011年年11月月8日日简并引物设计简并引物设计：基于保守区

15、设计，用于保守区片段（或中间：基于保守区设计，用于保守区片段（或中间片段）获得片段）获得定量引物设计定量引物设计：用于半定量和实时荧光定量：用于半定量和实时荧光定量PCR标记引物设计标记引物设计：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异物种材料。物种材料。表达引物设计表达引物设计：用于原核体外表达、真核表达（转基因）：用于原核体外表达、真核表达（转基因）SNP引物设计引物设计：用于单核苷酸突变鉴定：用于单核苷酸突变鉴定RACE及染色体步移引物设计及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未：基于已知序列，用于获取未知序列区段知序列区段甲基化引物设计甲基化

16、引物设计：用于检测基因甲基化情况：用于检测基因甲基化情况。 。引物设计分类引物设计分类. .的常规应用的常规应用结合结合激活软件？获取激活码“Ctrl+V”输入序列输入序列也可以把上下游引物分别设在序列的某一特定位置界定产物长度界定引物长度在55-65之间调整简并性引物的设计简并性引物的设计1.基于保守性的简并位置基于保守性的简并位置选择（选择（3端尽量不设置简端尽量不设置简并并）2.用用Primer 5.0检测大致的检测大致的评分（评分（主要看主要看Tm值和发夹值和发夹结构和引物二聚体情况结构和引物二聚体情况）复制复制同源克隆同源克隆-基于不同物种（基于不同物种（范范围较广围较广）相应序列保

17、守区的引）相应序列保守区的引物设计物设计-通过已知序列信息钓通过已知序列信息钓取未知的同源基因取未知的同源基因“Ctrl+V”输入引物序列输入引物序列上游引物上游引物下游引物下游引物简并引物的确定（简并引物的确定（上游上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3如确定该位置为如确定该位置为下游引物下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5表达引物的设计表达引物的设计ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATG

18、CAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC起始起始信号肽编码区N端编码区终止ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA上游引物的设计上游引物的设计添加ATG起始密码子5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3添加酶切位点1. 编码区内不含该位点2. 5端添加保护碱基2-3个（网上有规律表）3. 不能造成下游的移码去除信号肽去除信号肽编码区部分编码区部分1.1.位置必须选择位置必须选择含终

19、止密码子含终止密码子子位置或子位置或终止终止密码子之后密码子之后不远的一部分序列，不远的一部分序列，2.2.记得要是有义链的反向互补链，记得要是有义链的反向互补链，3.3.同样加酶切位点和保护碱基同样加酶切位点和保护碱基下游下游引物引物的设的设计计定量引物的设计定量引物的设计扩增长度：扩增长度：100-300 bp范围即可范围即可以以mRNA为模板进行设计为模板进行设计尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现引物设计避免引物设计避免DNA污染可能带来的干扰，最好跨外显子接头区污染可能带来的干扰，最好跨外显子接头区Tm值在值在58-62度度 内参引物设计：选取持家

20、基因，如内参引物设计：选取持家基因，如18SRNA、actin等等 长度与特异基因有所差异长度与特异基因有所差异设计范围在编码区内界定产物长度在100-300bp应用应用Primer 5.0软件常规应用功能即可软件常规应用功能即可标记引物的设计标记引物的设计（特异性）（特异性）选择非保守区段，特异性的位置设计在选择非保守区段，特异性的位置设计在3末端末端 ；（；（SSR等特征序列的两侧）等特征序列的两侧）特异区段 1014-95%-99%与 15一 样 9423-92%-99% 9722-85%-96%?GATTGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCGAGCTTGATCACC

21、TTTGCTACTTGGATCTGTCGGATAATTCATTGGTTGGCGAGGTACCCAAGAGTTT.TCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGGTTGGTGAGGTACCCGAGAGTTT.TGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTA TTGGGGTTTCCCGGGGGGCCCAAACCCCCCAAATTTCCCCCCCCCAAATT

22、TCCCGGGTTTGGGGGGAAATTTTTTGGGGGGTTGGGAAAGGGCCCTTTTTTGGGAAATTCCCAAACCCCCCTTTTTTTTGGGCCTTTAAACCCTTTTTTGGGGGGAAATTTCCCTTTCCTTTCCCGGGAAATTTAAAAAATTTTTTCCCAAATTTTTTGGGGTTTTTTGGGGGGCCGGGAAAGGGGGGTTTAAACCCCCCCCCAAAAAGGAAAGGGTTTTTTTTT 1984-95%-99%与 15一 样 19123-92%-99% 19422-85%-96%?GATACGGCTCAAGGGTCTCGTCATCG

23、TTGGT.CGTTCACTAGGTATGGTTTTTACGAACATGCCATTGTATGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCGACGATACAGCTCAAGGGGCTCGTCATAGCTGGT.CGTTCACTGGGTACGGCTTCTACTAATATGCCATTGTATGTCAAGAGCAACAGAAGAACACTCGATGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGT.CGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAAGGGAAATTTAAACCCGGGGGCCTTTCCCAAAA

24、AAGGGGGGGGCCCTTTCCCGGCCCCAAATTTCCGGGCCTTTGGGGGGTTTCCCGGGTTTTTCCCAAACCCTTTGGGGGGGGTTTAAATGGGGGGTTTTTTTTAAACCCTTAAAAAACCAAATTTGGGCCCCCCAAATTTTTTGGTTTAAATTTGGGTTTGGAAAAAAGGGCGGGTTAAAAAACCAAAGGGAAAAAAGGGAAAAAACCCAAACCCTTTCCCGGAAA 2024-95%-99%与 15一 样 19523-92%-99% 19822-85%-96%?G.AACG.AACC.AACCAAAAAACCC

25、RACE及染色体步移引物设计及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段：基于已知序列，用于获取未知序列区段RACE引物的设计引物的设计如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计与接头引物与接头引物Tm值相差不宜过大值相差不宜过大产生嵌套引物，位置合理产生嵌套引物，位置合理SNP引物的设计引物的设计何谓何谓SNP？SNP位点设置在位点设置在3最后一个碱基最后一个碱基倒数第三个碱基人为引入突变倒数第三个碱基人为引入突变-保证引物特异性保证引物特异性 414-95%-99%与 15一 样 3423-92%-99% 3722-85%-96%? 435IRI-AY968588 803IRI-AY968589 34516-80