琼脂柱法测定抗真菌药物对皮肤癣菌的

1、琼脂柱法测定抗真菌药物对皮肤癣菌的MIC中华皮肤科杂志 1998年第5期第31卷 技术与方法作者：李少平刘维达王红单位：210042 中国医学科学院中国协和医科大学皮肤 病研究 所李少平(杨森培训计划高级进修医师，现在天津长征医院)刘维达(指导者)王红因抗真菌药物敏感 性测定(MIC)影响因素多而难以标准化，尤其是接种菌的精确定量一直未能解决。最近But ty等 1推荐一种琼脂柱法，我们参照此方法并做了改进，获满意的结果， 现报道如下。一、材料和方法(一)材料：1.菌株：20株受试皮肤癣菌菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。其中 有8株红色毛癣菌为临床新分离株。菌株的鉴定主要依

2、据菌落特征及镜下形态学特点。2.培养基：沙堡氯霉素琼脂(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。3.药物：酮康唑粉由南京第二制药厂提供，批号94037，生产日期1994年4月，含量99.71% 。4.药敏板：直径2cm的24孔Nanclon细胞培养板(丹麦产)，一次性使用或消毒后重复使用。(二)方法：1.挑取纯菌落点种在直径9cm SDA(琼脂含量分别为1%、2%)和PDA平皿的中心，28保湿培养 15天。2.称取6.4mg酮康唑粉，溶于500l二甲基亚砜中作为母液，然后用去离子水按19比例稀 释，再做10级倍比稀释，分别与一定量不同硬度SDA及PDA培养基在50水浴混匀，最终获工 作浓度6.4

3、0.012g/ml。3.取不同稀释度含药琼脂(50)1ml，分别注入细胞培养板的孔洞中，同时做对照(溶媒及空 白对照)。冷凝后用直径0.6cm打孔器在培养板孔内琼脂中央打孔洞。4.同上述方法，用同直径的打孔器在长有菌落的琼脂上打孔，位置约在平皿菌落中心至边缘 距离的外1/3处，将覆有菌落的琼脂柱小心置入培养板孔的等径小洞中。5.接种后的药敏板置28培养，于第3天和第7天观察结果。3天后，对照孔接种的琼脂柱边 可见接种菌呈花冠样毛边生长，其它含药孔若呈此种特征判为阳性，否则判为阴性，其开始 孔浓度即为MIC。培养7天后，菌落直径等于或大于0.8cm(即接种菌生长直径)判为阳性，否 则判为阴性。6

4、.按照Butty等1方法将带菌琼脂柱接种在平皿内含药的琼脂 空洞中，空洞距平皿边缘2cm，彼此相距2cm，余同上。7.将本法所测的MIC与微量稀释法进行比较，探讨琼脂硬度及不同培养基对MIC的影响。二、结果1.不同皮肤癣菌在SDA的琼脂柱上于接种后第7天菌落大小明显不同，在本实验中，若菌落直径1.5cm(如絮状表皮癣菌等)，接种后7天观察结果，其余在3天后观 察(如红色毛癣菌)。2.改良琼脂柱法结果见图1。A和B为须癣毛癣菌，C和D则为犬小孢子菌，A6、B6、C6 、D6为两菌株的空白对照。药物浓度按A5、C5B5、D5A4、C4顺序由0.0 12g/ml倍比增加。须癣毛癣菌和犬小孢子菌的MI

5、C孔分别为B2和D3，即MIC值为1.6 g/ml和0.8g/ml。图1将接种菌琼脂柱接种在含药24孔Manclon板上，7天生长情况(改良法)3.20株皮肤癣菌用两种方法及不同琼脂硬度在体外对酮康唑的敏感性测定结 果见附表。从中可知琼脂柱法测定MIC值一般比微量稀释法高12个稀释度；2% SDA MIC值高于1 % SDA。PDA由于在第7天仍无菌落生长而未能记录。附表20株皮肤癣菌体外对酮康唑敏感性测定结果(MIC，g/ml)菌种菌株方法琼脂硬度琼脂柱法微量稀释法1% SDA2% SDA红色毛癣菌90.128*0.067*0.803*0.108*许兰氏毛癣菌10.100.050.100.0

6、2紫色毛癣菌10.400.100.200.40断发毛癣菌10.800.400.400.80须癣毛癣菌21.60*0.40*0.80*1.60*铁锈色毛癣菌10.200.200.200.20石膏样小孢子菌20.30*0.20*0.30*0.40*犬小孢子菌10.800.200.200.40奥杜盎小孢子菌10.400.200.400.40絮状表皮癣菌10.800.400.800.80均值200.5530.220.3480.531*为均值三、讨论关于丝状真菌的药物敏感性测定，目前常用的方法有琼脂稀释法和液体稀释法，其共同不足 之处 是接种物不易准确定量，分生孢子与菌丝比例不易控制。本文方法的最大优点是在不 改变接种真菌自然生长状态的前题下定量取材，保证菌丝与分生孢子间比例一致，较好地解 决了上述问题。我们对Butty等报道方法1 所做的改进是用24 孔培养板(见图1)代替培养皿作为药敏试验载体，将同一药物浓度不同菌种的传统模 式(纸片法)改为同一菌种不同药物浓