一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究

1、0引言中国肉制品市场管理虽然出台了很多政策和措施，但大多是关于肉品质、掺水、掺淀粉等其他项目的一些检测，关于各种肉质之间的鉴别方面的研究相对较少1。然而市场上却有很多假冒牛肉等现象，比如有人拿病死猪肉内掺入牛油，装入塑料袋里冷冻后就变成了“牛肉卷”，此外还涉及到一些民族的宗教信仰问题(如在清真食品中掺入猪肉、猪油 。目前检测食品和饲料中的动物源成份的方法主要有以显微镜观察为基础的方法；以检测蛋白质为基础的方法；以检测DNA 为基础的方法2。以DNA 为基础的检测方法又分为：核酸探针杂交、PCR-RFLP 分析、DNA 指纹分析和PCR 特异扩增。其中以PCR 特异扩增最为简便、准确、灵敏，在实

2、际应用中最为广泛3-6。杂交探针需要用荧光或放射性物质进行标记；PCR-RFLP 分析法中使用的限制性内切酶对PCR 产物进行酶切分析有诸多不便；指纹分析中DNA 指纹操作难度相对较大，故这三种DNA 检测的方法在实际检测中都较少应用，且鉴别方法繁琐，耗时较长。因此，建立一种简捷、快速、有效的鉴别肉品的方法就显得非常必要了，基金项目：“十一五”国家科技支撑计划“食品凝胶和风味控制技术开发研究”（2006BAD05A03）。第一作者简介：曹黛丽，女，1987年出生，重庆市人，本科生，动物医学专业。通信地址：210095南京市卫岗一号南京农业大学70信箱，E-mail：caodai-li425。收

3、稿日期：2009-06-23，修回日期：2009-07-02。一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究曹黛丽1，陈超1，宋平1，侯京强1，徐幸莲2，杨静静1，杨德吉1（1南京农业大学动物医学院，南京210095，2南京农业大学食品科技学院，南京210095）摘要：建立了基于微卫星标记鉴别牛、猪肉制品的方法。根据微卫星标记种间特异性的特点，从Gen-bank 中筛选出牛微卫星Sign 和猪微卫星标记Sign ，并依据各个微卫星标记的侧翼序列设计引物。提取牛、猪肉各48个样品中的DNA 作为模板，进行PCR 扩增，电泳后得到了各自的目的条带379bp 和585bp ，根据目的条带的出现与否鉴别牛

4、肉和猪肉。该方法进行鉴定灵敏度高，特异性好，而且方法简单，易于操作，结果易于判断。关键词：微卫星标记；PCR ；鉴别；猪肉；牛肉中图分类号：TS251.7文献标识码：A 论文编号：2009-1277A Simple Method for Distinction between Pork andBeef by Molecular Biological TechniqueCao Daili 1, Chen Chao 1, Song Ping 1, Hou Jingqiang 1, Xu Xinglian 2, Yang Jingjing 1, Yang Deji 1(1College of Vet

5、erinaty Medicine, Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095;2College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095Abstract:A method was set up based on microsatellites for distinction between pork and beef. According to the inter-species specificity of the m

6、icrosatellites, some loci of bovine and porcine were selected from Gene bank, named Sign and Sign II, and the primers were designed for each microsatellite according to the flanking sequence. The DNA samples were extracted from 48individuals of cattle and pig for PCR reactions, which prod ucts were

7、used to Electrophoresis. The results show that the target strips were observed which were 379bp and 585bp separatively. These strips can identify which sample from cattle or pig. This method is accurate, specific, quick and simple, and the result is easily judged. Key words:microsatellite, PCR, dist

8、inction, pork, beef 中国农学通报2009,25(18:110-112Chinese Agricultural Science BulletinNNNNNNPPPPPPM379bp 150bp400bp300bp 200bp 100bp而使用特定微卫星位点进行PCR 特异扩增方法进行鉴定就符合这些要求。动物产品中存有基因组DNA ，可以作为检测的靶序列7。该试验根据微卫星的位点特异性特点，筛选牛和猪的特异性微卫星标记，以其侧翼保守序列设计出引物，试图建立一种简便的PCR 技术鉴别肉制品中的牛源性、猪源性成分。1材料与方法1.1样本的采集在市场上随机采集牛和猪肉制品。每种动物采

9、集48个个体样本，总共96个样本。1.2微卫星标记的选取及引物设计根据动物种间特异性、种内品种间无特异性的原则，筛选出了1个牛微卫星标记命名为Sign ，1个猪微卫星标记命名为Sign 。根据Genbank 公布的序列，选择其侧翼保守序列，用PrimerPrimer5.0软件设计引物。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。牛、猪特异性微卫星标记及引物信息详见表1。表1牛、猪特异性微卫星标记及引物信息动物种类牛猪微卫星标记Sign Sign 目的片段长度/bp379585引物序列上游引物下游引物上游引物下游引物5-CAGACATTCAGGAGCCCTTCACA-35TCCAAGGAGGAGTGCT

10、AAAGTGC-35TTGCGCATTCAGATTTAATTGGTTC-35CTGGGACTATGGGAGTGTAAGGAGC-31.3主要试剂血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒、PCRMix 、MARKER （天根生化科技（北京）有限公司，GOLDView DNA 染色(上海赛百盛基因技术有限公司 。1.4仪器PTC-200型PCR 仪（MJ-Research ）、HE-120多功能水平电泳槽（上海天能科学仪器）、GIS-2500全自动凝胶成像分析系统（上海天能科学仪器）、Anke TGL-16B 离心机（上海安亭科学仪器厂）、WH-2微型漩涡混合仪震荡器（上海沪西分析仪器厂）、组织匀

11、浆器。1.5试验方法PCRMix12.5l ，10mmol/L，上、下游引物各1l ，模板DNA 1l ，补水至25l 。2.1牛的特异性微卫星标记Sign 用选取的牛的特异性微卫星标记Sign 分别对牛肉样本和猪肉样本进行了PCR 特异性扩增，产物电泳后得到了如图1所示的结果。此图表明，所有牛肉样本都出现了379bp 的目的条带，所有猪肉样本都没有。图1牛特异性微卫星Sign 电泳结果注：N ：牛；P. 猪；M ：DNA 分子量标准（600bp,500bp,400bp,200bp,100bp ）2.2猪的特异性微卫星标记Sign 用选取的猪的特异性微卫星标记Sign 分别对牛肉样本和猪肉样本

12、进行了PCR 特异性扩增，产物电泳得到了如图2所示的结果。所有猪肉样品都有585bp 条带，而所有牛肉样本中都没有。说明这个特异性微卫星位点只在猪肉样本中存在。通过此微卫星标记可曹黛丽等：一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究·· 111 3讨论试验结果表明，用牛的特异性微卫星标记Sign 能明显鉴别出牛肉，猪肉为阴性；用猪的特异性微卫星标记Sign 能明显鉴别出猪肉，而牛肉则为阴性。主要依据为是否出现相应的目的条带。在对市场上未知牛肉或猪肉的情况下，对这两种肉品能进行鉴定，而且应当把这两种引物同时用于PCR 扩增，综合结果进行分析，以提高分辨的准确性。检测结果不但能确

13、定是否为牛肉，还能判断是否为猪肉。因此这样的结果对于市场上鉴别特别有意义。当然在这两个物种之外的，还需进一步的实验进行研究。 微卫星标记的方法进行肉质鉴别的方法简易、方便、快捷，且特异性高。随机在不同地点、不同时段采集的两组48个样品出现了高度的一致性，可见鉴别结果的可信度高。整个鉴别过程耗时较短，在一个工作日内就能得出结果。检测结果的特异性和敏感性都很高，也适合大批量样本的鉴别。是一种新型的且具有相当市场应用前景的肉品来源鉴别方法。该试验也为其他物种使用特异微卫星位点进行简便鉴定提供了良好的借鉴。但是在位点选择时，要遵循种间特异、种内通用的原则，否则就可能因品种间的差异而出现误差。试验在前期

14、预备时，牛和猪的位点都预备了10个以上，根据预备试验的结果，淘汰了种间特异性差、种内特异性强的位点，确定了以一个牛的位点和一个猪的位点进行平行鉴定的基本方法。至于用多少个位点合适，试验的结果可以在一定程度上说明，猪牛各一个联合应用就可以了。虽然在至更多，以提高种内鉴别的精准性，但对于牛、猪的种间鉴定，如果位点选择合适，各使用一个，累积鉴定效果仍然是可行的，该试验结果两组48个样品都表现出高度的一致性，尽管样本量还不太大。但这样可以省工、省时、省成本。参考文献1潘良文, 陈家华. 食品和饲料中动物源成分的检测方法的进展J.检验检疫科学.2002,12(2:45-61.2陈颖, 吴亚君, 徐宝梁.

15、 进出口动物源性产品中牛羊成分的检测方法J.食品工业科技.2004(8:144-146.3Calvo J H, Rodellar C, Zaragoza P, etal. Beef and bovine-derived material identi-fication in processed and unprocessed food and feed by PCR amplification J.J Agric Food Chem, 2002,50(19:5262-5264. 4Frezza D. A Copetitive Polymerase Chain Reaction-Based Ap

16、-proach for the Identification and Semiquantification of Mitochondri-al DNA in Differently Heat-Treated Bovine Meat and Bone MealJ.Food Protection,2003,66(1:103-109.5Bottero M T, Dalmasso I A, Nucera D, et al. Development of a PCR assay for the detection of animal tissues in ruminant feeds J.J Food

17、Prot,2003, 66(12:2307-2312. 6赵秀玲, 闻伟刚, 余旭平, 等.Chelex-100快速提取动物源饲料DNA 方法的建立J.上海交通大学学报:农业科学版,2004,22(1:82-85.7Krcmar P, Rencova E. Identification of bovine specific DNA in feed stuffs J.JFood Prot., 2001, 64(1:117-119.8管峰, 杨利国, 艾君涛, 等.STR 基因座在奶牛个体识别中的应用J.中国农学通报,2005,21(2:4-6.9凌凤俊, 郑秀芬, 叶健, 等. 牛多态性遗传标记

18、系统性的研究J.中国优生与遗传杂志,2005(139:14-18. 一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究作者：曹黛丽， 陈超， 宋平， 侯京强， 徐幸莲， 杨静静， 杨德吉， Cao Daili， Chen Chao， Song Ping， Hou Jingqiang ， Xu Xinglian， Yang Jingjing， Yang Deji作者单位：曹黛丽,陈超,宋平,侯京强,杨静静,杨德吉,Cao Daili,Chen Chao,Song Ping,Hou Jingqiang,Yang Jingjing,YangDeji(南京农业大学动物医学院,南京,210095， 徐幸莲,Xu

19、 Xinglian(南京农业大学食品科技学院,南京,210095刊名：中国农学通报 英文刊名：CHINESE AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN年，卷(期：2009,25(18被引用次数：2次参考文献(9条1. 潘良文. 陈家华 食品和饲料中动物源成分的检测方法的进展期刊论文-检验检疫科学 2002(022. 陈颖. 吴亚君. 徐宝梁 进出口动物源性产品中牛羊成分的检测方法期刊论文-食品工业科技 2004(083. Calvo J H. Rodellar C. Zaragoza P. etal Beef and bovine-derived material ident

20、i-fication in processed and unprocessed food andfeed by PCR amplification外文期刊 2002(194. Frezza D A Copetitive Polymerase Chain Reaction-Based Approach for the Identification and Semiquantifieation ofMitochondrial DNA in Differently Heat-Treated Bovine Meat and Bone Meal 2003(015. Bottero M T. Dalmas

21、so I A. Nucera D Development of a PCR assay for the detection of animal tissues in ruminant feeds外文期刊2003(126. 赵秀玲. 闻伟刚. 余旭平 Chelex-100快速提取动物源饲料DNA方法的建立期刊论文-上海交通大学学报(农业科学版 2004(017. Krcmar P. Rent . ova E Identification of bovine specific DNA in feed stuffs外文期刊 2001(018. 管峰. 杨利国. 艾君涛 STR基因座在奶牛个体识别中的应用期刊论文-中国农学通报 2005(029. 凌风俊. 郑秀芬. 叶健